蔣 冰 丁勝華 張達(dá)莉 羅耀華 李 湘 付復(fù)華
(1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院,湖南 長沙 410125;2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湖南 長沙 410125)
檸檬(Citruslimon(L.) Burm. f.)為屬蕓香科柑橘屬常綠小喬木,主要分布于東南亞、西歐、美國和中國等。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)[1],2020年全球檸檬產(chǎn)量約840萬t,其中鮮銷量645萬t,進(jìn)出口量達(dá)434萬t,加工量186萬t。檸檬富含維生素C、維生素B、核黃素和礦物質(zhì)等,具有預(yù)防癌癥和心血管疾病等多種非傳染性疾病的功效特性[2]。鮮檸檬水分含量較高,不易保藏。干制可以使果蔬保持低水分,防止微生物生長,降低相關(guān)酶活性,實(shí)現(xiàn)長期貯藏[3]。王海鷗等[4]研究了真空凍結(jié)冷凍干燥、冷凍干燥、熱風(fēng)干燥3種方式對(duì)檸檬片干燥特性及品質(zhì)的影響,結(jié)果表明真空凍結(jié)冷凍干燥是高附加值檸檬片的首選干燥方法。杜騰飛等[5]比較了真空遠(yuǎn)紅外干燥、熱風(fēng)干燥和真空冷凍干燥制備檸檬片的相關(guān)品質(zhì),研究表明真空遠(yuǎn)紅外干燥和真空冷凍干燥對(duì)品質(zhì)保留均有良好效果。高煒等[6]采用冷凍干燥、熱風(fēng)干燥、紅外干燥及真空干燥對(duì)檸檬片進(jìn)行干制,探究分析多酚含量及抗氧化能力,結(jié)果表明冷凍干燥處理組與熱風(fēng)干燥處理組檸檬游離態(tài)和總酚含量接近,檸檬中主要酚類物質(zhì)是類黃酮。周琦等[7]研究表明微波功率1.01 kW、真空度72.4 kPa、檸檬片厚度4 mm條件下能較好地保持檸檬干的內(nèi)外品質(zhì)。王忠合等[8]采用超聲波預(yù)處理檸檬片,研究超聲輔助熱風(fēng)干燥的動(dòng)力學(xué),通過多指標(biāo)證明超聲預(yù)處理后熱風(fēng)干燥與空白組和熱燙組相比,干燥速率增加,且能降低干燥過程維生素C的損失。
果蔬風(fēng)味物質(zhì)主要包括揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì),前者決定果蔬特征香氣,并為后者合成提供前體物質(zhì)[9]。前人[10]17-18[11]通過GC-MS分析檸檬中揮發(fā)性物質(zhì)組成,發(fā)現(xiàn)檸檬片中萜烯類化合物占據(jù)主導(dǎo)地位,主要烯烴為D-檸檬烯、萜品烯、β-蒎烯,主要醛類化合物為檸檬醛、壬醛、癸醛、己醛,主要醇類化合物為α-松油醇、橙花醇、4-萜烯醇、芳樟醇、香葉醇,主要酯類化合物為乙酸橙花酯。此外,檸檬果皮中的揮發(fā)性物質(zhì)種類多于果肉中的揮發(fā)性物質(zhì),主要香氣成分源自果皮[12]。氣相—離子遷移譜(GC-IMS)技術(shù)與頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)、電子鼻(E-nose)技術(shù)相比,具有檢測(cè)濃度低、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于多類果蔬的檢測(cè)中[13-15]。然而,利用GC-IMS技術(shù)對(duì)不同干燥方式檸檬片中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析還鮮有報(bào)道。研究擬以尤力克檸檬為原料,采用氣相—離子遷移譜(GC-IMS)結(jié)合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA),研究4種干燥方式對(duì)檸檬揮發(fā)性物質(zhì)的影響,以期為檸檬干制方法的選擇提供參考。
