鄒曉燕， 王林杰， 黃 杰， 羅麗娟， 劉國道， 陳志堅,*

(1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228； 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 海南 ?？?571101)

金屬元素鐵、錳、銅和鋅等，是植物生長所必需的微量營養(yǎng)元素，它們在植物生長發(fā)育過程中起重要作用。微量元素缺乏會影響植物代謝酶活性，導(dǎo)致葉片失綠和植株矮小等現(xiàn)象[1]。然而，金屬元素的過量積累也會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成代謝紊亂[2]。另外，過量的金屬元素可能會通過食物鏈進入人體，影響人類健康。因此，微量營養(yǎng)元素的過量與缺失均會降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的問題。

植物可以通過多種金屬轉(zhuǎn)運蛋白來調(diào)節(jié)養(yǎng)分的吸收、轉(zhuǎn)運和分配，從而維持細(xì)胞礦質(zhì)營養(yǎng)平衡[3]。其中，植物天然抗性相關(guān)巨噬蛋白(Nramp)是一類具有保守結(jié)構(gòu)和功能的大家族蛋白，參與了多種金屬離子的吸收和轉(zhuǎn)運，如錳、鐵、鎘和鋁等金屬離子[4]。研究人員首次在小鼠中克隆了Nramp蛋白[5]，隨后在細(xì)菌、動物和植物中也相繼報道了Nramp同源蛋白的生物學(xué)功能。據(jù)報道，擬南芥(Arabidopsisthaliana)包含有6個Nramp蛋白成員，其中，AtNramp1定位于質(zhì)膜和胞內(nèi)囊泡，參與了細(xì)胞錳離子的轉(zhuǎn)運及維持鐵離子的穩(wěn)態(tài)[6]。AtNramp2定位于高爾基體，具有調(diào)控錳離子再分配的功能[7]。AtNramp3和AtNramp4定位于液泡膜，分別參與了錳和鐵離子的轉(zhuǎn)運[8]，而AtNramp6定位在囊泡，具有轉(zhuǎn)運鎘的功能[9]。在水稻(Oryzasativa)中，7個Nramp蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)膜上[10-11]。OsNramp1主要在根中表達，參與水稻鐵、鎘和砷的轉(zhuǎn)運[12-13]。OsNramp3主要在莖節(jié)維管束中表達，是地上部錳分配的重要調(diào)節(jié)因子[11,14]。OsNramp4是水稻根系吸收鋁離子的轉(zhuǎn)運蛋白[15]。OsNramp5主要在根中表達，主要參與了水稻對錳和鎘的吸收[10,16]，而OsNramp6主要在幼葉中表達，參與了鐵、錳和鎘的轉(zhuǎn)運[17]。因此，Nramp蛋白成員具有運輸金屬離子的保守功能。

柱花草(Stylosanthesguianensis)是豆科蝶形花亞科的一個屬，大多數(shù)種起源于巴西和哥倫比亞等熱帶國家和地區(qū)。柱花草因其適應(yīng)性強，產(chǎn)量高，在世界熱帶地區(qū)被廣泛用作牧草飼料喂養(yǎng)牲畜，并用于豆科綠肥和林果草生態(tài)工程建設(shè)等[18]。柱花草對土壤缺磷脅迫、鋁和錳金屬元素毒害表現(xiàn)出良好的耐受性，已成為熱帶牧草生理生態(tài)研究的重要植物之一。以往研究主要從生理和代謝途徑等方面探索了柱花草適應(yīng)元素脅迫的機理[19-21]，對柱花草金屬轉(zhuǎn)運蛋白的克隆及表達分析的研究未見報道。因此，本研究克隆了柱花草Nramp家族成員SgNramp1和SgNramp2基因，并對其進行了生物信息學(xué)和基因表達分析，旨在為后續(xù)深入分析柱花草SgNramp家族基因的生物學(xué)功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用試驗材料為‘熱研5號’圭亞那柱花草(Stylosanthesguianensis)，種子保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室。

