毛荷蓮 劉婷

肝癌作為發(fā)病率最高的腫瘤之一,其在中國的發(fā)病率和死亡率一直居高不下［1］。肝硬化以及慢性肝炎感染是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要危險因素,肝癌的發(fā)病率與這些情況密切相關(guān)［2］。由于大多數(shù)肝癌患者診斷于肝功能不全的晚期,所以死亡率和肝癌發(fā)病率大致是相似的［3］。經(jīng)過對肝癌的長期研究,盡管在肝癌患者的治療方面取得了一定進(jìn)展,包括肝切除和肝移植等。但由于肝癌進(jìn)展迅速,且肝癌的早期診斷具有挑戰(zhàn)性,大多數(shù)肝癌患者仍預(yù)后不良［4-6］。因此,提高早期肝癌患者檢出率對于臨床治療肝癌具有重要意義,成為當(dāng)前臨床診治和基礎(chǔ)研究急需解決的難題,其難點在于尋找新的且有效的肝癌分子生物學(xué)標(biāo)志。RASSF1基因在人類癌細(xì)胞的生長和發(fā)展過程中起著重要作用［7］。已有研究表明該基因參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期控制、微管穩(wěn)定性調(diào)節(jié)和腫瘤抑制,且在其他研究中顯示RASSF1 在暴露于E2 后可在各種癌癥中沉默［8-11］。然而,當(dāng)前鮮有對于RASSF1 基因與肝癌臨床指征的相關(guān)性的研究。因此,本文選擇應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中RASSF1表達(dá)量,并分析兩者之間的相關(guān)性。隨后,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將沉默RASSF1 的siRNA、siRNA-NC、分別導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),采用CCK-8 實驗、transwell 細(xì)胞遷移、侵襲實驗檢測各組細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年1 月～2019 年12 月期間本院收錄的154 份肝癌病理組織樣本,所有患者均經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查明確其肝癌診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者初診、手術(shù)之前并未接受任何抗腫瘤治療,包括放療,化療等手段；③臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有家族遺傳性疾病者；②合并其他腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RASSF1 表達(dá)水平的檢測 通過RT-PCR 技術(shù)檢測肝癌組織以及對應(yīng)癌旁組織中RASSF1 表達(dá)量,并對結(jié)果進(jìn)行分析。

實時檢測熒光定量PCR,通過Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,借逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,將提取出的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴增,在PCR 儀中按反應(yīng)條件為 95℃,30 s；95℃,5 s；60℃,30 s,共進(jìn)行40 個反應(yīng)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3 次,取平均值。引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 選取10%胎牛血清、雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)液,將細(xì)胞培養(yǎng)在含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)對數(shù)生長期即可進(jìn)行傳代。使用胰酶消化細(xì)胞后加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,充分離心后棄上清,保留沉淀的細(xì)胞。加入完全培養(yǎng)基后用移液器吹打細(xì)胞使其散開。將單細(xì)胞懸液分別裝入2～3 個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,隨后將其接種于六孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)半數(shù)左右更換Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基。將RASSF1 模擬物、以及無關(guān)對照序列分別稀釋后按比例與Opti-MEM 培養(yǎng)基混勻,而后將lipo2000、質(zhì)粒分別按比例與制好的Opti-MEM 混合液相混,一段時間后,將兩者混勻后靜置,然后將轉(zhuǎn)染液緩慢加入相應(yīng)的孔中。4～6 h 后更換為完全培養(yǎng)基,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8 實驗 常規(guī)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞至對數(shù)生長期,制成單細(xì)胞懸液接種于96 孔板,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h 后,加入CCK-8 反應(yīng)液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～2 h。在酶標(biāo)儀上450 nm 處檢測細(xì)胞的熒光表達(dá)量。

1.2.5 transwell 細(xì)胞遷移實驗 取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞,使用胰酶消化,含1%FBS 的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度。將transwell 小室放置于24 孔板中,先在小室中加入100 μl 單細(xì)胞懸液,在下層24 孔板中加入500 μl 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后取出小室,棄培養(yǎng)基,甲醛固定、結(jié)晶紫染色以及磷酸緩沖液(PBS)清洗小室后,使用倒置顯微鏡下觀察其外層濾膜上的細(xì)胞,隨機選取各小室5 個視野并計數(shù)。

1.2.6 transwell 細(xì)胞侵襲實驗 取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,在transwell 小室上鋪好Matrigel 凝膠并放置于24 孔板中,上室加入單細(xì)胞懸液,下室加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后取出小室,棄培養(yǎng)基,甲醛固定、結(jié)晶紫染色以及PBS 清洗各小室后,將其倒置顯微鏡下觀察其外層濾膜上的細(xì)胞,隨機選取各小室5 個視野并計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RASSF1 基因表達(dá)水平 RASSF1 在肝癌中高表達(dá),且其表達(dá)水平明顯低于癌旁組織。采用RT-PCR技術(shù)對肝癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中RASSF1 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,肝癌組織中RASSF1 表達(dá)水平低于癌旁組織。見圖1A,圖1B。