檸檬:尤力克,原產(chǎn)地四川省安岳縣,選擇形狀規(guī)則大小均一,無傷痕和無蟲眼的檸檬作為試驗(yàn)原料。
精密分析天平:BSA124S型,廣州市授科儀器科技有限公司;
風(fēng)味分析儀:FlavourSpec?型,配有Vocal軟件和IMS、NTST數(shù)據(jù)庫,德國G.A.S公司;
多功能切片機(jī):mkd-p-1600a型,北京美科達(dá)科技公司;
冷凍干燥機(jī):LGJ-25C型,北京四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司;
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9053A型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;
紅外烘干箱:SAK-505型,江蘇泰州圣泰科紅外科技有限公司;
真空干燥箱:ZF-6050型,上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。
1.3.1 原料預(yù)處理 選擇質(zhì)量形狀相近的檸檬,清洗表面雜質(zhì)。采用多功能切片機(jī)將檸檬切分成3 mm厚度的切片,選取大小均一、厚度均勻的檸檬片,收集備用。
1.3.2 檸檬片干燥 將4份質(zhì)量相近的檸檬片分別通過4種干燥方式進(jìn)行干燥,終點(diǎn)為檸檬片質(zhì)量達(dá)到恒重。干制方法參照文獻(xiàn)[10]10進(jìn)行修改。
(1) 冷凍干燥(FD):冷阱溫度降至-50 ℃以下,物料溫度降至-30 ℃以下,預(yù)凍24 h,升溫速率保持為4 ℃/2 h,4層凍干面積均為0.25 m2,真空度低于30 Pa。
(2) 熱風(fēng)干燥(AD):溫度恒定60 ℃,風(fēng)速恒定1 m/s,箱容積400 mm×400 mm×300 mm。
(3) 紅外干燥(IRD):溫度恒定60 ℃,風(fēng)速恒定1 m/s,加熱管功率225 W,箱容積400 mm×400 mm×200 mm。
(4) 真空干燥(VD):溫度恒定60 ℃,箱容積415 mm×370 mm×345 mm,真空度保持為1 kPa。
收集干制檸檬片于避光密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 GC-IMS分析條件 將干燥樣品粉碎,稱取0.2 g樣品(鮮檸檬切片,取2 g,含水率90%),置于20 mL頂空瓶中,40 ℃平衡15 min后進(jìn)樣。檢測(cè)條件根據(jù)文獻(xiàn)[13]修改如下:色譜柱MXT-5(15 m×0.53 mm×1 μm),色譜柱溫度60 ℃,IMS溫度45 ℃,進(jìn)樣針溫度65 ℃,載氣/漂移氣均為N2,進(jìn)樣體積200 μL,分析時(shí)間20 min。漂移氣流量150 mL/min;載氣流量,0~2 min時(shí)為2 mL/min,2~20 min時(shí)由2 mL/min逐步提升至100 mL/min。試驗(yàn)重復(fù)3次。