1.2 試驗方法

1.2.1柱花草培養(yǎng)及處理 參考賈怡丹等(2020)方法[22]，將萌發(fā)3 d后的柱花草幼苗轉(zhuǎn)移至Hoagland營養(yǎng)液(pH5.8)中進行培養(yǎng)，營養(yǎng)液包含1 500 μmol·L-1KNO3，400 μmol·L-1NH4NO3，300 μmol·L-1(NH4)2SO4，0.16 μmol·L-1(NH4)5MoO24·4H2O，1 200 μmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，250 μmol·L-1KH2PO4，25 μmol·L-1MgCl2·6H2O，500 μmol·L-1MgSO4·7H2O，300 μmol·L-1K2SO4，1.5 μmol·L-1MnSO4·H2O，1.5 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.5 μmol·L-1CuSO4·5H20，40 μmol·L-1Fe-EDTA(Na)和2.5 μmol·L-1NaB4O7·10H2O。柱花草正常培養(yǎng)14 d后，分別進行以下處理：缺錳(-Mn)，缺鐵(-Fe)，缺銅(-Cu)和缺鋅(-Zn)處理，以全營養(yǎng)液為對照處理，處理液pH為5.8；過量錳(400 μmol·L-1Mn)，鐵(800 μmol·L-1Fe)，銅(10 μmol·L-1Cu)和鋅(20 μmol·L-1Zn)處理，以全營養(yǎng)液為對照處理，處理液pH為5.0。每個處理設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)，處理期間每隔7 d更換一次營養(yǎng)液。處理14 d后，收獲植株樣品，用于RNA提取及基因表達分析。另外，柱花草在含有0(CK)，100 μmol·L-1AlCl3，40 μmol·L-1CdCl2和20 μmol·L-1LaCl2的500 μmol·L-1CaCl2溶液(pH4.5)中處理24 h后，收獲根系樣品，用于RNA提取及基因表達分析。

1.2.2RNA提取和cDNA合成 參照黃杰等[23]方法提取柱花草RNA。稱取0.1 g樣品，加入1 mL TRIzol提取液，充分研磨，4℃下12 000 rpm離心3 min，吸上清至新離心管中。加入氯化鈉(5 mol·L-1)和2/3體積氯仿，充分混勻。4℃下12 000 rpm離心10 min，取上清至新離心管中，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min。4℃下12 000 rpm離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75%乙醇。4℃下7 500 rpm離心2 min，棄上清，加入1 mL無水乙醇。4℃下7 500 rpm離心2 min，棄上清，風(fēng)干沉淀，加入無RNase ddH2O溶解RNA。cDNA合成參考HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesie Kit試劑盒(Vazyme，中國)方法。反應(yīng)體系及程序為：加入5 μL RNase ddH2O，3 μL Total RNA，65℃反應(yīng)5 min，迅速置于冰上；加入2 μL 5×gDNA wiper Mix，充分混勻，42℃反應(yīng)2 min；加入2 μL 10×RT Mix，2 μL HiScript III Enzyme Mix，1 μL Oligo(dT)20，5 μL RNase ddH2O，充分混勻后，25℃反應(yīng)5 min，37℃反應(yīng)45 min，85℃反應(yīng)5 sec。cDNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆 根據(jù)本實驗室前期柱花草全長轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，篩選得到SgNramp1和SgNramp2基因全長cDNA序列。根據(jù)序列信息，設(shè)計基因特異引物SgNramp1-ORF-F/R和SgNramp2-ORF-F/R(表1)。以根系cDNA為模板，進行PCR擴增得到SgNramp1和SgNramp2基因。將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體(Takara，中國)上，并進行測序分析。

表1 SgNramp1和SgNramp2基因全長克隆和定量PCR引物Table 1 Primers for SgNramp1 and SgNramp2 full-length cloning and qRT-PCR analysis

1.2.4SgNramp1和SgNramp2基因生物信息學(xué)分析 利用EXPASY(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具分析基因的氨基酸數(shù)、分子量和等電點；通過HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)進行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析；通過HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測和跨膜結(jié)構(gòu)域分析；使用MAGA-X并結(jié)合EvolView(https://www.evolgenius.info/evolview/#login)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5SgNramp1和SgNramp2基因表達分析 使用QuantStudioTMReal-Time PCR(Thermo Fisher，美國)系統(tǒng)和SYBR Green(Vazyme，中國)定量試劑盒進行實時定量PCR(qRT-PCR)分析。定量PCR反應(yīng)體系包括10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，2 μL cDNA模板(稀釋倍數(shù)50)、1 μL引物(10 μmol·L-1)，并補足ddH2O至20 μL；反應(yīng)程序為：95℃ 1 min，95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。基因相對表達量為目的基因表達量除以內(nèi)參基因(SgEF1a)表達量。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進行分析和作圖，并用軟件SPSS v23.0(SPSS Institute，美國)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆

本研究根據(jù)柱花草全長轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得的SgNramp1和SgNramp2基因全長序列，設(shè)計基因全長克隆引物，以柱花草根系cDNA為模板，擴增出SgNramp1和SgNramp2基因cDNA全長序列。SgNramp1基因全長為1 654 bp，而SgNramp2基因全長為1 716 bp(圖1)。

圖1 SgNramp1和SgNramp2全長cDNA的克隆Fig.1 Full lengths cloning of SgNramp1 and SgNramp2 注：Marker，DL2000 DNA Marker；1，柱花草SgNramp1基因擴增產(chǎn)物；2，柱花草SgNramp2基因擴增產(chǎn)物Note:Maker,DL2000 DNA maker;1,PCR product of SgNramp1;2,PCR product of SgNramp2

2.2 SgNramp1和SgNramp2蛋白特性分析

利用Expasy在線工具分析表明SgNramp1和SgNramp2蛋白分別包含有544和557個氨基酸，分子量分別為59.5 kDa和61.0 kDa，等電點分別為8.2和5.2。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)兩個蛋白都定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，可能為膜蛋白。

2.3 SgNramp1和SgNramp2蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用HMMER對SgNramp1和SgNramp2蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明SgNramp1和SgNramp2均屬于Nramp蛋白家族成員，均包含有Nramp蛋白SLC5-6-like_sbd superfamily保守序列，且包含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖2 SgNramp1 (A) 和SgNramp2 (B) 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of conserved domains of SgNramp1 (A) and SgNramp2 (B)

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

系統(tǒng)進化樹分析表明，擬南芥、水稻、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)和苜蓿(Medicagotruncatula)等不同植物的Nramp蛋白可以被分為3大組，并進一步被分為6個亞組(圖3)。柱花草SgNramp1被分在第I組中，與擬南芥AtNramp1/6，水稻OsNramp3，大豆GmNramp5a/5b/6a/6b和苜蓿MtNramp1/6等Nramp蛋白同屬一個亞組，且SgNramp1與大豆GmNramp5a/5b具有較高的同源性。SgNramp2被分在第II組，與擬南芥AtNramp2/5、大豆GmNramp4a/4b和苜蓿MtNramp3等Nramp蛋白同屬一個亞組，且SgNramp2與MtNramp3同源性最高(圖3)。

圖3 SgNramp1和SgNramp2與其他植物Nramps蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of SgNramp1 and SgNramp2 with other Nramp proteins注：At,擬南芥；Os,水稻；Hv,大麥；Cs,黃瓜；Mt,苜蓿；Zm,玉米；Gm,大豆；Pt,毛果楊；Sg,柱花草Nramps蛋白Note:At,Arabidopsis thaliana;Os,Oryza sativa;Hv,Hordeum vulgare;Cs,Cucumis sativus;Mt,Medicago truncatula;Zm,Zea mays;Gm,Glycine max;Pt,Populus trichocarpa;Sg,Stylosanthes guianensis

2.5 柱花草SgNramp1/2基因組織表達分析

本研究通過RT-PCR方法，分析了SgNramp1和SgNramp2基因在柱花草不同組織中的表達模式。由圖4A和4B所示，SgNramp1基因在柱花草根中的表達量顯著高于葉中的表達量(P<0.05)，而SgNramp2基因則在葉中特異性表達。另外，本研究也分析了SgNramp1/2在柱花草新葉(NL)、成熟葉(ML)和老葉(OL)中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SgNramp1基因在新葉中的表達量最高，成熟葉和老葉次之；然而，SgNramp2基因在老葉中的表達量顯著高于新葉的表達量(P<0.05)(圖4C和4D)。

