李莉萍， 李旭漉， 張曉捷， 谷麗麗， 張 博

(西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點實驗室， 新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室， 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

ATP合酶a亞基是由atpA基因編碼的葉綠體蛋白，α亞基構(gòu)象的變化會導(dǎo)致ATP的合成/水解[1]，因此atpA是光合作用不可缺少的基因[2]。目前，葉綠體atpA基因已經(jīng)從一些植物[包括藻類，裸子植物和高等植物，如衣藻(Chlamydomonas)[3]，煙草(Nicotianatabacum)[4]，玉米(Zeamays)[5]，擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]，水稻(Oryzasativa)[7]和黑松(Pinusthunbergii)[8]]中分離出來。由于α亞基在ATP合酶的催化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此研究編碼α亞基的atpA基因在化學(xué)、遺傳學(xué)和酶學(xué)水平下的表達與調(diào)控具有重要意義。

已有研究顯示，atpA基因參與植物的非生物脅迫響應(yīng)。巨芒(Miscanthusgiganteus)在低溫脅迫后，其atpA基因的表達上調(diào)[9]。Asrar等[10]研究表明，積累更多的atpA可能會促進ATP的合成，以滿足植物對持續(xù)耐鹽性的更大能量需求。Suda等人研究發(fā)現(xiàn)ATP合酶基因與植物耐鹽性和植物防御有關(guān)[11-12]?；颐共√幚矸?LycopersiconesculentumMill.)96 h后，顯著誘導(dǎo)了atpA基因表達，表明atpA過量表達可以抵御病害的傷害[13]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)以“牧草之王”著稱，由于其蛋白含量高，被作為家畜飼養(yǎng)的重要原料之一。然而，在苜蓿種植過程中，由于受到土壤、環(huán)境(鹽、堿、干旱和光照)等因素影響，苜蓿產(chǎn)量受限。植物光合作用對于植物的生長至關(guān)重要，是植物生長的基礎(chǔ)和生產(chǎn)力構(gòu)成的主要因素[14]。研究紫花苜蓿葉綠體基因的相關(guān)功能，對紫花苜?？鼓嫘匝芯亢瓦z傳育種尤為重要。

本研究從‘新疆大葉’苜蓿中克隆獲得了atpA的cDNA序列，預(yù)測分析了其理化性質(zhì)、親疏水性、磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、亞細胞定位、蛋白結(jié)構(gòu)以及序列一致性，并對atpA基因在新疆‘大葉’苜蓿的不同組織、不同生育期及不同非生物脅迫下的表達進行了檢測，為進一步明晰atpA基因在植物抗逆響應(yīng)中的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘新疆大葉’苜蓿種子由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室提供。選飽滿種子種植在混合花土中(蛭石∶花土=3∶1)，于人工氣候室25℃恒溫培養(yǎng)，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 MsatpA基因克隆

根據(jù)NCBI中已注冊的‘新疆大葉’苜?；蚪M序列(登錄號：SRR9026569)信息，采用GeneRunner軟件設(shè)計基因克隆引物，上游引物MsatpA-F：ATGGTAACCATTCGTGCAGATG，下游引物MsatpA-R：TCAATTTTTTTCTACTTGTTCC。利用RNAiso Plus(Code No.9108，Takara)提取‘新疆大葉’苜蓿總RNA，使用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1621，Thermo)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行PCR擴增，擴增體系參照說明書。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min 40 s，25個循環(huán)，72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過膠回收產(chǎn)物連接到克隆載體pMDTM18-T Vector Cloning(Code No. 6011，Takara)，菌液PCR檢測后送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

對MsatpA基因進行生物信息學(xué)分析所用軟件名稱及網(wǎng)址如表1所示。

表1 生物信息學(xué)分析所用軟件的信息Table 1 Information of software used for bioinformatics analysis