使用GC-IMS儀器配套VOCal軟件查看數(shù)據(jù)的定性和分析譜圖,使用軟件內(nèi)置的IMS數(shù)據(jù)庫和NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)的定性分析;使用Reporter插件進(jìn)行二維和三維譜圖的差異對(duì)比,Gallery Plot插件用于比較揮發(fā)性有機(jī)物含量在不同樣品間的差異,Dynamic PCA 插件則用于主成分分析及其圖表的繪制;利用Origin 2018軟件中的Heat map with dendrogram插件繪制聚類分析熱圖;采用SIMCA 14.1進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA),PLS-DA方法基于同時(shí)分解預(yù)測(cè)量矩陣X和類別矩陣Y提取因子,將因子依據(jù)相關(guān)性從大到小排列,最后通過交互驗(yàn)證確定隱變量個(gè)數(shù),參與回歸建模,是一種經(jīng)典的多類別判別分析方法。
基于GC×IMS文庫5種處理方式的檸檬片均被鑒定出72種揮發(fā)性物質(zhì)(圖1),且檢出成分相同,具體包括20種萜烯類物質(zhì)、16種酯類物質(zhì)、13種醛類物質(zhì)、13種醇類物質(zhì)、7種酮類物質(zhì)、2種酸類物質(zhì)和1種呋喃類物質(zhì)(表1)。此外,5個(gè)處理組樣品中還檢出了12種未被定性的揮發(fā)性物質(zhì)。由圖1可知,在保留時(shí)間為100~600 s時(shí)共出現(xiàn)了61個(gè)信號(hào)峰,主要包括20種萜烯類物質(zhì)、14種酯類物質(zhì)、10種醛類物質(zhì)、9種醇類物質(zhì)、5種酮類物質(zhì)、2種酸類物質(zhì)和1種呋喃類物質(zhì);600~1 200 s時(shí)出現(xiàn)了9個(gè)信號(hào)峰,主要包括2種酯類物質(zhì)、2種醛類物質(zhì)、4種醇類物質(zhì)和1種酮類物質(zhì)。異松油烯、萜品烯、β-蒎烯、乙酸乙酯、壬醛、糠醇、3-羥基-2-丁酮等物質(zhì)在遷移過程中還產(chǎn)生了二聚體或三聚體,其保留指數(shù)與保留時(shí)間非常接近,但遷移時(shí)間不同,新生成的二聚體質(zhì)量大于單體,因此遷移時(shí)間增加[15],生成的二聚體和三聚體信息可二次對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)定性,使定性結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。
表1 檸檬揮發(fā)性物質(zhì)定性結(jié)果?
續(xù)表1
從圖2可直觀看出,不同樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)存在差異,如黃圈中的揮發(fā)性物質(zhì)(α-松油醇)在鮮檸檬中含量較高,而在4種干制檸檬片中的對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性含量均降低;由于糠醛、己醛、β-大馬士酮等物質(zhì)含量在圖中差異較小,因此選取俯視圖和差異圖進(jìn)一步進(jìn)行差異對(duì)比。
由圖3可知,4種干燥方式處理后的樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量之間存在差異,且與鮮檸檬存在明顯差異,如IRD和AD處理中糠醛、己醛的信號(hào)峰紅色相較于其他處理顏色更深,說明此物質(zhì)在IRD和AD處理后的檸檬片中含量更高;IRD和VD處理中β-大馬士酮的信號(hào)峰紅色相較于其他處理顏色更深,說明此物質(zhì)在IRD和VD處理后的檸檬片中含量更高。