圖4 柱花草SgNramp1和SgNramp2基因組織表達分析Fig.4 Expressions of SgNramp1 and SgNramp2 in different tissues注：圖中不同字母表示不同組織間差異顯著(P<0.05)Note: Different letters indicate significant differences among different tissues at the 0.05 level

2.6 不同元素脅迫處理對SgNramp1/2基因的表達的影響

本研究分析了錳、鐵、鋅和銅等元素缺乏和過量脅迫處理對SgNramp1/2基因在柱花草葉和根中表達的影響。由圖5可知，和CK相比，雖然SgNramp1/2基因?qū)υ厝狈Φ捻憫?yīng)不一樣，但缺錳(-Mn)處理均顯著抑制了SgNramp1/2基因在葉和根中的表達(P<0.001)。缺鋅(-Zn)和銅(-Cu)處理增強了SgNramp1基因在根中的表達，但對SgNramp1基因在葉中的表達影響不顯著(圖5A,5B)。缺鐵(-Fe)和-Cu處理增強了SgNramp2基因在葉中的表達，但-Mn，-Fe，-Zn和-Cu處理均抑制了SgNramp2基因在根中的表達(圖5C,5D)。

圖5 不同元素缺乏處理對SgNramp1和SgNramp2基因表達的影響Fig.5 Effects of element deficiency on SgNramp1 and SgNramp2 expressions 注：*表示不同處理與對照(CK)間差異顯著(*, 0.01

由圖6可知，元素過量脅迫對SgNramp1/2基因表達的調(diào)控有所差異。過量錳(+Mn)和鋅(+Zn)處理顯著增強了SgNramp1在葉中的表達(P<0.05)，而過量鐵(+Fe)和+Zn處理則增強了SgNramp1在根中的表達(圖6A,6B)。+Mn處理抑制了SgNramp2在葉中的表達，但卻增強了SgNramp2在根中的表達；+Fe處理增強了SgNramp2在葉中的表達，而+Zn處理則增強了SgNramp2在根中的表達(圖6C,D)。另外，過量銅(+Cu)處理均顯著抑制了SgNramp1在葉和根中的表達(P<0.05)，但卻增強了SgNramp2基因在葉和根中的表達(圖6)。

圖6 不同元素過量處理對SgNramp1和SgNramp2基因表達的影響Fig.6 Effects of excess elements on SgNramp1 and SgNramp2 expressions注：A和B，SgNramp1在葉(A)和根(B)中的表達量；C和D，SgNramp2在葉(C)和根(D)中的表達量。星號表示不同處理與對照(CK)間差異顯著(*, 0.01

2.7 不同金屬處理對SgNramp1/2基因表達的影響

本研究進一步分析了金屬鋁(100 μmol·L-1Al)、鎘(40 μmol·L-1Cd)和鑭(20 μmol·L-1La)處理對SgNramp1/2基因在柱花草根中表達的影響。由圖7可知，SgNramp1/2基因?qū)Σ煌饘偬幚眄憫?yīng)不一樣。與對照CK相比，鎘(Cd)處理顯著增強了SgNramp1基因在根中的表達(P<0.001)，而鋁(Al)和鑭(La)處理則抑制了SgNramp1基因的表達(圖7A)。然而，與對照CK相比，鋁、鎘和鑭處理均增強了SgNramp2基因的表達，且SgNramp2基因在鎘處理下表達量最高，鋁和鑭處理下次之(圖7B)。

圖7 不同重金屬處理對SgNramp1(A)和SgNramp2(B)基因表達的影響Fig.7 Effects of heavy metal treatments on the expressions of SgNramp1 (A) and SgNramp2 (B)注：星號表示不同處理間差異顯著(*, 0.01