1.4 MsatpA基因表達模式分析

分別以‘新疆大葉’苜蓿不同組織、不同生育期和不同非生物脅迫后的幼苗為材料，進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。不同組織選取苜蓿的根、莖、葉、花、莢果、種子，不同生育期選取苜蓿的苗期、分枝期、開花期和結(jié)莢期。非生物脅迫處理方法是選取生長至4周齡的幼苗分別進行低溫(4℃)、高溫(40℃)、鹽脅迫(NaCl 250 mM)和滲透脅迫(15% PEG6000)，分別在處理0 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h時采樣，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)MsatpA基因序列，利用NCBI blast primer設(shè)計特異性定量PCR引物(表2)，以紫花苜蓿Actin[15]作為實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因，使用QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit(code No.208052 QIAGEN)說明書配置熒光定量PCR體系，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)，利用Microsoft Excel 2016和Origin 2018軟件處理數(shù)據(jù)和制作圖表，以2-ΔΔCt法計算MsatpA基因的相對表達量，通過SPSS Statistics 23對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

表2 MsatpA基因熒光定量PCR引物序列Table 2 The primer sequence of MsatpA gene qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 MsatpA基因的克隆與序列分析

通過PCR對MsatpA基因進行擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物檢測，結(jié)果顯示片段大小約為1 500 bp(圖1A)，與預(yù)期試驗結(jié)果相符。測序結(jié)果表明，克隆得到的MsatpA基因編碼區(qū)包含1 533 bp，編碼510個氨基酸(圖1B)。由Conserved Domains-NCBI對蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析：MsAtpA在第23～507氨基酸之間含有ATP合酶CF1α亞基結(jié)合位點，屬于atpA superfamily家族(圖1C)。

圖1 ‘新疆大葉’苜蓿MsatpA基因PCR擴增產(chǎn)物(A)，氨基酸序列(B)，保守結(jié)構(gòu)域(C)Fig.1 PCR amplification product of MsatpA (A) of Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’,amino acid sequence (B),and the conserved domains (C)注：圖A中M為DL2000；1為MsatpA PCR擴增片段Note:M in panel A,DL2000;1 in panel A PCR product of MsatpA

2.2 MsatpA基因編碼蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析

通過Protparam分析其理化性質(zhì)，推測MsAtpA蛋白的分子式為C2465H4020N674O765S11氨基酸數(shù)量為510，其相對分子質(zhì)量為55.71 KD，等電點(Isoelectric point，pI)為5.22，不穩(wěn)定系數(shù)為32.33，平均疏水性為-0.047，表明MsAtpA蛋白為穩(wěn)定性親水蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)預(yù)測各種氨基酸占比分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，MsAtpA蛋白中含量較多的氨基酸是亮氨酸(Leu)，占10%。

表3 MsAtpA氨基酸組成分析Table 3 Amino acid composition analysis of MsAtpA

2.3 MsatpA基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)分析

運用SOPMA軟件分析‘新疆大葉’苜蓿MsatpA基因編碼的蛋白產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)，MsAtpA蛋白二級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋(43.92%)、無規(guī)則卷曲(29.02%)、延伸鏈(18.24%)和β-轉(zhuǎn)角(8.82%) (圖2A)。MsAtpA蛋白產(chǎn)物三級結(jié)構(gòu)使用Swiss-Model Workspace建模預(yù)測(圖2B)，其與真核藻類植物萊茵衣藻的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(圖2C)相似。

圖2 MsAtpA二級結(jié)構(gòu)(A)，MsAtpA三級結(jié)構(gòu)(B)，CrAtpA三級結(jié)構(gòu)(C)Fig.2 Secondary structure of MsAtpA (A),Tertiary structure of MsAtpA (B),and Tertiary structure of CrAtpA (C)注：A.‘新疆大葉’苜蓿AtpA二級結(jié)構(gòu)圖；B.新疆大葉苜蓿AtpA(MsAtpA)三級結(jié)構(gòu)圖；C.萊茵衣藻AtpA(CrAtpA)三級結(jié)構(gòu)圖Note:A. Secondary structure diagram of AtpA in Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’;B. Tertiary structure of AtpA in Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’ (MsAtpA);C. Tertiary structure of AtpA in Chlamydomonas reinhardtii (CrAtpA)