由圖4可知,20種萜烯類物質(zhì)(A區(qū)域)在干燥過程中含量變化相對(duì)穩(wěn)定,鮮檸檬和檸檬片均具有柑橘清香,何朝飛等[16]研究表明萜烯類物質(zhì)是柑橘類水果主要的香氣成分。檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯和異松油烯等是柑橘的主要香氣成分,在5種樣品中均有檢出,說明干制不會(huì)影響檸檬片的主要香氣組分[17],其主要香氣成分由基因型決定,與品種相關(guān)[18]。試驗(yàn)選用原料均為尤力克檸檬,各處理后的檸檬片香氣成分一致,離子遷移圖(圖1)也驗(yàn)證了這點(diǎn)。在干燥處理后,檸檬中的主要醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì),包括α-松油醇、芳樟醇、正己醇、3-甲基-1-戊醇、異戊醇、2-甲基-1-丁醇、1-戊烯-3-醇、乙醇和苯乙酸乙酯、丁酸丙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯(B區(qū)域),其含量較鮮檸檬均下降。與其他2種干燥方式相比,IRD和AD處理更好地保留了丁酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯等物質(zhì),這可能是由于冷凍干燥和真空干燥處理均在低真空環(huán)境進(jìn)行干燥,導(dǎo)致酯類物質(zhì)逸出。丁酸乙酯和丙酸乙酯具有甜果香味,乙酸甲酯具有香料氣味,說明IRD和AD處理可保留鮮檸檬中果香味揮發(fā)性物質(zhì)。揮發(fā)性醇主要是由乙醇脫氫酶的作用產(chǎn)生,在高溫條件下相關(guān)酶鈍化或失活,從而造成醇類物質(zhì)的損失[9]。α-松油醇是檸檬烯的降解產(chǎn)物,超過一定含量就會(huì)產(chǎn)生腐敗味[19],鮮檸檬中α-松油醇含量較高,4種干燥方式均顯著降低了其含量,說明干制能抑制檸檬腐敗味的產(chǎn)生,達(dá)到貯藏的目的。與鮮檸檬相比,F(xiàn)D處理后E-2-己烯醛、己醛、香葉醇等物質(zhì)含量上升,香葉醇呈玫瑰和天竺葵香味,是柑橘水果重要的香氣成分;AD處理后γ-丁內(nèi)酯、糠醛、3-甲基-2-丁烯醛、3-羥基-2-丁酮、2-乙?;秽?、糠醇等物質(zhì)含量上升(C區(qū)域),2-乙酰基呋喃和糠醇呈現(xiàn)甜的焦糖風(fēng)味[19],熱風(fēng)干燥后的檸檬片呈現(xiàn)烤制風(fēng)味;IRD處理后苯乙酮、E-2-戊烯醛、庚醛、戊酸等物質(zhì)含量上升,苯乙酮、糠醛、己醛呈烤制香味,說明IRD檸檬片與鮮檸檬相比,烤制香味更為濃郁,可能與紅外加熱有關(guān);VD處理后檸檬醛、β-大馬士酮、癸醛、壬醛、異胡薄荷醇、乙酸異戊酯、癸酸乙酯等物質(zhì)含量上升,檸檬醛是檸檬香氣的主要成分,說明VD可保留部分鮮檸檬香氣成分。己醛、癸醛是鑒定橙皮油的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn),在5種樣品中均檢出[16]。除FD處理外,其余3種干燥后的檸檬片均為橙色,這是因?yàn)樵诩訜徇^程中,水分大量損失,檸檬表皮皺縮,美拉德反應(yīng)使檸檬顏色由黃變橙[20]。鮮檸檬揮發(fā)性物質(zhì)以萜烯類、酯類和醇類為主,干制后的檸檬片揮發(fā)性物質(zhì)以萜烯類、醛類為主。
圖1 不同方式干燥檸檬片的揮發(fā)性物質(zhì)離子遷移譜
圖2 不同方式干燥檸檬片的GC-IMS三維譜圖
紅色代表該物質(zhì)在此樣品中含量比對(duì)照組高,如圖中紅色方框區(qū)域;藍(lán)色代表該物質(zhì)在此樣品中含量比對(duì)照組低,如圖中藍(lán)色方框區(qū)域;顏色越深,說明含量差異越大
A為不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性萜烯類物質(zhì);B為干燥處理后檸檬片含量下降的揮發(fā)性物質(zhì);C為AD處理后檸檬片含量上升的揮發(fā)性物質(zhì);每一列代表同一揮發(fā)性物質(zhì)在不同樣品中的信號(hào)峰,紅色越深,含量越高,數(shù)字編號(hào)的是未鑒別的峰