3 討論

細(xì)胞礦質(zhì)營養(yǎng)平衡對維持植物生長和發(fā)育具有重要的影響，植物Nramp蛋白被報道在金屬離子吸收、轉(zhuǎn)運和分配過程中起重要作用[24]。研究表明，在擬南芥中，包括6個AtNramps蛋白[25]，在水稻中，包含7個OsNramps蛋白[10]，而在大豆中則包含13個GmNramps蛋白[24]。不同植物的Nramp蛋白家族成員具有高度保守的SLC5-6-like-sbd結(jié)構(gòu)域，且一般具有10～12個跨膜結(jié)構(gòu)域[24,26]。本研究發(fā)現(xiàn)，柱花草SgNramp1和SgNramp2也包含有Nramp蛋白SLC5-6-like_sbd superfamily保守序列，且均包含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)，表明SgNramp1和SgNramp2屬于Nramp蛋白家族成員。并且，亞細(xì)胞定位預(yù)測表明SgNramp1和SgNramp2均定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，暗示其可能具有轉(zhuǎn)運金屬離子的功能。

不同植物的Nramp蛋白被報道參與了轉(zhuǎn)運錳和鐵等金屬離子[4,24]。在系統(tǒng)進化樹中，柱花草SgNramp1與擬南芥AtNramp1/6，水稻OsNramp3以及苜蓿MtNramp1/6等Nramp蛋白被分在第I大組中(圖3)。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtNramp1蛋白定位在質(zhì)膜中，nramp1突變體在缺錳條件下不能正常生長，且組織錳濃度低于野生型植株，進一步分析發(fā)現(xiàn)AtNramp1是負(fù)責(zé)擬南芥根系錳吸收的高親和錳轉(zhuǎn)運蛋白，并具有轉(zhuǎn)運鐵的能力[25]。另外，擬南芥AtNramp6被報道定位在囊泡內(nèi)膜上，可能參與了鎘的運輸[9]。因此，柱花草SgNramp1可能具有與擬南芥AtNramp1/6類似的生物學(xué)功能，參與細(xì)胞錳和鎘的轉(zhuǎn)運。柱花草SgNramp2與擬南芥AtNramp2/5、大豆GmNramp3a/3b和苜蓿MtNramp3等同第II組。研究表明，擬南芥AtNramp2定位在高爾基體中，主要負(fù)責(zé)錳在高爾基體中的再分配，突變AtNramp2基因顯著抑制了缺錳條件下擬南芥根系的生長[7]，這暗示了SgNramp2參與錳離子轉(zhuǎn)運。

在本研究中，SgNramp1基因主要在柱花草根中表達，而SgNramp2基因則在葉中特異性表達，并且，SgNramp1基因在新葉中的表達量最高，而SgNramp2基因則在老葉中的表達量最高(圖4)。AtNramp1在根部中的表達量高于地上部，且缺錳和缺鐵脅迫均增強了擬南芥AtNramp1在根中表達，進一步分析發(fā)現(xiàn)AtNramp1主要負(fù)責(zé)根系對錳元素的吸收[25,27]，而AtNramp6則主要在葉中表達，參與了擬南芥對鎘轉(zhuǎn)運和積累[9]。在水稻中，OsNramp3主要在莖節(jié)中表達，是調(diào)節(jié)水稻地上部錳分配的重要基因[11]。在本研究中，缺錳處理抑制了SgNramp1基因在根和葉中的表達，而金屬鎘處理則增強了SgNramp1基因在根中的表達(圖5和圖7)，這些結(jié)果暗示了柱花草SgNramp1參與細(xì)胞錳和鎘的轉(zhuǎn)運。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，缺鐵處理增強了SgNramp2基因在葉中的表達，而鋁和鎘處理也增強了SgNramp2在根中的表達(圖5和圖7)。然而，與SgNramp2較同源的擬南芥AtNramp2主要在根部中表達，雖然AtNramp2表達量不受缺錳、缺鐵和缺鋅等脅迫的影響，但其具有調(diào)控錳離子再分配的生物學(xué)功能[7]。因此，SgNramp2可能具有與擬南芥AtNramp2不同的離子轉(zhuǎn)運機制，其潛在的生物學(xué)功能仍需要進一步挖掘。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究克隆了柱花草SgNramp1和SgNramp2基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱花草SgNramp1和SgNramp2基因表達具有組織特異性，并且，SgNramp1和SgNramp2基因表達受到不同金屬元素脅迫處理的調(diào)控，暗示其可能具有調(diào)節(jié)金屬離子轉(zhuǎn)運的功能。本研究為進一步挖掘SgNramp1和SgNramp2基因的生物學(xué)功能提供了研究方向及參考。