闞海明， 龐 卓， 陳 超， 鄒俊亮， 張國芳， 武菊英

(北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心， 北京 100097)

北京西北部淺山區(qū)是承接我國北方農(nóng)牧交錯帶與平原生態(tài)系統(tǒng)的重要過渡地帶，是首都地區(qū)重要的水源涵養(yǎng)地和生態(tài)安全屏障，同時該區(qū)域也是生產(chǎn)生活的主要聚集區(qū)，人類活動頻繁，生態(tài)環(huán)境敏感脆弱[1-3]。植被缺失、草地退化等問題制約了該區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)服務功能的發(fā)揮[4-5]。如何長效地恢復退化草地生態(tài)系統(tǒng)植被，修復土壤生態(tài)系統(tǒng)功能，是一個亟待解決的重要問題[6-7]。植物多樣性與土壤微生物多樣性之間存在著密切的聯(lián)系。進一步了解該區(qū)域植物群落組成對土壤微生物多樣性的影響及其機制對于合理開展退化草地植被恢復具有重要的指導意義[8]。

植被恢復是退化生態(tài)系統(tǒng)恢復與重建的關鍵措施。選擇合適植物作為退化草地的建群物種，構建不同的植被恢復模式，以期加快植被恢復進程，一直以來都是恢復生態(tài)學研究的熱點。通過多年生適生植物的建植，構建穩(wěn)定的植物群落，能夠有效地提升植被覆蓋度，改善土壤結構。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)與無芒雀麥(BromusinermisLeyss.)是多年生優(yōu)質牧草，常作為生態(tài)恢復的建群物種而被廣泛應用。在我國北方地區(qū)這2種牧草常用來補播退化草地，是人工草地建植常用的多年生牧草[9-11]。相關研究主要集中在對植物多樣性變化和環(huán)境因素的分析，對于地下土壤微生物響應過程的研究較少。近年來，基于2代、3代測序技術的成熟，大大提高了判別微生物群落組成與多樣性變化的靈敏度，顯著提升了相關研究的質量。

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)功能的敏感指示劑，它們的物種和功能多樣性也是維持生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的關鍵所在[12-13]，對植物的生長及植物群落的建立具有至關重要的作用。土壤微生物組成變化對很多環(huán)境因子如優(yōu)勢物種、土壤類型、pH和地理格局等十分敏感，可以對土壤性質和功能的變化起到很好的指示作用[14-16]。人工植被恢復不僅包括地上植被多樣性的恢復，而且還包括土壤微生物與植物的相互作用過程[17-19]。在植被恢復過程中,土壤微生物的量、活性及種群結構都可能發(fā)生很大的變化[20-21]。由于不同植被的生長方式不同，對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響存在差異，且在植被恢復過程的不同階段，土壤的變化也不盡相同[22-23]。因此，明確植被恢復對土壤微生物群落多樣性的影響，探究不同植物與微生物多樣性的關系，對于指導退化草地生態(tài)系統(tǒng)植被恢復具有重要的理論與實際意義。本研究以不同植被恢復方式的退化草地為研究對象，分析土壤微生物群落的響應變化，為探討北京西北部淺山區(qū)植被恢復提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

在北京市西北部選取沙荒化土地典型區(qū)域，建立試驗區(qū)。試驗地點位于北京市延慶區(qū)退化土地長期定位生態(tài)研究站(115°50′23″ E，40°27′53″ N)。該地位于華北農(nóng)牧交錯帶范圍內，氣候屬溫帶大陸性氣候，全年降水主要分布于4—9月，年降水量在600 mm左右；土壤質地介于砂質土與壤土之間。

1.2 樣地設置與樣方監(jiān)測

選取土壤質地均一、土壤坡度小于5°的退化沙荒地作為試驗區(qū)域，采用完全隨機區(qū)組試驗設計，于2015年5月采用補播的方式，建植無芒雀麥(SB)、紫花苜蓿(AF)草地，自然演替地(CK)，每種補播恢復處理設9個試驗小區(qū)(重復)，小區(qū)面積為10 m×10 m。植被建植后對該區(qū)域進行圍欄處理。

