馮冠楠， 安 聰， 丁鋆嘉， 張夏香， 莊黎麗

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 江蘇 南京 210095)

GASA (Gibberellic acid-stimulated arabidopsis)蛋白是一類CRP蛋白(C-reaction protein)，在植物中分布廣泛，編碼基因數(shù)量眾多[1]。目前已在矮牽牛(Petuniahybrida)[2]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、水稻(Oryzasativa)[4]、毛竹(Phyllostachysedulis)[5]、小麥(Triticumaestivum)[6]和玉米(Zeamays)[7]等物種中分離鑒定出GASA基因。GASA家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)較為保守，其N端由21～27個(gè)氨基酸殘基組成疏水信號肽，C端由大約60個(gè)氨基酸組成富含12個(gè)半胱氨酸殘基的GASA結(jié)構(gòu)域，兩者之間為由7～31個(gè)極性氨基酸殘基組成的可變親水區(qū)域[8]。研究發(fā)現(xiàn)缺失或者改變GASA結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸會導(dǎo)致整個(gè)GASA喪失功能。GASA蛋白通常在植物幼嫩的組織器官和生長旺盛的部位強(qiáng)烈表達(dá)，且大多數(shù)成員受赤霉素(Gibberellin，GA)調(diào)控[2-4]。

隨著各類植物GASA基因逐步被分離與鑒定，人們對這類小分子蛋白的分子結(jié)構(gòu)和功能有了更深入的認(rèn)識，研究表明GASA蛋白在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括參與種子萌發(fā)[9]、花和果實(shí)發(fā)育[10]、側(cè)根的形成[11]、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]等多個(gè)過程。同時(shí)，GASA蛋白還參與植物生物與非生物脅迫應(yīng)答[13]。張盛春等[1]對15個(gè)擬南芥GASA基因家族成員進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)GASA基因家族成員在根尖生長點(diǎn)、莖尖分生組織和花序軸分枝處表達(dá)。擬南芥AtGASA4具有調(diào)控花分生組織活性，促進(jìn)植株開花及調(diào)控種子大小，進(jìn)而影響種子產(chǎn)量的功能；同時(shí)AtGASA4還通過促進(jìn)GA信號和抑制氧化還原活性來促進(jìn)擬南芥種子的萌發(fā)[8-9]。擬南芥GASA5則抑制植物開花和莖伸長，且作為赤霉素響應(yīng)的抑制因子抑制種子萌發(fā)[14]。Hou等[5]的研究證實(shí)了在毛竹中GASA基因家族成員在葉片部分也參與表達(dá)，推測GASA基因家族蛋白可能具有調(diào)控植物不同部位的細(xì)胞分裂的功能。Furukawa等[15]證實(shí)在水稻GASA基因家族中，OsGASR1和OsGASR2基因也表現(xiàn)出可能參與調(diào)控水稻花序分化的現(xiàn)象。關(guān)于GASA基因?qū)χ参锔堪l(fā)育的影響方面，Aubert等[16]研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥主根與側(cè)根中，都可以檢測到擬南芥GASA基因家族成員GASA4基因表達(dá)。Zimmermann等[7]發(fā)現(xiàn)，在玉米(Zeamays)中的GASA基因家族成員之一ZmGSL(ZeamaysGibberellicAcidStimulated-Like)可能參與調(diào)控玉米側(cè)根的生長發(fā)育并且受到GA調(diào)節(jié)。

