劉 為 尹金晶 吳慕慈 楊 寧 何靜仁, 張 瑞

(1. 武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2. 武漢輕工大學硒科學與工程現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學院，湖北 武漢 430023)

硒是人體必需營養(yǎng)素之一，具有抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等生理功能，與人類健康密切相關[1-3]。在自然界中，硒主要以無機硒和有機硒兩種形式存在，植物、動物和微生物等可將無機硒轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C硒，植物中的有機硒主要以游離的硒代氨基酸和硒蛋白中結合態(tài)硒代氨基酸形式存在[4]。研究[5-6]證明，無機硒對機體的安全閾值窄，過量攝入會導致人體中毒，而有機硒毒害低、生物活性強，且比無機硒更易被人體吸收利用。由于人體無法自行合成有機硒，必須依賴外源性膳食攝入，且不同形態(tài)硒在人體內(nèi)的生物學效應和生物利用率差異較大，因此尋找一種靈敏、準確和可靠的檢測方法以確定食物硒化合物的形態(tài)及含量，對進一步評估富硒產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和含硒化合物對人體健康影響具有重要意義。

目前硒形態(tài)檢測的常用方法為高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)和高效液相色譜—氫化物發(fā)生—原子熒光光譜(HPLC-HG-AFS)[7]，其中HPLC-HG-AFS因原理簡單、測試光譜干擾較少、分析時間短、成本較低等諸多優(yōu)點而被廣泛應用[8]。植物樣品中有機硒的提取及硒形態(tài)分析的前處理過程中，酶水解法具有反應條件溫和及可防止物質(zhì)原始形態(tài)轉(zhuǎn)變的優(yōu)點，是當前被廣泛應用的方法，也是硒形態(tài)測定樣品前處理的關鍵過程[9]。目前富硒農(nóng)產(chǎn)品及硒蛋白類營養(yǎng)補充劑層出不窮，總硒含量的測定、硒形態(tài)分析及富硒農(nóng)產(chǎn)品資源的營養(yǎng)評價也日益增多[4]，但有關不同科屬富硒農(nóng)產(chǎn)品的有機硒代氨基酸形態(tài)比較及其在不同溶解性蛋白組分中的分布差異特點研究尚未見報道。因此，研究擬優(yōu)化硒形態(tài)測定前處理和液相色譜分離分析條件，建立一種基于HPLC-HG-AFS的硒代氨基酸測定方法，分析禾谷類和十字花科富硒農(nóng)產(chǎn)品中典型硒代氨基酸形態(tài)含量及其在不同溶解性蛋白組分中的差異化分布特點，旨在為富硒農(nóng)產(chǎn)品不同溶解性蛋白資源進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

富硒西蘭花：深圳福山生物科技有限公司；

富硒大麥苗：湖北吉田有限公司；

富硒大豆：黑龍江新三農(nóng)大豆種植合作社；

富硒玉米：湖北恩施德源健康科技發(fā)展有限公司；

SeCys2、MeSeCys、SeMet標準溶液：中國計量科學研究院；

SeEt標準品：北京百靈威科技有限公司；

蛋白酶E、蛋白酶K：北京索萊寶科技有限公司；

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

檸檬酸、鹽酸、硝酸：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇：色譜純，美國Fisher公司。

1.2 主要儀器與設備

原子熒光光譜儀：AFS-8530型，北京海光儀器有限公司；

微波消解儀：Multiwave PRO型，奧地利安東帕有限公司；

高速冷凍離心機：FC5718R型，奧豪斯儀器(美國)有限公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Syhthesis型，美國Millipore公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-924385-III型，上海新苗器械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 富硒農(nóng)產(chǎn)品前處理 將富硒西蘭花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麥苗4種富硒農(nóng)產(chǎn)品原料于60 ℃烘干，粉碎過80目篩。取干燥粉末，以料液比1∶10 (g/mL)加入正己烷，攪拌提取3 h，重復提取3次，脫脂后置于通風櫥揮干殘余正己烷，獲得脫脂粉末。

1.3.2 富硒農(nóng)產(chǎn)品各級蛋白制備 參照Osbonre[10]的方法，根據(jù)各級蛋白的不同溶解性，從富硒西蘭花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麥苗中依次提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