2.4 MsatpA基因編碼蛋白質(zhì)的磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)、親/疏水性、信號肽及亞細胞定位預(yù)測分析

使用NetPhos預(yù)測MsAtpA蛋白的磷酸化位點(圖3A)。分析結(jié)果顯示，該蛋白含有絲氨酸(Ser)位點23個、蘇氨酸(Thr)位點13個和酪氨酸(Tyr)位點2個，表明該蛋白發(fā)生磷酸化時主要以絲氨酸磷酸化為主。采用TMHMM Server 2.0進行預(yù)測分析，結(jié)果表明MsAtpA跨膜螺旋線數(shù)為0，MsAtpA蛋白的1～510位氨基酸都位于細胞膜表面(圖3B)，因此預(yù)測MsAtpA蛋白無跨膜轉(zhuǎn)運信號，不是膜上受體。利用ProtScale軟件分析MsAtpA蛋白質(zhì)的親水性和疏水性(圖3C)，結(jié)果表明第196位酪氨酸的疏水性最強，預(yù)測值為2.689，第470位脯氨酸的親水性最強，預(yù)測值為-2.411。因此推測MsAtpA蛋白屬于親水性蛋白。信號肽是用于蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的短肽鏈。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，MsatpA基因編碼的蛋白無信號肽(圖3D)，說明MsAtpA蛋白屬于非分泌性蛋白。利用Cell-PLoc對MsAtpA蛋白亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示MsAtpA蛋白定位于葉綠體中。

圖3 新疆大葉苜蓿MsAtpA磷酸化分析(A)，跨膜結(jié)構(gòu)域(B)，親/疏水性(C)及信號肽分析(D)Fig.3 Phosphorylation analysis of Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’ MsAtpA (A),transmembrane structure (B),hydrophilicity analysis (C),and signal peptide analysis (D)

2.5 MsatpA基因編碼氨基酸序列同源性比對分析

在NCBI Blastp中對atpA基因編碼的蛋白序列進行同源性檢索，獲取了多個物種的AtpA蛋白序列，包括黃花苜蓿(YP_009327942.1)、蒺藜苜蓿(YP_001381721.1)、鷹嘴豆(YP_002149740.1)、車軸草(YP_009027189.1)、花生(YP_009472162.1)、大豆(YP_007516887.1)、菜豆(YP_001122813.1)、玉米(NP_043022.1)、水稻(NP_039380.1)、地錢(NP_039282.1)、萊茵衣藻(NP_958406.1)、擬南芥(NP_051044.1)、白菜(ASY93521.1)、甘藍(YP_009564560.1)、陸地棉(YP_538920.1)、可可(YP_004021302.1)、木薯(YP_001718422.1)、蓖麻(YP_005090163.1)、煙草(CAA23471.1)、番茄(YP_008563073.1)、馬鈴薯(YP_009915959.1)。利用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)，通過NCBI Batch CDD預(yù)測不同物種間基因的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明MsAtpA蛋白與同為豆科苜蓿屬的黃花苜蓿(YP_009327942.1)、蒺藜苜蓿(YP_001381721.1)有著較高的同源性，說明‘新疆大葉’苜蓿與它們在進化關(guān)系上最為相近。蛋白序列比對結(jié)果顯示，‘新疆大葉’苜蓿MsAtpA與黃花苜蓿的一致性高達99.80%，僅在第264位氨基酸存在差異位點，與蒺藜苜蓿的一致性為98.24%，與同科植物鷹嘴豆一致性達到98.43%，與其他豆科植物也有著較高的一致性。不同物種的atpA基因都含有ATP合酶α亞基結(jié)合位點(圖4)，表明了atpA基因在不同物種間有著高保守性。