對GASA基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，GASA啟動子區(qū)富含跟發(fā)育、激素以及脅迫相關(guān)的順式作用元件，說明GASA不僅調(diào)控植物生長發(fā)育，還參與植物應(yīng)對逆境脅迫[7,17-18]。對馬鈴薯(Solanumtuberosum)的體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，馬鈴薯GASA基因家族成員Snakin-1編碼的蛋白具有提高馬鈴薯抵抗真菌和細(xì)菌等微生物入侵植株的能力[19]。辣椒(Capsicumannuum)中的CaSn蛋白具有抗根結(jié)線蟲的能力[19]。此外，菜豆(Phaseolusvulgaris)GASA基因家族成員Snakin-2編碼的蛋白可與PRP蛋白形成一種特殊的蛋白復(fù)合物，并在植物生物防御過程中起到積極作用[20]。Snakin-2基因在遭遇機(jī)械損傷后表達(dá)量顯著上升，如果Snakin-2基因超量表達(dá)能顯著提高植株對病原體的抵抗能力[21]。這些研究表明植物GASA蛋白具有一定的抗菌作用，可以作為植物天然的防御屏障，在植物抗蟲與抗病方面發(fā)揮重要作用[1]。在GASA參與非生物脅迫方面，研究表明GASA基因可以響應(yīng)多種逆境脅迫信號并在其中起到重要作用。例如擬南芥GASA4基因的表達(dá)量在短期熱處理下迅速上升，超量表達(dá)后提高了擬南芥植株的耐熱性[22]；野生大豆(Glycinesoja)GASA基因家族中GsGASA1與GsGASA2基因均受到干旱脅迫、低溫脅迫、鹽脅迫以及堿脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，在這四種短期非生物脅迫處理下，GsGASA1與GsGASA2基因均呈現(xiàn)出表達(dá)量顯著上升的情況[23]。此外，Alonso-Ramirez等[24]發(fā)現(xiàn)擬南芥異位表達(dá)歐洲山毛櫸(Fagussylvatica)FsGASA4基因通過增加水楊酸(Salicylic acid，SA)的生物合成增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)過程中的耐鹽性、抗氧化能力和耐熱性。水稻中OsGASR1通過活性氧清除系統(tǒng)增強(qiáng)植物對鹽脅迫的耐受性[25]。

狗尾草屬單子葉植物綱禾本科黍亞科，與常見作物高粱(Sorghumbicolor)、玉米、谷子(Setariaitalica)、白茅(Imperatacylindrica)等同屬一科，是C4光合作用的優(yōu)秀模式植物[26]。狗尾草是谷子的野生近緣種，狗尾草與谷子染色體帶型相近，核型基本一致，兩者基因組大小都約為510 Mb，狗尾草是進(jìn)一步研究谷子基因與提高谷子產(chǎn)量的重要模型[27]；同時(shí)狗尾草具有易種植、生長周期短、容易轉(zhuǎn)化、種量大等優(yōu)點(diǎn)，所以也是不錯的單子葉轉(zhuǎn)基因模式植物[28]。狗尾草具有豐富的抗性基因，植株對非生物脅迫耐受能力較強(qiáng)，是研究干旱、冷害、鹽堿等非生物脅迫耐受性的模型。赤霉素調(diào)節(jié)的GASA基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，在調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中起重要作用。目前對狗尾草GASA家族進(jìn)行分析的研究尚未見報(bào)道，生物信息學(xué)分析是后基因組時(shí)代對特定物種中一類基因的基本結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行初步研究的常見的方法[1,5-6,29-30]。

本研究基于狗尾草基因組序列，通過生物信息學(xué)方法對狗尾草中GASA基因家族基因序列進(jìn)行鑒定，并在基因序列、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化等方面對其進(jìn)行分析，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測其在干旱、冷害、鹽害三種不同逆境條件下的表達(dá)模式，為深入研究狗尾草GASA基因家族的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長條件

本研究選擇狗尾草‘A10’品系為研究材料。2019年11月，將狗尾草種子放置在鋪兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適當(dāng)蒸餾水，將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱(白天/夜晚溫度為25℃/20℃，光周期14 h/10 h，濕度70%，光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1)進(jìn)行萌發(fā)。待植物材料萌發(fā)且長度超過5 cm后，將萌發(fā)的狗尾草小苗轉(zhuǎn)移到人工氣候室進(jìn)行水培培養(yǎng)。具體方法為：用小海綿塊包裹狗尾草小苗根莖部位，并固定在打孔處理的黑色泡沫板上，根系全部浸入1/2霍格蘭營養(yǎng)液。每3 d更換一次霍格蘭營養(yǎng)液。人工氣候室培養(yǎng)條件為：白天夜晚各12 h，白天溫度為30℃，夜晚溫度為25℃，濕度70%，光照強(qiáng)度為500 μmol·m-2·s-1。