1.3.3 硒含量測定 參照GB/T 5009.93—2017。

1.3.4 標準溶液配制 分別取硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)標準液和硒代乙硫氨酸(SeEt)標準品，用超純水分別配置成質(zhì)量濃度為1.0 mg Se/mL標準儲備液，混合稀釋成質(zhì)量濃度為5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg Se/L的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.5 樣品前處理 稱取0.1 g樣品，加入3 mL一定濃度的蛋白酶溶液，振蕩搖勻，迅速放入37 ℃恒溫水浴振蕩，酶解提取后，10 000 r/min離心20 min，過0.22 μm濾膜，備用。選用硒含量較高的富硒西蘭花樣品對提取硒形態(tài)的酶解條件進行優(yōu)化，并按式(1)計算提取效率。

(1)

式中：

X——提取效率，%；

A1——樣品中4種有機硒形態(tài)測定值總和，mg/kg；

A0——樣品硒含量，mg/kg。

1.3.6 儀器條件

(1) 液相色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-Aq C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為15 mmol/L 檸檬酸+5 mmol/L 己烷磺酸鈉(含3%甲醇)，流速1.0 mL/min，進樣量100 μL。

(2) 氫化物發(fā)生參數(shù)：載流為10% HCl；還原劑為2.5% KBH4+0.5% NaOH；消解劑為0.15% KI+0.5% KOH；蠕動泵轉(zhuǎn)速40 r/min，開啟紫外燈。

(3) 原子熒光檢測參數(shù)：硒空心陰極燈；燈電流80 mA；負高壓380 V；載氣、屏蔽氣為氬氣；流量分別為300，800 mL/min；原子化高度8 mm。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 每個樣品設置3個平行組，使用SPSS 23 對試驗數(shù)據(jù)進行處理，使用Origin 9.0 作圖。

2 結果與分析

2.1 4種富硒農(nóng)產(chǎn)品的硒含量

富硒西蘭花總硒含量[(154.19±1.37) mg/kg]遠超其他富硒玉米[(3.05±0.17) mg/kg]、富硒大豆[(2.84±0.11) mg/kg]和富硒大麥苗[(1.82±0.14) mg/kg]，根據(jù)作物的總硒含量可知，富硒大豆、富硒玉米、富硒大麥苗均為非聚硒植物(<100 mg/Se kg·DW)，而富硒西蘭花為次級聚硒植物(100～1 000 mg/Se kg·DW)[11-12]。

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 蛋白酶的篩選 由圖1可知，蛋白酶E對硒形態(tài)的提取效果最佳，提取效率可達62.6%，其次是蛋白酶K，提取效率為57.1%；其他蛋白酶的提取效率均低于50%，硒形態(tài)提取效果一般。蛋白酶E和蛋白酶K對硒的提取效率較好，與林樾等[13]的結果相符，這可能是由于蛋白酶K和蛋白酶E是活性廣泛的絲氨酸蛋白酶，無特異性，具有促進酶水解的各種限制性位點和性質(zhì)，可將硒蛋白分解成更小、更短的肽和氨基酸，從而獲得更高提取效率[9,14]。

圖1 酶種類對4種硒形態(tài)提取效果的影響

2.2.2 酶解時間的篩選 由圖2可知，當酶解時間>4 h時，提取效率不再提高，隨著酶解反應的進行反應體系pH會有所下降，同時長時間酶解的外力環(huán)境下SeCys2等硒代氨基酸穩(wěn)定性會受到不同程度的影響，導致含量測定值有所降低[15-16]，故選擇4 h為最適酶解時間。

圖2 酶解時間對4種硒形態(tài)提取效果的影響

2.2.3 加酶方式的篩選 由圖3可知，采用先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h的酶解方式提取效果最好，提取效率可達76.87%，高于單獨使用蛋白酶進行酶解提取，與林樾等[13]的結論相符。故選擇先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h的酶解方式對樣品硒形態(tài)進行提取。

a. 只添加蛋白酶K b. 只添加蛋白酶E c. 先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h d. 先添加蛋白酶K水浴2 h后再添加蛋白酶E水浴2 h e. 同時添加蛋白酶E和蛋白酶K水浴4 h