如圖5所示,PC1和PC2分別為53.6%和19.4%,總和為73%,能夠解釋樣品的總體變異[21]。鮮檸檬單獨(dú)位于第一象限,不同方式干燥檸檬片均位于第二、三象限,AD和IRD處理與鮮檸檬距離較近,可能是因?yàn)闊犸L(fēng)處理相較其他方式對(duì)鮮檸檬中的丁酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸等物質(zhì)保留率較高;AD處理與IRD處理、VD處理較為相似,而與FD處理差異較大,這是由于前3種方式均采用了60 ℃ 熱加工處理,經(jīng)熱干燥處理的樣品風(fēng)味較為接近。通過計(jì)算每兩個(gè)樣本之間的歐幾里得距離,得到不同干燥方式處理的檸檬樣品的最近鄰—?dú)W氏距離圖(見圖6)。結(jié)果表明,5種樣品之間可明顯區(qū)分,IRD處理和AD處理距離最近,相似度最高,因?yàn)閮煞N干燥方式處理后的檸檬片中己醛、糠醛及部分未鑒別物質(zhì)含量均有增加,與指紋譜圖和PCA結(jié)果一致。
圖5 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析
圖6 不同方式干燥檸檬片指紋圖譜的相似度分析
經(jīng)PLS-DA分析,模型的R2X=0.952、R2Y=0.973、Q2=0.912,R2X越接近1表明模型越穩(wěn)定,Q2>0.5表明預(yù)測(cè)率較高。圖7是PLS-DA置換結(jié)果(置換驗(yàn)證次數(shù)200次),右側(cè)是PLS-DA原始值,左側(cè)為PLS-DA模擬值,左側(cè)的R2和Q2均比右側(cè)低,且R2和Q2的回歸斜率大于1,Q2的回歸線截距為負(fù)值,說明該模型穩(wěn)定性良好,具有較好的預(yù)測(cè)能力[22-23]。
圖7 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質(zhì)的PLS-DA擬合曲線
通過GC-IMS指紋圖譜,將不同干燥方式檸檬樣品中的72種揮發(fā)性物質(zhì)基于PLS-DA模型中的變量投影重要性(VIP)將每個(gè)變量的貢獻(xiàn)進(jìn)行量化,篩選VIP值>1的揮發(fā)性物質(zhì)作為潛在的特征性物質(zhì)。如圖8所示,檸檬干燥過程中共有23種可鑒定特征揮發(fā)性物質(zhì)(VIP>1),包括乙醇、丁酸乙酯(D)、乳酸乙酯、α-松油醇、糠醛(D)、β-大馬士酮、芳樟醇、苯乙酮、乙酸乙酯(D)、萜品烯(D)、E-2-乙烯醛(M)、E-2-乙烯醛(D)、檸檬醛、己醛、α-萜品烯(D)、莰烯、α-蒎烯(D)、α-水芹烯(D)、苯乙酸乙酯、壬醛(M)、萜品烯(M)、β-蒎烯(D)、雙戊烯(M)。
圖8 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質(zhì)的VIP值分布
通過模型篩選,依據(jù)VIP值>1的23種揮發(fā)性物質(zhì)的峰值強(qiáng)度繪制聚類熱圖,如圖9所示,每個(gè)處理組3個(gè)平行都聚為一類,平行性良好,處理間可較好區(qū)分;IRD處理和VD處理聚為第Ⅰ類,AD處理和IRD、VD處理聚為第Ⅱ類,F(xiàn)D處理和其他3種處理聚為第Ⅲ類,鮮檸檬與4種檸檬片聚為第Ⅳ類,說明鮮檸檬與4種檸檬片差異最大。