1.2 植物逆境處理

2019年12月，對霍格蘭營養(yǎng)液中水培培養(yǎng)的狗尾草植株進(jìn)行15%聚乙二醇6000(PEG6000)模擬干旱處理、鹽處理(150 mM NaCl)以及冷處理(4℃)。并在脅迫處理0 h,3 h,6 h,24 h進(jìn)行取樣。取樣時(shí)，采取葉片部分放入液氮中進(jìn)行速凍，隨后保存在—80℃的超低溫冰箱中。每個(gè)樣品三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 狗尾草GASA家族基因鑒定

基于李相伯等人的研究提供的基因ID[31]，擬南芥GASA家族蛋白序列從TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org)獲得，水稻GASR序列從Phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov)搜索獲得部分序列。隨后以水稻的GASR序列為搜索請求，通過BLASTP程序搜索Phytozome網(wǎng)站中狗尾草基因組序列(Setariaviridisv1.1,Setariaviridisv2.1)。對所得搜索結(jié)果的序列進(jìn)行篩選(E值< 10-6)，并通過在NCBI進(jìn)行序列比對，與水稻/擬南芥中GASA蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹分析等綜合確定狗尾草GASA家族的基因序列。

1.4 狗尾草GASA家族基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)Pytozome數(shù)據(jù)庫對狗尾草GASA家族基因的外顯子、內(nèi)含子、編碼區(qū)長度等信息進(jìn)行檢索，使用Exon-Intron Graphic Maker在線程序繪制狗尾草GASA家族基因結(jié)構(gòu)圖。

1.5 狗尾草GASA家族啟動子分析

通過phytozome網(wǎng)站，獲得12個(gè)狗尾草GASA家族基因起始密碼子上游1 000 bp序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站分別分析12個(gè)GASA基因啟動子區(qū)的順式作用元件。隨后篩選可能對調(diào)控狗尾草生長發(fā)育與抗逆有作用的順式作用位點(diǎn)，并加以匯總。

1.6 狗尾草GASA家族motif分析

采用The MEME Suite(http://meme-suite.org/)在線軟件預(yù)測狗尾草GASA家族保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域?qū)挾仍O(shè)置為6～50個(gè)氨基酸殘基，規(guī)定搜索4種Motif，且MEME鑒定的所有結(jié)構(gòu)域均在Pfam數(shù)據(jù)庫(The Pfam database provides alignments and hidden Markov models for protein domains)中進(jìn)行搜索。

1.7 基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

采用MEGA 7.0軟件，根據(jù)鄰接法模型，將擬南芥、水稻與狗尾草GASA家族的蛋白序列繪制成系統(tǒng)進(jìn)化樹，遺傳變異度為0.1。

1.8 熒光定量PCR

采用植物RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Plant RNA Kit,Omega Bio-tek)提取樣品總RNA。去除DNA后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA (MonScriptTMRTⅢSuperMix with dsDNase (Two-Step),莫納)。以稀釋的cDNA為模板，Roche熒光定量試劑配置反應(yīng)體系，采用Roche Light Cycler480平臺進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。定量PCR的條件為：95℃預(yù)變性10 min，之后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增(95℃變性10 s,60℃退火10 s,72℃延伸30 s)。每個(gè)循環(huán)都設(shè)定在65℃采集數(shù)據(jù)。每個(gè)生物學(xué)樣品都進(jìn)行2次技術(shù)重復(fù)。內(nèi)參基因選擇狗尾草Ubiquitin(Si018607)基因[32]。試驗(yàn)所用引物見表1。

表1 引物序列表Table 1 Primers used in this study

1.9 數(shù)據(jù)分析及作圖

狗尾草GASA基因相對表達(dá)水平采用2-ΔΔCT法計(jì)算，隨后將其轉(zhuǎn)化成log2數(shù)值。采用Amazing Heatmap (https://github.com/CJ-Chen/TBtools)繪制基因表達(dá)熱圖及數(shù)據(jù)聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 狗尾草GASA家族基因序列的獲得

首先通過查閱文獻(xiàn)[1,30]獲得擬南芥與水稻GASA家族蛋白序列的基因名稱與登錄號，從TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org)獲得擬南芥GASA基因家族蛋白序列，水稻GASR序列從phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov)下載獲得。通過phytozome網(wǎng)站BLASTP程序，分別以15個(gè)擬南芥和11個(gè)水稻的GASR序列作為搜索請求，在網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫得到候選目標(biāo)蛋白序列，通過對BLASTP結(jié)果中E值大小的篩選，最終確定狗尾草12個(gè)GASA家族基因序列，相關(guān)基因信息整理如表2。由分析結(jié)果可知，狗尾草12個(gè)GASA蛋白長度為276至663個(gè)氨基酸。