2.2.4 蛋白酶添加量的篩選 由圖4可知，隨著蛋白酶添加量的增大，樣品中硒形態(tài)提取效率有所提高，當?shù)鞍酌柑砑恿繛?.0%時，硒形態(tài)的提取效率最佳，再繼續(xù)增大蛋白酶用量，樣品中硒形態(tài)提取效率變化不明顯，故選擇蛋白酶添加量為3.0%進行樣品有機硒形態(tài)的提取。

圖4 蛋白酶添加量對4種硒形態(tài)提取效果的影響

2.3 色譜條件優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇 以檸檬酸溶液作為流動相，分別選用PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和ZORBAX SB-Aq C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)進行測試。結果表明，PRP-X100陰離子交換柱只能分離除SeEt以外的3種硒代氨基酸組分，而ZORBAX SB-Aq C18反相色譜柱可以有效分離4種硒代氨基酸組分，因此選用ZORBAX SB-Aq C18柱作為液相分離色譜柱。

2.3.2 流動相條件優(yōu)化

(1) 流動相的選擇：在硒形態(tài)研究中，磷酸鹽溶液和檸檬酸鹽溶液常被用作流動相，使用ZORBAX SB-Aq C18柱，調(diào)整流動相濃度為15 mmol/L。結果顯示，磷酸氫二銨溶液作為流動相時，只能分離出SeCys2、MeSeCys、SeMet 3個組分，而檸檬酸溶液作為流動相時4種硒代氨基酸均可順利出峰，因此選擇檸檬酸溶液進行進一步優(yōu)化。

研究[17]表明，在硒形態(tài)分離時，向流動相中添加一定量離子對試劑可以有效改善分離效果及峰形。由圖5可知，離子對試劑的加入使得4種硒形態(tài)均達到基線分離，當離子對試劑濃度增大時，各有機硒組分的出峰時間及峰形改變并不明顯，綜合考慮出峰情況和色譜柱耐受性，選擇己烷磺酸鈉添加濃度為5 mmol/L。

圖5 己烷磺酸鈉濃度對4種硒形態(tài)分離效果的影響

由圖6可知，未添加甲醇時，SeEt組分出現(xiàn)雙峰及拖尾現(xiàn)象，隨著甲醇的加入，峰形得到明顯改善。當甲醇添加量>3%時，各色譜峰強度及峰形變化較小，且分離度受到影響，綜合分析峰形及出峰時間，選擇甲醇添加量為3%。

圖6 甲醇添加量對4種硒形態(tài)分離效果的影響

(2) 流動相濃度的選擇：使用ZORBAX SB-Aq C18反相色譜柱時，流動相濃度變化對4種硒形態(tài)的分離效果無明顯影響，同時考慮到高鹽含量不利于色譜柱及儀器的保養(yǎng)，選擇15 mmol/L檸檬酸溶液作為流動相。

(3) 流動相pH的選擇：當pH>4.0時，SeCys2和MeSeCys無法實現(xiàn)分離；當pH為3.0～4.0時，隨著pH的增大，各組分出峰時間有所提前(見圖7)，特別是SeEt組分受影響明顯，可以縮短分析時間，故選擇流動相pH為4.0。

圖7 4種硒代氨基酸混合標樣的液相色譜圖(100 μg Se/L)

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線與檢出限 由表1可知，4種硒形態(tài)線性關系良好，R2≥0.999 3，該方法下4種硒代氨基酸檢出限為0.86～2.79 μg/L。

表1 4種硒代氨基酸的線性關系和檢出限

2.4.2 回收率與精密度 由表2可知，富硒西蘭花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麥苗中各硒形態(tài)相對標準偏差值(RSD)均<5%，加標回收率分別為78.5%～104.1%，89.4%～103.7%，76.5%～106.8%，87.3%～103.5%，說明方法的準確性和重復性良好，可以滿足檢測需求。

表2 富硒西蘭花的加標回收率?