圖4 AtpA蛋白進化樹分析Fig.4 Evolutionary tree analysis of AtpA proteins注：AtpA蛋白在不同物種中的進化關(guān)系：黃花苜蓿，‘新疆大葉’苜蓿，蒺藜苜蓿，鷹嘴豆，車軸草，花生，大豆，菜豆，玉米，水稻，地錢，萊茵衣藻，擬南芥，白菜，甘藍，陸地棉，可可，木薯，蓖麻，煙草，番茄，馬鈴薯Note:Evolutionary relationship of AtpA protein in different species:Medicago falcata,Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’,Medicago truncatula,Cicer arietinum,Trifolium subterraneum,Arachis hypogaea,Glycine max,Phaseolus vulgaris,Zea mays,Oryza sativa,Marchantia paleacea,Chlamydomonas reinhardtii,Arabidopsis thaliana,Brassica pekinensis,Brassica oleracea,Gossypium hirsutum,Theobroma cacao,Manihot esculenta,Ricinus communis,Nicotiana tabacum,Solanum lycopersicum,Solanum tuberosum

2.6 MsatpA基因的表達模式分析

實時熒光定量表達分析結(jié)果顯示，MsatpA基因在‘新疆大葉’苜蓿不同組織中的表達量不同(圖5A)，在葉中的相對表達量最高，其次是莖、莢果、種子和花，在根中表達量最少。不同生育期基因的表達模式分析結(jié)果顯示(圖5B)，MsatpA基因在開花期的表達量最低，結(jié)莢期的表達量顯著增高，是分枝期的22.8倍，是苗期的53.7倍，是開花期的103.7倍。低溫處理MsatpA基因表達量顯著上調(diào)，處理24 h時表達量最高(圖6A)，是對照的6.6倍?！陆笕~’苜蓿在受到高溫脅迫后MsatpA基因的表達量均低于0 h，在24 h達到最低(圖6B)。在250 mM NaCl處理下MsatpA基因表達量呈現(xiàn)先降低再升高又急劇下降的趨勢(圖6C)。15% PEG6000處理后，MsatpA基因顯著上調(diào)，基因表達量在24 h達到最高(圖6D)，是對照的3.4倍。以上試驗結(jié)果表明，MsatpA基因的表達受不同逆境脅迫條件的影響呈現(xiàn)出不同的表達特點。

圖5 MsatpA的組織特異性及在不同發(fā)育期的表達模式Fig.5 Issue-specific and expression pattern of MsatpA in different fertility stages注：不同小寫字母分別代表在0.05水平差異顯著，下同Note:Different lowercase letters represent significant differences at the 0.05 level,the same as below

圖6 MsatpA在非生物脅迫處理下的表達模式Fig.6 Expression patterns of MsatpA gene under different abiotic stresses注：A.低溫脅迫(4℃)處理MsatpA基因的表達量；B.高溫脅迫(40℃)處理MsatpA基因的表達量；C.鹽脅迫(250 mM NaCl)處理MsatpA基因的表達量；D.滲透脅迫(15% PEG6000)處理MsatpA基因的表達量Note:A. Expression of MsatpA gene under cold stress (4℃);B. Expression of MsatpA gene under hot stress (40℃);C. Expression of MsatpA gene under the salt stress (250 mM NaCl);D. Expression of MsatpA gene under osmotic stress (15% PEG6000)

3 討論

ATP合酶a亞基是由atpA基因編碼的葉綠體蛋白，α亞基位于ATP合酶CF1上與ATP-β亞基構(gòu)成旋轉(zhuǎn)馬達的圓柱體，α-β界面是ATP水解或合成的催化中心，α亞基具有調(diào)節(jié)性[1]。本研究從‘新疆大葉’苜蓿中克隆獲得了1 533 bp核苷酸序列，編碼510個氨基酸，通過蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)其是一種穩(wěn)定的親水蛋白，其中α螺旋占主要部分。沒有發(fā)現(xiàn)強信號肽序列，表明AtpA不能從葉綠體轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，這與Shao等[2]在甘薯中對atpA的研究結(jié)果一致。蛋白激酶和蛋白磷酸化位點參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，‘川草2號’老芒麥(ElymussibiricusL.)AtpA的序列中存在多處蛋白激酶和酪蛋白激酶磷酸化位點，推測atpA可能在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起作用[16]。這與本研究結(jié)果相似，MsAtpA蛋白也含有多個Ser，Thr和Tyr磷酸化位點。蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)在其二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上依靠氨基酸側(cè)鏈之間的分子作用力進一步盤繞、折疊所形成的天然構(gòu)象，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)[17]。萊茵衣藻是細胞研究中的模式植物，其作為分子生物學(xué)研究工具多用于研究細胞核和葉綠體轉(zhuǎn)化及光合作用等機制[18]，本研究中MsAtpA的三級結(jié)構(gòu)與萊茵衣藻的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型相似，表明AtpA在這兩種植物中可能具有相似的功能。AtpA蛋白在不同物種間具有較高的保守性，突變率低，同科植物的同源性高。高家翔等[19]對早園竹(PhyllostachyspropinquaMcClure)葉綠體atpA基因序列的研究也表明該基因與同科植物具有較高的保守性，這與本研究結(jié)論相似。