表2 狗尾草GASA基因家族候選基因概況Table 2 Summary of GASA sequence in Setaria viridis

2.2 狗尾草GASA家族基因結(jié)構(gòu)

采用Exon-Intron Graphic Maker在線程序繪制基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖1。由圖1知，狗尾草GASA基因家族基因結(jié)構(gòu)相對簡單，家族成員所含外顯子數(shù)量為1～4個(gè)，內(nèi)含子數(shù)量為0～4個(gè)，多個(gè)基因具有相同的外顯子與內(nèi)含子數(shù)目。如SvGASA1，SvGASA5與SvGASA11都具有4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子；SvGASA4，SvGASA6與SvGASA8都具有3個(gè)外顯子與2個(gè)內(nèi)含子；SvGASA3，SvGASA7與SvGASA9都具有2個(gè)外顯子與1個(gè)內(nèi)含子；SvGASA2，SvGASA10與SvGASA12具有較為特殊的基因結(jié)構(gòu)，SvGASA2不具有內(nèi)含子，SvGASA10具有4個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子，而SvGASA12具有3個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子。

圖1 狗尾草GASA家族基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of the GASA family in Setaria viridis

2.3 狗尾草GASA基因啟動子序列生物信息學(xué)分析

基于phytozome網(wǎng)站截取12個(gè)狗尾草GASA家族基因起始密碼子上游1 000 bp序列，采用PlantCARE網(wǎng)站進(jìn)行順式元件的分析。將同時(shí)出現(xiàn)在12個(gè)基因啟動子區(qū)中的常見順式元件進(jìn)行匯總，結(jié)果如表3所示，狗尾草GASA基因家族啟動子均有核心序列為CAAT的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)調(diào)控元件、核心序列為CGACG的G-BOX伴侶元件及核心序列為GTAC的銅應(yīng)答元件。同時(shí)，GASA基因家族啟動子區(qū)還有與脫水、光、低溫、高鹽等環(huán)境因素相關(guān)元件，如核心序列為RCCGAC的脫水響應(yīng)元件，核心序列為CCGAAA和CCGAC的低溫響應(yīng)元件，核心序列為ACACNNG的病原和高鹽脅迫響應(yīng)元件。此外，GASA基因家族啟動子區(qū)還有多個(gè)與植物激素相關(guān)的順式作用元件，如：脫落酸信號轉(zhuǎn)錄激活因子、赤霉素響應(yīng)元件、影響水楊酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)及細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因ARRI結(jié)合位點(diǎn)(因12個(gè)狗尾草GASA家族基因的啟動子位置信息過于繁多，文中僅列出其共有順式作用元件)。

表3 狗尾草GASA基因家族共有啟動子順式作用元件Table 3 Common cis elements on the promoters of the 12 GASA genes

2.4 狗尾草GASA基因家族的蛋白結(jié)構(gòu)

模體(motif)又稱蛋白質(zhì)超二級結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)分子具有特定功能或作為獨(dú)立結(jié)構(gòu)域一部分的二級結(jié)構(gòu)聚合體。基因家族大多數(shù)成員共有的模體極可能是該基因家族組成結(jié)構(gòu)或發(fā)揮自身重要功能不可缺少的部分，如參與重要生命過程：RNA轉(zhuǎn)錄、植株生長、植株發(fā)育等。識別基因家族共有模體可以更好的了解該基因家族特征，并利用這些特征來探索基因家族新的成員。

本研究中12個(gè)狗尾草GASA蛋白含有4個(gè)模體，詳情見圖2。由圖2可以得出，在基于保守模體的基礎(chǔ)上可將狗尾草GASA蛋白劃分為2個(gè)亞類。Motif1，Motif2，Motif3和Motif4在SvGASA2，SvGASA3，SvGASA4，SvGASA5，SvGASA6，SvGASA7，SvGASA8，SvGASA10，SvGASA11，SvGASA12中同時(shí)出現(xiàn)；Motif1，Motif2，Motif3在SvGASA1和SvGASA9中同時(shí)出現(xiàn)。此外，結(jié)果還表明大部分狗尾草GASA蛋白在結(jié)構(gòu)域的排布方式及數(shù)量上有很好的一致性，狗尾草GASA家族都含有Motif1，Motif2，Motif3。