利用GC-IMS從檸檬中共檢出20種萜烯類物質(zhì)(表1),經(jīng)PLS-DA,8種萜烯類物質(zhì)是標(biāo)志性揮發(fā)化合物,包括萜品烯(D)、α-萜品烯(D)、莰烯、α-蒎烯(D)、α-水芹烯(D)、萜品烯(M)、β-蒎烯(D)、雙戊烯(D),經(jīng)過4種干燥處理,檸檬片中萜烯類物質(zhì)均有增加(表2),萜烯類物質(zhì)是植物精油的主要成分,具有抑菌效果[15],說明干制可達(dá)到貯藏檸檬的目的;利用GC-IMS從檸檬中共檢出16種酯類物質(zhì)(表1),經(jīng)PLS-DA,4種酯類物質(zhì)是標(biāo)志性揮發(fā)化合物,包括丁酸乙酯(D)、乳酸乙酯、乙酸乙酯(D)、苯乙酸乙酯,經(jīng)過4種干燥處理,檸檬片中酯類物質(zhì)均有減少(表2),但I(xiàn)RD和AD處理對(duì)于酯類物質(zhì)保留效果較好,與指紋譜圖(圖4)結(jié)果一致;利用GC-IMS從檸檬中共檢出13種醛類物質(zhì)(表1),經(jīng)PLS-DA,6種醛類物質(zhì)是標(biāo)志性揮發(fā)化合物,包括糠醛(D)、E-2-乙烯醛(M)、E-2-乙烯醛(D)、檸檬醛、己醛、壬醛(D),醛類物質(zhì)對(duì)檸檬香氣有貢獻(xiàn)作用,總?cè)┖繘Q定檸檬香氣質(zhì)量[24],檸檬醛為呈味物質(zhì),糠醛、己醛、壬醛等醛類物質(zhì)對(duì)檸檬片香氣具有貢獻(xiàn)作用,經(jīng)過4種干燥處理,檸檬片中醛類物質(zhì)均有增加(表2),4種檸檬片的香氣品質(zhì)均得到提升,其中糠醛和己醛呈烤制香味,在IRD和AD處理中含量增加較多,說明這兩種方式干制的檸檬片具有更明顯的烤制香味;利用GC-IMS從檸檬中共檢出13種醇類物質(zhì)(表1),經(jīng)PLS-DA,3種醇類物質(zhì)是標(biāo)志性揮發(fā)化合物,包括乙醇、α-松油醇、芳樟醇,經(jīng)過4種干燥處理,檸檬片中醇類物質(zhì)均有減少(表2),但I(xiàn)RD處理可保留更多的醇類物質(zhì),可能是由于真空環(huán)境會(huì)造成醇類物質(zhì)損失,且熱風(fēng)干燥強(qiáng)度較大時(shí)也會(huì)造成醇類物質(zhì)損失;利用GC-IMS從檸檬中共檢出7種酮類物質(zhì)(表1),經(jīng)PLS-DA,2種酮類物質(zhì)是標(biāo)志性揮發(fā)化合物,包括β-大馬士酮、苯乙酮,經(jīng)過IRD和VD處理后兩種酮類物質(zhì)均增加(表2),β-大馬士酮和苯乙酮均呈現(xiàn)花香味,說明IRD和VD處理賦予了檸檬片更濃郁的花香味。與前面結(jié)果有所不同的是,熱圖顯示IRD與VD處理較為相近,但前兩種處理效果仍與AD處理接近,說明3種處理方式存在共通之處,可能是由于使用了同一干燥溫度。
圖9 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質(zhì)的聚類熱圖
表2 檸檬中標(biāo)志揮發(fā)性成分峰值強(qiáng)度?
采用氣相色譜—離子遷移譜技術(shù)對(duì)比分析了鮮檸檬及4種干燥方式處理的檸檬片樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的差異。5種樣品共檢出并定性了72種揮發(fā)性物質(zhì),包括20種萜烯類物質(zhì)、16種酯類物質(zhì)、13種醛類物質(zhì)、13種醇類物質(zhì)、7種酮類物質(zhì)、2種酸類物質(zhì)和1種呋喃類物質(zhì),其中多對(duì)成分為其單體及二聚體和三聚體,由此構(gòu)建風(fēng)味物質(zhì)遷移指紋圖譜。結(jié)果表明,標(biāo)志揮發(fā)性萜烯類物質(zhì)在干燥過程中較為穩(wěn)定,但酯類和醇類物質(zhì)含量相對(duì)下降,干燥后4種樣品中的醛類物質(zhì)有不同程度的上升;紅外干燥與熱風(fēng)干燥和真空干燥效果的相似度較高,但紅外干燥相對(duì)于其他處理方式效果較好,對(duì)標(biāo)志揮發(fā)性酯類物質(zhì)保留率高于其他處理組11%~27%,同時(shí)標(biāo)志揮發(fā)性醛類物質(zhì)含量增加較多,與鮮檸檬相比增加了53%,對(duì)其風(fēng)味具有積極影響。