朱厚榮, 鄭韶爵, 呂金慧, 徐然然, 羅麗娟, 董榮書

(1. 海南大學熱帶作物學院， 海南 ?？?570228； 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所， 海南 海口 571101)

磷(Phosphorus,P)是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，參與了光合作用、能量轉(zhuǎn)換、生物大分子合成等生理生化過程[1]?？扇苄詿o機磷(Pi)是植物可直接從土壤中吸收的主要磷源形式[2]。但是它很容易與土壤中的有機化合物、Al3+,Ca2+,Fe3+等金屬陽離子相互作用形成不能被植物根系直接吸收的難溶性磷，導致土壤有效磷低，從而限制植物生長發(fā)育[3]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通過施用過量磷肥以滿足農(nóng)作物對磷的需求，但是磷肥在當季利用率低[4]。過量的磷肥會造成土壤退化、水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題[5]。因此，研究植物適應低磷脅迫機理并培育磷高效作物品種，對發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要意義。

為適應低磷脅迫環(huán)境，植物在進化過程中形成了一系列機制提高磷吸收和利用能力[6]。水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等植物通過調(diào)控根系形態(tài)，提高根系與土壤的接觸面積，從而增強根系獲取Pi的能力[7-9]。在低磷環(huán)境中，植物還通過調(diào)控有機酸、糖類、核苷酸等代謝物的積累提高對低磷脅迫的適應能力。例如，水稻和大豆在低磷脅迫下根系會合成大量的有機酸，通過根系分泌的有機酸溶解難溶性磷，從而提高土壤磷的利用能力。而且水稻根系分泌的半乳糖醛酸不斷積累，降低了磷酸鹽對土壤膠體的吸附，增加土壤中Pi的有效性[10-11]。此外，在低磷脅迫下，玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)和柱花草(Stylosanthesguianensis)會增強對衰老組織含磷代謝物(如：核苷酸等)的再活化利用，從而提高對有效磷的吸收能力[12-14]。

假地豆(Desmodiumheterocarpon)為豆科山螞蝗屬多年生亞灌木狀草本，主要分布于我國南方各省區(qū)[15]。假地豆根系發(fā)達，對酸性缺磷土壤適應性強，是我國熱帶與亞熱帶地區(qū)重要的豆科牧草和綠肥資源[16-17]。目前國內(nèi)外對假地豆的研究主要集中于生物學特性和藥用價值，然而對其耐缺磷脅迫的潛在機理卻鮮有報道。因此，本研究通過水培試驗條件分析缺磷脅迫對假地豆生長和代謝積累的影響，為解析假地豆耐缺磷脅迫機理提供理論基礎。目的是(1)探索缺磷脅迫下，假地豆的生物量和全磷含量產(chǎn)生哪些變化；(2)明確假地豆的代謝衍生物適應缺磷環(huán)境的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和培養(yǎng)條件

本試驗所用假地豆(Desmodiumheterocarpon)種子(編號：151016001)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所提供。假地豆的水培試驗方法如下：種子萌發(fā)后在1/2 Hoagland營養(yǎng)液預培養(yǎng)15 d。隨后，挑選長勢均一的幼苗分別移至含250 μmol·L-1KH2PO4(+P處理)和0 μmol·L-1KH2PO4(-P處理)的1/2 Hoagland營養(yǎng)液進行正常供磷和缺磷處理。每個處理設置5個生物學重復。分別在處理0 d，5 d，10 d和15 d時收取地上部和根部樣品，用于測定生物量、根系性狀、全磷含量。在15 d時收取所有葉片和根系鮮樣，用液氮速凍后，于-80℃保存用于代謝組學分析。

1.2 試驗方法

1.2.1干重和全磷含量測定 假地豆地上部和根部樣品分別于收獲后，置于烘箱中105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重后稱其干重。樣品烘干粉碎后，稱取0.05 g樣品于灰化瓶中，加入適量濃硫酸和乙醇(5∶95，v/v)混合液浸濕樣品，于馬弗爐中600℃灰化10 h至無色，冷卻后，加入8 mL 100 mmol·L-1HCl充分溶解48 h，參照Murphy和Riley[18]的鉬銻抗顯色法，測定OD700的吸光度值，計算全磷含量。