圖2 狗尾草GASA家族的模體分析Fig.2 Motif analysis of the GASA family in Setaria viridis

2.5 狗尾草GASA家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了分析狗尾草、擬南芥以及水稻中GASA家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對所得狗尾草GASA與擬南芥及水稻中GASA蛋白進(jìn)行對比分析。采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，得到了分枝長度之和為7.750 191 39的最優(yōu)樹。

圖3 狗尾草、水稻和擬南芥中GASA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of GASA proteins in Setaria viridis,rice and Arabidopsis

擬南芥(15個(gè))、水稻(11個(gè))及狗尾草(12個(gè))GASA蛋白家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，來自3種植物的38個(gè)GASA蛋白家族成員被分為3個(gè)進(jìn)化枝，本研究得到的12個(gè)狗尾草GASA家族蛋白在這3個(gè)進(jìn)化枝均有分布。在各個(gè)進(jìn)化枝中，狗尾草GASA蛋白基本與水稻中同源蛋白成對出現(xiàn)，與水稻呈現(xiàn)出較高的親緣性，而與擬南芥GASA家族蛋白親緣性較低。例如GASR4/SvGASA4與GASA14同源，水稻GASR4與狗尾草GASA4更為同源。在同一進(jìn)化枝中，單雙子葉植物GASA發(fā)生了明顯的分化，如單子葉植物水稻GASR6與狗尾草SvGASA6在雙子葉植物擬南芥中的同源蛋白有5個(gè)，即GASA9，GASA11，GASA1，GASA2與GASA3。

2.6 短期逆境脅迫下狗尾草GASA基因的表達(dá)

對狗尾草GASA家族基因的啟動子順式元件分析發(fā)現(xiàn)，12個(gè)基因啟動子區(qū)均含有脫水、冷害及高鹽脅迫響應(yīng)元件，這表明GASA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平很可能受到脫水、冷害及高鹽脅迫的影響。為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，采用qRT-PCR技術(shù)對在模擬干旱處理、鹽處理以及冷處理下的狗尾草葉片中GASA家族基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。首先對設(shè)計(jì)的定量引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。12個(gè)狗尾草GASA基因家族基因及內(nèi)參基因Ubiquitin(Si018607)[32]均擴(kuò)增出預(yù)期條帶。

15% PEG6000模擬的短期干旱脅迫下，qRT-PCR檢測結(jié)果表明，12個(gè)狗尾草GASA基因表達(dá)模式可分為三類。SvGASA3在干旱處理3 h后表達(dá)量下調(diào)，且維持到24 h。大部分狗尾草GASA基因家族的mRNA表達(dá)在24 h內(nèi)上調(diào)表達(dá)，其中SvGASA10，SvGASA11，SvGASA7，SvGASA5及SvGASA1在干旱處理24 h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到極高水平。其余6個(gè)SvGASA基因表達(dá)量也都受到干旱誘導(dǎo)，在24 h時(shí)也保持較高水平(圖4)。

圖4 15% 聚乙二醇6000處理下狗尾草GASA基因家族的表達(dá)分析Fig.4 Relative expression level of SvGASA genes under 15% PEG6000 treatment

在冷脅迫處理下，大部分基因表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，其中SvGASA10，SvGASA1，SvGASA11，SvGASA5及SvGASA6反應(yīng)較快，在3 h即有較高的表達(dá)水平，SvGASA10表達(dá)水平在冷脅迫處理24 h達(dá)到最高。多個(gè)基因(包括SvGASA1，SvGASA11，SvGASA5等)表達(dá)量在冷脅迫6 h時(shí)達(dá)到最高。SvGASA3，SvGASA4，SvGASA8在冷脅迫中表達(dá)水平先上升后下降，其中SvGASA3與SvGASA4在處理3 h后表達(dá)顯著上升，隨后表達(dá)下降，到24 h時(shí)低于0 h表達(dá)量；SvGASA8在處理6 h表達(dá)顯著上升，隨后表達(dá)下降，到24 h時(shí)低于0 h表達(dá)量(圖5)。SvGASA2基因表達(dá)量在冷脅迫3 h，6 h和24 h均下降，且其表達(dá)量在24 h時(shí)達(dá)到最低水平。

