辛麗欣，張 欣，殷 博，甄 濤

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010)

枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，在自然環(huán)境中廣泛存在。該菌株是常見的植物內(nèi)生細(xì)菌，主要分布在植物的根和莖部，具有分布范圍廣[1-2]、分離純化簡(jiǎn)單、抗菌活性和抗逆好等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用在黃瓜、玉米等主要經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物上[3-4]，具有較好的生物防治效果。通過響應(yīng)面法獲得枯草芽孢桿菌SW01的最佳培養(yǎng)基配方[5]，顯著提高了芽孢數(shù)量，為生防菌劑的大面積推廣奠定了科學(xué)理論基礎(chǔ)[6-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

菌種：枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)SW01由本驗(yàn)室分離保存。

培養(yǎng)基：葡萄糖1%、牛肉膏0.5%、蛋白胨0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂2%，pH 7.0，121℃滅菌30 min。

試劑：葡萄糖、玉米粉、豆餅粉、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸錳，硫酸銨、碳酸鈣等試劑均為分析純，購自天津化工。

1.2 方法

菌株活化：將-80℃保存的SW01菌株接種到平板培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)24 h。

篩選顯著因子：采用Plackett-Burman方法篩選顯著因子，對(duì)培養(yǎng)基的組分進(jìn)行單因素水平試驗(yàn)，對(duì)影響因子選取高低兩個(gè)水平。

響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方：利用Design8.0簡(jiǎn)體軟件，通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)法，篩選培養(yǎng)基中影響芽孢數(shù)量的顯著因子，結(jié)合響應(yīng)面分析法，確定最佳培養(yǎng)基配方，通過模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化

通過Plackett-Burman法設(shè)計(jì)初始發(fā)酵培養(yǎng)基組分中的9個(gè)影響因子[8]，分別為玉米粉、CaCO3、(NH4)2SO4、葡萄糖、K2HPO4、酵母粉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、豆餅粉，每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，結(jié)果見表1～表3。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析獲得排序，顯著順序?yàn)橛衩追?豆餅粉>葡萄糖>酵母粉>K2HPO4>MgSO4·7H2O>MnSO4>CaCO3>(NH4)2SO4，(NH4)2SO4影響最不顯著。

表1 影響因子與水平Tab.1 Influencing factors and levels

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Test results of Plackett-Burman

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 ANOVA results

2.2 顯著因子的最佳濃度確定

確定3個(gè)顯著因子分別為玉米粉、葡萄糖、豆餅粉，其他條件均為K2HPO40.2%、MgSO4·7H2O0.2%、MnSO40.02%、CaCO30.1%，從而獲得最佳響應(yīng)值。由表4可見，經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析獲得二次多項(xiàng)式方程：

表4 芽孢數(shù)方差分析表Tab.4 Variance analysis table of the number of spores

Y=6.066 7-0.162 5A+0.112 5B+0.15C-1.545 8A2-0.295 8B2-1.170 8C2-0.275 0AB+0.15AC+0.15BC

從響應(yīng)面圖1～圖3中可確定芽孢數(shù)為6.091 58×109cfu/mL；優(yōu)化的原料配比為A=-0.070 7，B=0.232 3，C=0.070 7，即為玉米粉2%，葡萄糖為0.6%，豆餅粉為3%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O0.2%，MnSO40.02%，CaCO30.1%。

圖1 玉米粉與葡萄糖交互作用對(duì)芽孢數(shù)的影響Fig.1 Effect of interaction between corn meal and glucose on the number of spores

圖2 玉米粉與豆餅粉交互作用對(duì)芽孢數(shù)的影響Fig.2 Effect of interaction between corn flour and soybean meal on the number of spores

圖3 葡萄糖與豆餅粉交互作用對(duì)芽孢數(shù)的影響Fig.3 Effect of the interaction of glucose and soybean meal on the number of spores

2.3 模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

為驗(yàn)證結(jié)果有效性，以極值點(diǎn)玉米粉2%、葡萄糖為0.6%、豆餅粉為3%、K2HPO40.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、MnSO40.02%、CaCO30.1%，最大芽孢數(shù)為6.091 58×109cfu/mL，按照上述配比驗(yàn)證結(jié)果為6.125 4±0.28×109cfu/mL，結(jié)果與預(yù)測(cè)值相近，該模型擬合度較好。

3 討論與結(jié)論

在菌劑生產(chǎn)中所需的培養(yǎng)基通常選擇材料價(jià)格低廉、來源廣泛的，因此本實(shí)驗(yàn)中選擇玉米粉、豆餅粉等為培養(yǎng)基，降低生產(chǎn)成本。在枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中，通過改良單一因素或正交實(shí)驗(yàn)確定交互作用，無法準(zhǔn)確地確定顯著因子及最佳條件。通過Plackett-Bruman實(shí)驗(yàn)方法，篩選出影響SW01的顯著因子為玉米粉、葡萄糖和豆餅粉，采用響應(yīng)面分析確定各顯著因素的最佳數(shù)值[9]，獲得SW01最佳培養(yǎng)基配方為：玉米粉2%、葡萄糖為0.6%、豆餅粉3%、K2HPO40.2%、MgSO4·7H2O0.2%、MnSO40.02%、CaCO30.1%，最大芽孢數(shù)為6.09×109cfu/mL。