1.2.2葉片及根系性狀分析 將假地豆整株展開，使用EPSON Expression 12 000 XL根系掃描儀掃描獲取葉片和根系圖像，再利用圖像分析軟件WINRHIZO(Regent Instruments Inc.，Canada)計算根系總根長、根表面積和根體積[19]。

1.2.3代謝組學分析 廣泛靶向代謝組學分析委托深圳華大基因科技服務有限公司參照Chen等[20]的方法進行。檢測代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)為QTRAP 6500 plus(SCIEX,USA)。差異累積代謝物(Differential accumulation metabolites，DAMs)鑒定參考Thévenot等[21]的方法，根據(jù)OPLS-DA模型獲得的變量重要性投影(Variable importance in project，VIP)評分，將VIP ≥1.0，差異倍數(shù)(Fold change，F(xiàn)C) ≥2或≤0.5的代謝物定義為DAMs。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究相關(guān)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進行整理和可視化作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)和標準誤(SE)表示，利用SPSS軟件(V26.0，SPSS Institute，美國)對同一天假地豆不同磷濃度處理(+P和-P)下的指標進行獨立樣本T檢驗，分析其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫對假地豆生長的影響

如圖1所示，從處理第5 d開始，-P條件下假地豆的地上部干重和磷含量顯著低于+P處理，而且隨著處理時間的延長，兩個處理間的差異逐漸增大，在15 d時，-P處理的地上部干重和磷含量分別比+P處理降低39.7%和94.6%，差異極顯著(P<0.001)。第5 d時，根部干重在兩個處理間無顯著差異，但從第10 d開始，-P處理10 d和15 d的根部干重分別比+P處理顯著增加101.5%和61.0%(P<0.001)(圖1 D)。與地上部磷含量類似，-P處理5 d～15 d的根部磷含量均顯著低于+P處理(P<0.001)(圖1 E)。如圖2所示，與+P處理相比，-P處理對根系生長具有促進作用。-P處理5 d～15 d的總根長、根表面積和根體積分別比+P處理顯著增加36.6%～160.5%，22.3%～147.3%和28.1%～118.6%(P<0.001)。

圖1 缺磷脅迫對假地豆干重和磷含量的影響Fig.1 Effects of P deficiency on dry weight and P content of D.heterocarpon注：(A)假地豆在兩個磷處理下的生長表型；(B)地上部干重；(C)地上部磷含量；(D)根部干重；(E)根部磷含量。星號表示t-檢驗-P與+P處理之間差異顯著，*:0.01≤P<0.05,**:0.001≤P<0.01,***:P<0.001，ns表示不顯著。下同Note:(A) Growth phenotypes of D.heterocarpon under two P treatments;(B) Shoot dry weight;(C) P contentin shoot;(D) Root dry weight;(E) P contentin root. The asterisks indicate significant differences between -P and +P according to Student’s t-test,*:0.01≤P<0.05,**:0.001≤P<0.01,***:P<0.001,ns means not significant. The same as below

圖2 缺磷脅迫對假地豆根系生長的影響Fig.2 Effects of P deficiency on root growth of D.heterocarpon注：(A)假地豆在兩個磷處理下的根系形態(tài)；(B)總根長；(C)根表面積；(D)根體積Note:(A) Root morphology of D.heterocarpon under two P treatments;(B) Total root length;(C) Root surface area;(D) Root volume

2.2 假地豆響應低磷脅迫的代謝組學分析

如圖3所示，基于LC-MS/MS的代謝組分析共檢測到假地豆代謝物267種，其中葉片DAMs共79個(上調(diào)42個，下調(diào)37個)；根系DAMs共79個(上調(diào)48個，下調(diào)31個)。

圖3 假地豆葉片(A)和根系(B)響應缺磷脅迫的代謝組學分析Fig.3 Metabolomics response to P deficiency in leaves (A) and roots (B) of D.heterocarpon注：紅圈、綠圈和灰圈分別表示上調(diào)、下調(diào)和不顯著代謝產(chǎn)物Note:Red circles,green circles and gray circles indicate up-regulated,down-regulated,and non significant metabolites,respectively

這些DAMs可被分為類黃酮、萜類、有機酸、氨基酸及其衍生物、苯丙素類、生物堿、酚類、核苷酸及其衍生物、聚酮類、糖及醇類、甾體類和維生素及其衍生物共12類(圖4)。其中，在缺磷脅迫下，檢測到的生物堿、聚酮類和糖及醇類代謝物在假地豆葉片和根系均全部上調(diào)(圖4)。此外，檢測到的有機酸在根系全部上調(diào)(圖4)。