圖5 短期冷脅迫下狗尾草GASA基因家族的表達(dá)分析Fig.5 Relative expression level of SvGASA genes under 4℃ cold treatment

在短期鹽脅迫處理下，SvGASA8，SvGASA9，SvGASA6，SvGASA12，SvGASA3，SvGASA5及SvGASA1表達(dá)量在3 h達(dá)到極高水平，隨后，多個(gè)基因表達(dá)量在6 h有下降(SvGASA8，SvGASA9及SvGASA6降至低于0 h水平)，但最終在24 h仍然保持較高的表達(dá)水平。SvGASA11及SvGASA4表達(dá)量在鹽處理3 h顯著下調(diào)，6 h時(shí)表達(dá)量降至最低。SvGASA7和SvGASA10表達(dá)量在鹽脅迫前期有不同程度下降，但在24 h時(shí)都顯著高于0 h水平。SvGASA2在鹽脅迫處理下表達(dá)量先略微上升，隨后逐漸下降，24 h時(shí)降至最低(圖6)。

圖6 短期鹽脅迫下狗尾草GASA基因家族的表達(dá)分析Fig.6 Relative expression level of SvGASA genes under 150 mM NaCl treatment

3 討論與結(jié)論

3.1 狗尾草GASA基因家族生物信息學(xué)分析

GASA是一類富含半胱氨酸的小分子多肽，在植物生長發(fā)育、激素響應(yīng)及逆境脅迫等多方面發(fā)揮作用[1,31]，而C4模式植物狗尾草中GASA的功能尚無研究[26,28]。本研究基于狗尾草基因組數(shù)據(jù)庫，首次利用生物信息學(xué)方法鑒定到狗尾草12個(gè)GASA基因，該數(shù)目與已公布的擬南芥(15個(gè))和水稻(11個(gè))等植物GASA基因家族成員數(shù)目相近，但顯著少于小麥中(35個(gè))GASA基因數(shù)目，表明狗尾草中無片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)事件[1,6]。擬南芥、水稻、矮牽牛等物種中GASA蛋白分析可知，GASA蛋白主要特征為N端信號肽及C端GASA結(jié)構(gòu)域[1-4]。本研究中，狗尾草12個(gè)GASA基因家族成員含有3～4個(gè)Motif，且所有狗尾草GASA基因家族成員都含有Motif1，Motif2與Motif3，說明GASA蛋白結(jié)構(gòu)較為簡單。基因結(jié)構(gòu)分析表明，個(gè)別基因如SvGASA5與SvGASA11，SvGASA4，SvGASA6與SvGASA8具有極為相似的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果也表明SvGASA5與SvGASA11，SvGASA4，SvGASA6與SvGASA8在同一個(gè)進(jìn)化枝，且其模體結(jié)構(gòu)也一致。這說明基因結(jié)構(gòu)的相似性與基因親緣關(guān)系遠(yuǎn)近存在一定正相關(guān)。然而，SvGASA3，SvGASA7與SvGASA9雖然都是兩個(gè)外顯子一個(gè)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明SvGASA3與SvGASA9屬于一個(gè)進(jìn)化枝，而SvGASA7則屬于另一個(gè)進(jìn)化枝。從MEME分析結(jié)果來看，SvGASA3與SvGASA7都有4個(gè)motif，而SvGASA9僅有3個(gè)。說明基因/蛋白結(jié)構(gòu)的相似性與親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不存在絕對的正相關(guān)關(guān)系。想要進(jìn)一步獲得狗尾草GASA蛋白的功能信息，還有待利用正向和反向遺傳學(xué)技術(shù)并結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