本試驗植物、土壤樣品于2017—2019每年的8月末采集。采用樣方法調查植物群落，小區(qū)內隨機布設一個1 m×1 m的植物樣方，共調查27個樣方，記錄每個樣方內出現(xiàn)的物種名稱以及各物種的蓋度(目測法)、多度(樣方內各物種的數(shù)目)、高度、生物量等。

土壤樣品采集同地上部分同步進行，分別收集0～10 cm，10～20 cm，20～30 cm土層的土壤樣品，其中一部分留置鮮樣用于土壤常規(guī)理化性質的測定，另一小部分取樣時立即放入干冰中，帶回實驗室用于測試土壤微生物多樣性。每個處理分別選取4個小區(qū)采集土壤樣品，每小區(qū)內采用S型5點取樣法，作為一個土壤樣品。

1.3 樣品分析

地上部分采用樣方法，測定物種的豐富度，即每個樣方內出現(xiàn)的物種數(shù)。并分種測定植株的高度、蓋度、頻度。分種收集相應的地上部分帶回實驗室，在65℃下恒溫烘干48 h，獲得地上生物量；分別計算每個物種在群落當中的重要值。將各物種的相對蓋度、相對頻度、相對生物量、相對多度進行加權平均，計算物種的重要值(Important value，IV)?；谥参锒喽扔嬎愀魅郝涞摩炼鄻有裕捎肧impson指數(shù)、Shannon指數(shù)以及物種豐富度指數(shù)(S)來表征植物群落的物種多樣性。

另外，微生物α多樣性采用Sobs指數(shù)和Shannon指數(shù)來表征。

Shannon-Wiener指數(shù)反映土壤中微生物群落豐富度(H′):H′=- ∑Pi×lnPi

Simpson指數(shù)表征土壤中微生物群落優(yōu)勢度(D):D=1-∑(Pi)2

Pielou指數(shù)表示植物群落均勻度指數(shù)(J):J=-∑(PilnPi)/lns

式中S為樣方中觀察的物種數(shù)，Pi=樣品中屬于第i種的個體數(shù)(OTU數(shù)目)的比例如微生物Sobs指數(shù)是指豐富度實際觀測值。

土壤微生物量碳(Soil microbial biomass carbon，MBC)、土壤微生物量氮(Soil microbial biomass nitrogen，MBN)含量采用氯仿熏蒸法測定，MBC=EC/KEC，EC=熏蒸土壤有機碳質量分數(shù)-未熏蒸土壤有機碳，KEC為轉換系數(shù)，取值0.38；MBN=EN/KEN，EN=熏蒸土壤全氮質量分數(shù)-未熏蒸土壤全氮質量分數(shù)，KEN為轉換系數(shù)，取值0.45。

采用CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)方法對樣本的基因組DNA進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，對細菌16SrRNA基因V4區(qū)采用帶Barcode的特異性引物(515F和806R)進行PCR擴增，每個樣品3次重復。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。土壤中真菌采用ITS引物(1737F和 2043R)進行PCR擴增提取，后續(xù)進行Illumina建庫測序。

1.4 生物信息學分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從測定數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后對每個樣品的reads進行拼接后得到原始測序數(shù)據(jù)；原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)質檢和嵌合體去除得到有效數(shù)據(jù)(effective tags)。利用Uparse軟件對樣品的有效序列進行OTUs聚類(相似度97%以上)，用Mothur方法與Silva軟件的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋(設定閾值為0.8～1.0)；采用MUSCLE(3.8.31)軟件進行快速多序列比對，最后對測序數(shù)據(jù)進行標準化處理，采用R3.6軟件計算Alpha多樣性指數(shù)、β多樣性指數(shù)。通過非度量多維尺度(NMDS)在OTU水平來度量細菌以及真菌群落差異。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗數(shù)據(jù)為2017—2019年試驗數(shù)據(jù)采用OFFICE 2016，SPSS 20.0(IBM)進行初步處理和統(tǒng)計方差分析，采用一般線性模型對數(shù)據(jù)進行重復測量，并用Duncan和LSD法進行多重比較，并檢驗方差的顯著性(F)；當P<0.05時認為差異顯著，P<0.01時差異極顯著。所有數(shù)據(jù)采用Excel 2016和Sigmaplot 12.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同植被恢復方式下草地植物群落特征