2.5 樣品分析

由表3可知，從硒代氨基酸整體來看，富硒西蘭花的球蛋白和谷蛋白組分中均存在SeCys2、SeMet、MeSeCys、SeEt 4種硒代氨基酸，富硒西蘭花清蛋白和醇溶蛋白組分，富硒玉米谷蛋白組分均含有除SeEt以外的其他3種硒代氨基酸，其余硒蛋白組分中則只含兩種或一種硒代氨基酸。

表3 富硒農(nóng)產(chǎn)品各級蛋白組分中4種有機硒形態(tài)含量?

由圖8可知，富硒大豆、富硒玉米和富硒大麥苗不同溶解性蛋白中主要硒代氨基酸為SeMet，SeMet在此3種原料蛋白的硒代氨基酸中占比可達66%以上，其中富硒玉米除谷蛋白有SeCys2和MeSeCys檢出，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白中均只檢出SeMet。SeMet是富硒農(nóng)產(chǎn)品不同溶解性蛋白中均有分布的硒代氨基酸，其普遍存在于富硒植物蛋白這一特點與SeMet代謝吸收途徑密切相關。SeMet在植物中的生物合成途徑與蛋氨酸(Met)十分相似，在Met的合成過程中tRNA對S和Se并無特異性識別，使得SeMet可以直接進入富硒植物蛋白質(zhì)，大豆、玉米、大麥苗這類非聚硒植物蛋白質(zhì)中硒代氨基酸主要以SeMet形式存積[18]。富硒大麥苗蛋白中除了SeMet，還存在著一定比例的SeCys2，但含量較少，可能與大麥苗吸收轉(zhuǎn)換硒的能力有關。

圖8 4種富硒農(nóng)產(chǎn)品各級蛋白中有機硒形態(tài)占比

富硒西蘭花作為十字花科植物中次級聚硒植物，其各級蛋白中硒代氨基酸含量較高。土壤中的硒被植物吸收后經(jīng)過S代謝途徑被還原或轉(zhuǎn)化為SeCys和SeMet，這兩種硒代氨基酸在蛋白質(zhì)中進行非特異性結合，代替了部分Cys和Met參與其中，然而，當硒被過度積累時會致使蛋白質(zhì)的折疊中斷，從而引發(fā)中毒反應，為避免中毒，許多十字花科植物會通過甲基化的方式轉(zhuǎn)變硒的儲存形式，因此西蘭花中存在較高含量的MeSeCys[11,19]。在西蘭花清蛋白和谷蛋白中檢出MeSeCys含量分別為21.53，16.05 mg/kg。研究[20]表明，植物中MeSeCys不進入蛋白質(zhì)而直接存于植物，但此類硒代氨基酸可被提取劑提取出來，因而推測在蛋白質(zhì)提取的同時，西蘭花中大量存在的MeSeCys仍會被溶出，繼而被檢出。

除SeMet外，可直接被結合進入蛋白的SeCys2也在大豆、玉米、大麥苗3種禾谷類植物中有所分布，富硒西蘭花球蛋白和谷蛋白中除SeMet、SeCys2和MeSeCys外，還分布有少量的SeEt。十字花科植物西蘭花和禾谷類植物的硒形態(tài)分布之間存在一定差異，與西蘭花更為復雜、多樣的硒代謝途徑有關，其防中毒機制也在一定程度上豐富了有機硒的存在形式。

3 結論

通過對樣品前處理條件和色譜條件進行優(yōu)化，建立了高效液相色譜—氫化物發(fā)生—原子熒光光譜聯(lián)用測定富硒西蘭花、富硒玉米、富硒大豆、富硒大麥苗中SeMet、SeCys2、MeSeCys、SeEt 4種有機硒形態(tài)的方法。結果表明，該方法操作簡單、重復性好、準確性高、成本低，滿足富硒農(nóng)產(chǎn)品中多種有機硒形態(tài)檢測需要。大豆、玉米、大麥苗3種禾谷類富硒農(nóng)產(chǎn)品蛋白中硒代氨基酸主要以SeMet形式存在，而十字花科的富硒西蘭花蛋白中SeCys2、SeMet和MeSeCys占比較高，且硒代氨基酸在不同蛋白組分中的賦存形式及含量也存在差異。后續(xù)可探究高有機硒蛋白組分的抗氧化活性及功能特性。