在啟動子分析中，狗尾草12個(gè)GASA基因啟動子中同時(shí)存在響應(yīng)赤霉素、脫落酸、水楊酸及細(xì)胞分裂素的順式作用元件，暗示其可能調(diào)節(jié)多種激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并以此調(diào)控狗尾草多個(gè)生長發(fā)育過程。其他物種的研究也表明，GASA能夠響應(yīng)多種植物激素信號起作用。例如，番茄GAST1[33]、水稻OsGASR1和OsGASR2[34]及擬南芥與玉米[3,7]中多個(gè)GASA基因的表達(dá)受到GA3的誘導(dǎo)。擬南芥中，脫落酸能夠誘導(dǎo)GASA5和GASA14的表達(dá)，抑制GASA4，GASA6，GASA7和GASA9的表達(dá)。番茄中GAST1基因受脫落酸抑制[32]。水稻中OsGASR1除受GA誘導(dǎo)外，還受油菜素內(nèi)酯抑制[4]。這說明植物激素對GASA基因的調(diào)控方式比較多樣，且不同植物激素之間也可能存在協(xié)同或者拮抗作用。狗尾草中12個(gè)GASA基因受何種激素調(diào)控，其調(diào)控機(jī)理如何，需要后期利用生理生化結(jié)合正向和反向遺傳學(xué)技術(shù)等多種手段來進(jìn)一步探討。

3.2 短期逆境脅迫下狗尾草GASA家族基因的表達(dá)

干旱、冷害、鹽害是常見的三種影響植物生長逆境條件，也是影響植物最廣泛的逆境條件。在本次試驗(yàn)前期，我們發(fā)現(xiàn)狗尾草12個(gè)GASA基因啟動區(qū)都有響應(yīng)干旱、冷害、高鹽的順式作用元件，這與毛竹、楊樹(Populuseuphratica)和棉花(Gossypiumhirsutum)等植物中GASA啟動子區(qū)分析結(jié)果一致[5,17-18]。而隨后的定量表達(dá)分析試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大部分狗尾草GASA基因在干旱、低溫、鹽脅迫下都上調(diào)或者下調(diào)mRNA表達(dá)水平，這些結(jié)果側(cè)面反映GASA基因參與狗尾草非生物脅迫，與其他物種中結(jié)果一致[3,5,17-18,31]?？傮w而言，狗尾草中受干旱誘導(dǎo)上調(diào)的GASA基因數(shù)目最多，受低溫誘導(dǎo)上調(diào)的基因數(shù)目次之，受高鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目最少。棉花中GASA則在低溫和高鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)更為顯著，而在高溫和PEG6000處理下的上調(diào)表達(dá)不太明顯[18]。這種不同可能是由狗尾草及棉花對溫度和水分的需求差異造成的。SvGASA1，SvGASA5和SvGASA10在三大逆境中表達(dá)均顯著上調(diào)，表明這三個(gè)基因可以作為狗尾草抵抗多種非生物脅迫的重點(diǎn)靶向基因。后期有望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制狗尾草多抗種質(zhì)。另一方面，在干旱、低溫和高鹽逆境脅迫下，一些狗尾草GASA基因表達(dá)又表現(xiàn)出特異性，如干旱脅迫下，僅SvGASA3表達(dá)水平顯著下調(diào)，而楊樹和棉花中較多GASA基因受干旱誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)[17-18]。SvGASA2表達(dá)水平在低溫脅迫下始終下調(diào)，SvGASA3，SvGASA4和SvGASA8則在24 h下調(diào)，其他基因均上調(diào)。與干旱和低溫明顯不同，大多數(shù)狗尾草GASA基因在高鹽脅迫6 h后顯著下調(diào)，但24 h時(shí)大部分基因又表現(xiàn)為顯著上調(diào)。結(jié)合他人研究及本研究結(jié)果表明，同一物種中同一GASA基因在不同逆境下會表現(xiàn)不同表達(dá)模式，而不同物種中同源GASA基因在同一逆境脅迫下會表現(xiàn)相同或者相反的表達(dá)趨勢。

綜上所述，本文利用生物信息學(xué)方法對狗尾草GASA基因家族進(jìn)行了分析，鑒定了基因結(jié)構(gòu)并推測了基因功能，同時(shí)分析了12個(gè)GASA基因在三種短期逆境下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這為進(jìn)一步研究狗尾草GASA家族基因功能提供了理論與試驗(yàn)依據(jù)。