經(jīng)過一定時間的初級植被恢復演替(6年)，3種不同植被恢復方式下的草地群落組成發(fā)生了顯著的分異。3種植被恢復方式下的草地優(yōu)勢物種差異明顯(表1)，共生植物物種以狗尾草為主。3種植被恢復方式多年生植物的占比分別為33.3%，59.0%，44.7%，其中補播紫花苜蓿與補播無芒雀麥2種植被恢復方式均使補播物種成為了優(yōu)勢物種。

表1 2019年群落基本特征Table 1 Important value of each species of different plant communities in 2019

2.2 植被恢復對草地物種多樣性的影響

不同植被恢復方式對物種多樣性的影響表現(xiàn)出不一致的趨勢(圖1)。植被恢復的時間效應對3種草地的物種多樣性均產(chǎn)生了顯著地影響(P<0.05)。隨著植被恢復時間的延長，CK的物種數(shù)和多樣性指數(shù)呈逐漸下降的趨勢；SB的物種數(shù)和多樣性指數(shù)呈逐漸增加的趨勢；AF的多樣性指數(shù)變化不大，但其物種數(shù)2019年比2017年平均減少了3種。SB的物種數(shù)和多樣性指數(shù)顯著低于CK(P<0.05)，AF和CK的物種數(shù)和多樣性指數(shù)差異并不明顯，CK的物種數(shù)略高于AF。

圖1 草地植物多樣性的變化Fig.1 α-diversity of different restored plant community注：大寫字母表示不同植被恢復方式草地間差異顯著(P<0.05)，小寫字母表示同一年內不同植被恢復方式間差異顯著(P<0.05)Note:Different capital letters indicate significant differences between different restoration methods at the 0.05 level,and different lowercase letter indicate significant differences between different restoration methods in the same year at the 0.05 level

2.3 植被恢復對土壤微生物量碳、氮的影響

如圖2所示，不同年際間土壤的微生物量碳含量沒有顯著差異，不同處理間微生物量碳含量也不存在顯著差異，但不同土壤深度對微生物量碳含量的影響差異顯著(P<0.05)，表現(xiàn)為0～10 cm (232.602 mg·kg-1) > 10～20 cm (100.896 mg·kg-1) > 20～30 cm (42.187 mg·kg-1)。

圖2 不同植被恢復方式對土壤微生物量碳的影響Fig.2 Effects of different restoration approaches on soil microbial biomass carbon

土壤微生量氮含量(圖3)受時間效應影響差異極顯著(P<0.01)，總體微生物量氮含量呈增加的趨勢，同一土層不同年際間的微生物量氮含量差異顯著，2018年和2019年表層(0～10 cm)土壤的MBN含量極顯著地高于2017年含量(P<0.01)。

圖3 不同植被恢復方式對土壤微生物量氮的影響Fig.3 Effects of different restoration approaches on soil microbial biomass nitrogen

不同土壤深度對微生物量氮的影響差異顯著，表現(xiàn)為0～10 cm (34.91 mg·kg-1) > 10～20 cm(16.72 mg·kg-1) > 20～30 cm (7.93 mg·kg-1)。

不同植被恢復方式與時間的交互效應顯著地影響土壤微生物量氮含量(P<0.05)，但不同植被恢復方式對土壤微生物量氮含量并沒有顯著影響，說明不同植被恢復方式影響土壤微生物量氮的效應隨著恢復時間的增加而逐漸顯現(xiàn)。

2.4 植被恢復對土壤細菌群落的影響

土壤細菌測序共得到1 651 418條堿基，有效序列主要分布于421～460 bp，歸類于6 078個OTU，分屬于39個門、970個綱、189個目、365個科、653個屬和14 170個種。