許多研究表明atpA基因在植物不同組織中表達量不同。銀杏(GinkgobilobaL.)葉中GbatpA的轉(zhuǎn)錄物的水平明顯高于莖，在根和果實中未檢測到轉(zhuǎn)錄物積累[20]。甘薯(IpomoeabatatasL.)中IbatpA基因在幼葉中的相對表達量高于成熟葉、莖和塊根的基因表達量[2]。擬南芥atpA基因在莢果中表達量最高，除根以外的各個組織都有所表達，存在明顯的組織特異性[21]。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，說明atpA基因的表達在不同植物中有一定的相似性和差異性，MsatpA基因在不同發(fā)育時期的表達模式也表明了atpA基因在植物的不同生長發(fā)育過程中也可能具有不同的調(diào)控功能。

非生物脅迫在不同程度上影響植物的生長發(fā)育，導(dǎo)致植物生長遲緩、減產(chǎn)甚至死亡，植物進化出多種調(diào)控機制來適應(yīng)不斷變化的環(huán)境[22]。atpA基因在抵御逆境環(huán)境脅迫中的應(yīng)答已有多篇文獻報道，擬南芥atpA基因在受到冷脅迫誘導(dǎo)后相對表達量顯著上調(diào)，可能參與擬南芥CBFs冷調(diào)控通路，對atpA突變體冷脅迫后清除活性氧相關(guān)基因會顯著上調(diào)，預(yù)測atpA基因可能負調(diào)節(jié)清除活性氧相關(guān)基因[21]。何興文等[16]研究發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫時‘川草2號’老芒麥atpA基因轉(zhuǎn)錄受到影響，可能會影響ATP合酶的活性以及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。對羽穗草(DesmostachyabipinnataL.)進行不同鹽濃度脅迫處理后葉綠體蛋白AtpA的表達在不同鹽濃度處理下發(fā)生改變[10]。胡楊(Populuseuphratica)atpA基因在高溫條件下會做出熱激響應(yīng)[23]。葉綠體是光合作用的場所，也是眾多反應(yīng)代謝的場所，葉綠體內(nèi)的代謝平衡較為脆弱，輕微脅迫刺激就會使其做出響應(yīng)，本研究中MsatpA基因的表達也受不同非生物脅迫誘導(dǎo)，表明該基因在紫花苜蓿中也參與脅迫應(yīng)激調(diào)控。

植物抗逆基因功能的研究有助于了解植物在脅迫條件下的抗逆機制。近年來，越來越多的研究者對苜?？鼓嫦嚓P(guān)基因進行了克隆和表達分析研究[24-26]，已有研究報道atpA基因參與抗病[13]、抗鹽[10]及抗冷[22]脅迫響應(yīng)。此外，atpA基因編碼ATP合酶的α亞基，參與植物的能量代謝過程，影響植物的光合作用，在進化方面相對保守。本研究克隆了紫花苜蓿葉綠體atpA基因，并對基因表達模式進行了初步分析，這為后期atpA基因在能量代謝及抗逆性方面的功能研究奠定了基礎(chǔ)，也為苜蓿遺傳育種提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從紫花苜蓿中克隆得到了MsatpA基因序列，對其進行了生物信息學(xué)分析和基因表達模式分析，初步確定MsatpA基因在紫花苜蓿中參與不同非生物脅迫應(yīng)答，為后續(xù)深入探究atpA基因在苜蓿中的功能奠定了基礎(chǔ)。