圖4 假地豆響應缺磷脅迫的差異代謝物分類Fig.4 Classification of DAMs in response to P deficiency in D.heterocarpon注：L表示葉片的差異代謝物，R表示根系的差異代謝物。橙色和藍色分別表示上調(diào)和下調(diào)的代謝物。數(shù)字表示該類代謝物個數(shù)Note:L denotes the differential metabolites of leaves,R denotes the differential metabolites of roots. Orange and blue bars indicate up-regulated and down-regulated metabolites,respectively. The number in the bar indicates the number of metabolites in the class

2.3 低磷脅迫導致假地豆的生物堿、聚酮類和糖及醇類顯著積累

如圖5所示，缺磷處理導致假地豆葉片和根系的2種生物堿(蝙蝠葛蘇林堿和大麥芽堿)均顯著上調(diào)。此外，延胡索乙素、蟲草素、槐定堿、葫蘆巴堿這4種生物堿在根系中受低磷脅迫誘導也顯著增加(圖5)。在糖及醇類中，水蘇糖、麥芽糖醇、棉籽糖、葡萄糖醛酸內(nèi)酯4種代謝物在缺磷處理的根系中顯著上調(diào)，而葉片中只有L-亮氨醇受缺磷處理顯著上調(diào)(圖5)。對于聚酮類，缺磷處理使根系中大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷、羥基茜草素和升麻素苷的積累顯著提高，而-P處理的葉片中氧化白藜蘆醇和番瀉苷顯著上調(diào)(圖5)。

圖5 低磷脅迫對假地豆生物堿、聚酮類、糖及醇類積累的影響Fig.5 Effect of P deficiency on the accumulation of alkaloids,polyketides,sugars and alcohols in D.heterocarpon注：紅色和灰色分別表示差異代謝物顯著上調(diào)和不顯著。FC(-P/+P)表示代謝物在-P與+P處理下的差異倍數(shù)。下同Note:Red and grey indicate significantly up-regulated and insignificant differential metabolites,respectively. FC (-P/+P) indicates the ratio of relative levels of metabolites under -P to +P treatment. The same as below

2.4 低磷脅迫導致假地豆的原花青素、槲皮素及其衍生物顯著積累

如圖6所示，缺磷處理使假地豆葉片和根系的槲皮素及其2種衍生物(異槲皮苷和槲皮甙)均顯著上調(diào)。此外，葉片中二氫槲皮素和槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷在缺磷處理條件下積累顯著增加，而根系中槲皮萬壽菊素7-O-葡萄糖苷受低磷條件誘導積累增加(圖6)。此外，葉片中的原花青素B1，B2和B3在缺磷條件下均顯著上調(diào)，而根系中只有原花青素B3受低磷條件誘導含量上升(圖6)。

圖6 低磷脅迫對假地豆原花青素、槲皮素及其衍生物積累的影響Fig.6 Effect of P deficiency on the accumulation of proanthocyanidins,quercetin and their derivatives in D.heterocarpon

2.5 低磷脅迫對假地豆有機酸、核苷酸及其衍生物的影響

如圖7所示，在缺磷處理下，假地豆葉片中馬來酰胺酸、芥子酸和5-氨基乙酰丙酸的積累顯著增加，而羥基酒石酸、單咖啡酰酒石酸和肉桂酸的積累顯著減少；假地豆根系中8種有機酸的含量受缺磷處理誘導顯著上調(diào)，包括馬來酰胺酸、異綠原酸C、苔色酸、京尼平苷酸、檸檬酸、奎寧酸、單咖啡酰酒石酸和肉桂酸。對于核苷酸及其衍生物，缺磷處理導致葉片和根系中2′-脫氧腺苷5′-單磷酸(dAMP)的積累均顯著降低，此外，葉片的肌苷、腺苷、胸苷和尿苷的積累也顯著減少(圖7)。

圖7 低磷脅迫對假地豆有機酸、核苷酸及其衍生物積累的影響Fig.7 Effect of P deficiency on the accumulation of organic acids,nucleotides and their derivatives in D.heterocarpon注：藍色表示差異代謝物顯著下調(diào)Note:Blue indicates significantly down-regulated differential metabolites