2.4.1細菌多樣性 通過在門水平測定土壤細菌的多樣性指數(shù)(包括Sobs,Shannon)發(fā)現(xiàn)，不同植被恢復方式對細菌的多樣性指數(shù)均沒有顯著性影響，只有AF和CK間的細菌門數(shù)量差異顯著(P<0.05)(圖4)。

圖4 植被恢復對土壤微生物群落α多樣性的影響(Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù))Fig.4 T-test for α-diversity of soil bacterial community of different restoration approaches注：*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001，下同Note:*,P<0.05,*, P<0.01***, P<0.001,the same as below

2.4.2細菌群落組成 細菌群落以變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)為主，還包括芽單胞菌門(Germatimonadetes)、擬桿菌門(Bacterodietes)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)等(圖5)。其中，補播紫花苜蓿草地中的擬桿菌門細菌占比要顯著地高于無芒雀麥地和自然演替地(P<0.05)，浮酶菌門和裝甲菌門細菌占比顯著地低于無芒雀麥草地和自然演替草地(P<0.05)。

圖5 不同植被恢復方式土壤細菌群落組成差異Fig.5 Composition of soil bacterial community of different restoration approaches at phylum level

將不同處理間的細菌數(shù)據(jù)在OTU水平下進行NMDS分類(stress為0.123<0.2)發(fā)現(xiàn)：3種植被恢復方式下的細菌群落可以很好地分開，并且SB和AF的細菌群落明顯的和CK區(qū)分開(圖6)。采用細菌分型分析也發(fā)現(xiàn)，CK和SB，AF的細菌可以明顯的區(qū)別開。表明3種植被恢復方式對土壤細菌群落的β多樣性影響顯著。

圖6 NMDS分析結果Fig.6 Non-metric multidimensional scaling analysis for β-diversity of soil bacterial community

2.5 不同植被恢復方式對土壤真菌多樣性的影響

土壤真菌測序共得到2 065 637條堿基，有效序列主要分布于221～320 bp，歸類于1 809個OTU，分屬于8個門、29個綱、79個目、167個科、343個屬和606個種。主要包括子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)和壺菌門(chytridiomycota)等真菌。

2.5.1真菌多樣性 在門水平分析不同植被恢復方式下土壤真菌的多樣性指數(shù)(包括sobs，shannon)，如圖7所示，補播紫花苜蓿地和無芒雀麥地的真菌Sobs指數(shù)均顯著地高于自然演替地(P<0.05和0.01)，其中紫花苜蓿地的真菌Sobs指數(shù)最高；土壤真菌香農(nóng)指數(shù)以無芒雀麥草地最高，分別顯著高于自然演替地和補播無芒雀麥草地(P<0.05)。不同植被恢復方式對土壤真菌的多樣性產(chǎn)生了顯著影響。

圖7 真菌多樣性指數(shù)(Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù))Fig.7 T-test for α-diversity of soil fungal community of different restoration approaches

2.5.2真菌群落組成 在門水平對不同處理間的真菌群落相對占比進行差異分析，發(fā)現(xiàn)球囊菌門和unclassified_k這2類真菌的差異顯著，補播無芒雀麥草地要顯著高于補播紫花苜蓿草地和自然演替地(P<0.01，P<0.05)；擔子菌門真菌占比在無芒雀麥草地略高于自然演替地與補播紫花苜蓿地，但差異不顯著。

圖8 真菌群落的組間差異比較Fig.8 Composition of soil bacterial community of different restoration approaches at phylum level

圖9 NMDS分析結果Fig.9 Non-metric multidimensional scaling analysis for β-diversity of soil fungal diversity