圖1A RASSF1 基因表達(dá)水平離散圖

圖1B RASSF1 基因表達(dá)水平柱形圖

2.2 RASSF1 基因表達(dá)水平與臨床特征相關(guān)性分析RASSF1 基因表達(dá)水平與肝癌腫瘤大小、病理分級、AJCC 臨床分期相關(guān)(P<0.05),與患者的年齡、性別無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 RASSF1 基因表達(dá)水平與臨床特征相關(guān)性分析(n)

2.3 RASSF1 表達(dá)水平對肝癌患者預(yù)后情況的影響將患者生存時間與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測結(jié)果比對分析,繪制患者的預(yù)后生存曲線。見圖2。結(jié)果顯示,低表達(dá)RASSF1 的肝癌患者預(yù)后較差,而高表達(dá)RASSF1 的肝癌患者普遍預(yù)后較好。表明RASSF1 表達(dá)水平與患者的預(yù)后存在明顯相關(guān)。

圖2 RASSF1 表達(dá)水平對肝癌患者預(yù)后生存曲線

2.4 RASSF1 低表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響 為探究RASSF1 與肝癌的關(guān)系,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默肝癌LM3 細(xì)胞中RASSF1 的siRNA、siRNANC 分別導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi),應(yīng)用CCK-8 實驗、transwell 細(xì)胞遷移、侵襲實驗分別對各類細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力進(jìn)行評估,結(jié)果顯示,低表達(dá)細(xì)胞增殖OD 值為(1.45±0.19),高于對照細(xì)胞的(0.97±0.09),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。遷移實驗中,低表達(dá)細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為(683±45),高于對照細(xì)胞的(384±29),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。侵襲實驗中,低表達(dá)細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為(512±33),高于對照細(xì)胞的(291±12),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。證明低表達(dá)RASSF1 可以促使細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強。

3 討論

原發(fā)性肝癌成為世界上第五大常見肝癌,具有高發(fā)病率的特征［12］。肝炎、脂肪肝和肝纖維化形成,都可能會最終發(fā)展為肝癌［13］。肝癌對于全球人類的健康造成威脅,2015 年,中國新發(fā)現(xiàn)并確診了46.6 萬例肝癌病例,其中有42.2 萬例死亡［14］。由于早期肝癌的檢出率不高,且大多數(shù)肝癌患者預(yù)后不良,使得當(dāng)前有關(guān)尋找新的肝癌相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志的研究受到研究者們的高度重視。

RASSF1 基因最初是在使用XPA 作為誘餌的酵母雙雜交篩選中鑒定的［15］。自從其在3 號染色體(3p21.3)上常見雜合性缺失的最小區(qū)域內(nèi)被發(fā)現(xiàn)以來,作為候選抑癌基因位點受到了廣泛的關(guān)注與研究。研究表明RASSF1 通過與MST1/2、LATS1、Sav1 和Mob1直接相互作用在rhBMP-2 治療中起到關(guān)鍵作用［16］。且RASSF1 高甲基化作為乳腺癌的生物標(biāo)志物可能與癌癥的預(yù)后有關(guān)［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)RASSF1 作為腫瘤抑制基因可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期以此調(diào)控細(xì)胞衰老［10］。雖然RASSF1 被報道能夠在多種癌癥中沉默表達(dá)［8,11］,然而,目前對于RASSF1 與肝癌相關(guān)性的研究鮮有報道。

本研究通過應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測臨床肝癌組織標(biāo)本以及癌旁組織中RASSF1 基因的表達(dá)量,分析該基因的表達(dá)與肝癌臨床相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果顯示,RASSF1 在肝癌組織中表達(dá)下調(diào),且與患者腫瘤大小、病理分級、AJCC 臨床分期有關(guān)。而后本研究從細(xì)胞層面上檢測了肝癌細(xì)胞系與正常肝細(xì)胞中RASSF1 的表達(dá)量,結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞系中其表達(dá)量明顯下降,說明RASSF1 的表達(dá)量對于肝癌的發(fā)生發(fā)展有重要意義。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建低表達(dá)、其對照細(xì)胞系通過CCK-8、transwell 遷移實驗及侵襲實驗檢測了各組細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。結(jié)果表明低表達(dá)RASSF1 可以促使細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強。

綜上所述,RASSF1 具有成為肝癌早期診斷治療的分子生物學(xué)標(biāo)志的潛在價值。然而,對于RASSF1 高表達(dá)抑制肝癌的具體機制尚未明確,需要進(jìn)一步的實驗研究闡明其具體的分子機制。期望后續(xù)工作可以激勵更多同行研究人員尋找用于早期診斷肝癌的分子生物學(xué)標(biāo)志從而為治療提供新的有效的分子靶點。