3 討論

磷元素參與植物體內(nèi)各種代謝過程，在很大程度上影響著植物生長發(fā)育[22]。前人關(guān)于小麥(Triticumaestivum)、紫花苜蓿和硬皮豆(Macrotylomauniflorum)的研究均顯示，低磷脅迫下植株的生長受到抑制，地上部的生物量和磷含量均顯著降低[23-25]。本試驗與以上研究結(jié)果相似，隨著處理時間的延長，缺磷處理抑制了假地豆地上部的生長，從而顯著降低假地豆的地上部干重和磷含量(圖1)。有研究表明，玉米和菜豆(Phaseolusvulgaris)的磷吸收量與根表面積、根總長度呈顯著正相關(guān)[26-27]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在低磷脅迫下假地豆根部的總根長、根系表面積、根總體積均顯著增加(圖2)。這可能是由于植物通過改變根系形態(tài)提高了對土壤磷素的吸收能力，從而適應缺磷環(huán)境[28]。低磷脅迫下，植物通過大量分配碳水化合物(如糖類和醇類)到根系中，促進根系生長，提高根冠比，從而增加根系與土壤的接觸面積，促進磷的吸收[29]。本試驗代謝組分析表明，缺磷脅迫導致假地豆根系的4種糖及醇類的積累顯著增加，這可能是缺磷脅迫下，假地豆通過分配更多的碳水化合物到根系中，促進根系生長。此外，假地豆還可以作為果樹間作的綠肥，在橡膠(Heveabrasiliensis)和龍眼(Dimocarpuslongan)林下種植假地豆，可以達到改良土壤的效果[30-31]。

在低磷脅迫下，植物根系會增加蘋果酸脫氫酶的表達量，調(diào)控多個轉(zhuǎn)運蛋白(如蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白和檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白等)，促進有機酸合成與分泌，從而活化土壤難溶性磷，釋放出Pi供根系吸收[32-33]。比如柱花草(蘋果酸)[14]、紫花苜蓿(檸檬酸)[34]和菜豆(蘋果酸、檸檬酸)[35]等在低磷脅迫下根系合成和分泌的有機酸積累均有不同程度的增加。本試驗發(fā)現(xiàn)，缺磷脅迫導致假地豆根系8個有機酸的含量顯著積累(圖7)，這可能有助于假地豆對難溶性磷的活化利用。類黃酮和原花青素具有增加抗氧化的能力。已有研究報道，低磷脅迫導致玉米[24]、茶(Camelliasinensis)[36]、大豆[37]等植物體內(nèi)的類黃酮和原花青素的積累顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，缺磷脅迫導致假地豆葉片和根系分別有5種和4種槲皮素及其衍生物增加積累；此外，葉片和根系中的原花青素的含量在低磷脅迫下也有所增加。這些物質(zhì)的積累可能有利于假地豆抵抗由于缺磷脅迫誘發(fā)的氧化損傷，增加假地豆的抗氧化能力。

核苷酸及其衍生物是植物體內(nèi)主要的含磷代謝物類型之一。已有大量的研究表明，植物在低磷脅迫下會增加對核苷酸及其衍生物的再活化利用[38]。如，低磷脅迫導致擬南芥(Arabidopsisthaliana)[39]、大豆[40]、白羽扇豆(Lupinusalbus)[41]等植物體內(nèi)的核苷酸及其衍生物的含量顯著降低。這有可能是因為在低磷脅迫下，負責磷脂水解的磷脂酶C、磷脂酶D和磷脂酸磷酸酶等關(guān)鍵酶的表達量上調(diào)，導致磷脂降解而釋放Pi[42]。本研究中，假地豆葉片和根系的dAMP的含量在缺磷脅迫下顯著降低，很可能是由于假地豆為了緩解磷元素缺乏而對體內(nèi)的核苷酸及其衍生物進行降解以釋放出Pi。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)假地豆的生長受到缺磷脅迫的影響，包括生理和代謝的改變。在缺磷脅迫下，假地豆地上部干重和磷含量顯著降低，但根部的總根長、根系表面積、根總體積均顯著增加。同時，假地豆通過改變根系形態(tài)，增加有機酸、糖類、槲皮素和原花青素的積累，增加對dAMP的再活化利用，從而適應缺磷脅迫。研究結(jié)果為解析假地豆耐缺磷脅迫機制提供了一定的科學依據(jù)。