NMDS分析結果表明3種處理間的真菌群落能夠明顯的區(qū)分開(stress<0.2)，說明在不同植被恢復方式下，土壤真菌群落的β多樣性差異顯著。

3 討論

3.1 不同恢復植被對植物多樣性的影響

本研究中植物群落物種組成年際間變異較大，但補播紫花苜蓿方式中紫花苜蓿仍然為絕對優(yōu)勢物種。結果表明，補播的紫花苜蓿一定程度上抑制了部分一年生雜草的出現(xiàn)，減少了群落中物種的數(shù)量。AF草地中每個物種占有的生態(tài)位更加充分，物種分布的均勻度變高，是一種積極正向的演替，推動著群落的恢復。由于退化土地原生植被主要以依賴種子庫繁殖的一年生雜類草為主，因此在補播無芒雀麥和紫花苜蓿草地中伴生物種的變化較大，并且在無芒雀麥處理中，無芒雀麥出現(xiàn)了衰退的跡象，其重要值下降了59.5%，這可能是因為無芒雀麥對所在地塊的水分含量和土壤全氮含量要求較高，在不進行人工干預的條件下，會出現(xiàn)一定程度的自疏現(xiàn)象[10,27]。此外，3種處理間多樣性差異可能是由于在無芒雀麥草地(SB)中，無芒雀麥的衰退，導致其它物種(主要是雜類草)的占比增加，一定程度上提高了SB的多樣性指數(shù)。此外，在我國北方農(nóng)牧交錯區(qū)補播無芒雀麥恢復天然草地植被的研究中發(fā)現(xiàn)，其它物種的多樣性顯著地降低，無芒雀麥表現(xiàn)出很強的競爭優(yōu)勢[24-26]。這可能是由于無芒雀麥地下芽庫的潛在更新能力，能夠在一定階段保持恢復群落的穩(wěn)定[18,28-29]。紫花苜蓿由于在建植初期生長較慢，且為直根型多年生牧草，對其它功能群的影響相對較小[30-32]，所以紫花苜蓿群落中一二年生的雜類草相對豐度較高。

3.2 土壤微生物群落多樣性變化分析

土壤細菌和真菌群落經(jīng)過5年時間的植被恢復，其群落β多樣性均出現(xiàn)了顯著地差異。說明在不同優(yōu)勢物種的作用下，微生物群落多樣性的響應變化不一，不同物種可能會影響形成不同的微生物群落，并且這種作用通過影響微生物的物種組成和相對豐度表現(xiàn)出來。這與近年來土壤微生物多樣性與植物相關關系的研究結果相一致，微生物多樣性主要受到地上植物輪作或某種優(yōu)勢物種的調控[33-35]。微生物對地上植被變化的響應也主要表現(xiàn)為某一物種的相對豐度變化，而不是物種多樣性的變化[36-37]。此外，本研究中研究地塊相對集中且采用了區(qū)組隨機設計，土壤異質性的影響相對較小，結果能夠較為真實的反應生物因素(即不同恢復植被)對地下微生物群落的影響。紫花苜蓿和無芒雀麥草地由于草地枯落物的增加，土壤真菌的反應敏感，表現(xiàn)出真菌多樣性和物種數(shù)量的明顯差異；相比于自然演替恢復地真菌中球囊酶屬的占比顯著提升，說明紫花苜蓿和無芒雀麥補播建植后，通過一定時間的恢復演替，各自產(chǎn)生了不同的枯落物積累，對地下真菌群落產(chǎn)生了顯著影響[21,38]，尤其是無芒雀麥草地中球囊酶屬真菌顯著高于其它恢復模式，這可能與無芒雀麥能夠形成特異性的叢枝菌根真菌，加速地下部分養(yǎng)分傳遞有密切關系[22,39]。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)在北京淺山區(qū)退化草地中，經(jīng)過建植無芒雀麥和紫花苜蓿人工草地，土壤微生物量碳、氮含量在植被恢復后顯著高于植被自然演替地；不同植被恢復群落間的土壤細菌和真菌群落的β多樣性有顯著差異。無芒雀麥草地的植物多樣性顯著低于紫花苜蓿草地和對照，但其真菌和細菌的α多樣性差異并不顯著。本研究結果說明了植被恢復對土壤微生物群落產(chǎn)生了顯著地影響，土壤細菌和真菌多樣性對不同優(yōu)勢植物的響應不同。