鄔長(zhǎng)樂(lè)，張軍，何佳琦，李銘楊，于海偉，李珊珊，翟瑩

2個(gè)大豆VOZ轉(zhuǎn)錄因子的克隆及非生物脅迫表達(dá)分析

鄔長(zhǎng)樂(lè)1，2，張軍3，何佳琦1，2，李銘楊1，2，于海偉1，2，李珊珊1，2，翟瑩1，2

（齊齊哈爾大學(xué) 1. 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

為探究大豆維管植物鋅指蛋白（VOZ）轉(zhuǎn)錄因子的序列特征和非生物脅迫表達(dá)模式，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)，在非生物脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行克隆及序列分析．，對(duì)干旱、高鹽、低溫脅迫均存在響應(yīng)，且干旱脅迫下表達(dá)量升高最明顯．位于大豆6號(hào)染色體上，位于大豆13號(hào)染色體上，分別編碼含有478，459個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，它們均含有1個(gè)保守的VOZ結(jié)構(gòu)域．GmVOZ1-1，GmVOZ1-2均含有1個(gè)核定位信號(hào)，預(yù)測(cè)均為細(xì)胞核蛋白．GmVOZ1-1與白羽扇豆LaVOZ的親緣關(guān)系最近，GmVOZ1-2與蒺藜苜蓿MtVOZ的親緣關(guān)系最近．

大豆；VOZ轉(zhuǎn)錄因子；非生物脅迫；表達(dá)分析

植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，能夠及時(shí)應(yīng)對(duì)環(huán)境條件的變化．當(dāng)植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子家族（如NAC，AP2/ERF，MYB，WRKY等）通過(guò)與順式作用元件的特異性結(jié)合進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]．這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用在植物抵御逆境及基因組信息表達(dá)過(guò)程中具有核心作用．維管植物鋅指蛋白（Vascular plant one-zinc finger protein，VOZ）是植物中廣泛存在且特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，它們?cè)谥参镞M(jìn)化過(guò)程中高度保守[2]．VOZ轉(zhuǎn)錄因子最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥中（，），它們與擬南芥基因啟動(dòng)子中的GCGTNx7ACGC回文序列區(qū)結(jié)合，調(diào)控花粉的發(fā)育[3]846-850．

近年來(lái)，VOZ轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)．過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)凍害和干旱脅迫的耐受性降低，但對(duì)真菌的耐受性提高[4]．相反，，雙突變體對(duì)非生物脅迫耐受性增強(qiáng)，但對(duì)生物脅迫的耐受性降低[5]761．后續(xù)研究表明，，還可以分別作為，的轉(zhuǎn)錄抑制子，介導(dǎo)植物響應(yīng)熱脅迫[6-7]．水稻受干旱、高溫、低溫、高鹽等多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的抗性增強(qiáng)[8]23-46．此外，雙突變體的鋁脅迫抗性增強(qiáng)，它們可能作為轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)調(diào)控因子參與水稻抗鋁毒[9]．鹽、干旱、低溫脅迫可以抑制菠蘿，的表達(dá)[10]1228．

大豆是中國(guó)五大農(nóng)作物之一，其抗逆基因的篩選和鑒定對(duì)大豆抗逆基因工程育種具有重要意義．大豆VOZ轉(zhuǎn)錄因子的非生物脅迫抗性研究尚未開(kāi)展．本研究從在線數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得2個(gè)大豆VOZ轉(zhuǎn)錄因子的基因序列，對(duì)它們的非生物脅迫表達(dá)模式及序列特征進(jìn)行了探究，為基因的進(jìn)一步功能鑒定及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆種子（齊齊哈爾地區(qū)種植的北豆9號(hào)）；大腸桿菌DH5菌株，根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株（齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種研究室）．

RNAiso Plus試劑，TB Green Premix ExⅡ酶，pMD18-T克隆載體（Takara公司）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Novoprotein公司）．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆幼苗非生物脅迫處理 使用沙土與草炭土（1∶1）的混合物種植大豆種子，7 d后移入Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，水培至幼苗第1片三出復(fù)葉完全展開(kāi)，進(jìn)行干旱、高鹽、低溫處理．將幼苗移至20%的PEG8000營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行干旱脅迫處理；移至200 mmol/L的NaCl營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行高鹽脅迫處理；移至4 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理．處理過(guò)程中，分別在不同時(shí)間點(diǎn)剪取0.1 g第1片三出復(fù)葉，迅速置于液氮中保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 基因表達(dá)量檢測(cè) 使用RNAiso Plus試劑提取各時(shí)間點(diǎn)樣品并反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA．以cDNA為模板，大豆為內(nèi)參基因[11]，使用TB Green Premix ExⅡ酶，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)VOZ基因的表達(dá)量．qPCR體系反應(yīng)為：2×TB Green Premix ExⅡ酶 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL，補(bǔ)水至總體積20 μL．反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共循環(huán)40次．qPCR引物的設(shè)計(jì)使用Primer Premier 5軟件，引物序列見(jiàn)表1．所有處理進(jìn)行3次重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-△△Ct法．

表1 qPCR和基因擴(kuò)增引物序列

1.2.3 基因克隆 從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/index.php?sp=Gma），NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索并下載大豆VOZ轉(zhuǎn)錄因子的基因及蛋白序列．使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)，的基因擴(kuò)增引物（見(jiàn)表1）．以大豆葉片cDNA為模板，PCR擴(kuò)增，的基因編碼序列．PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸8 min．回收PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T克隆載體，然后送生工生物公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證．

1.2.4 生物信息學(xué)分析 蛋白分子量及等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)使用Expasy在線軟件（https://web.expasy.org/compute_pi/）；亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)使用PSORT在線軟件（https://www.genscript.com/psort.html）；植物VOZ蛋白序列下載于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)；蛋白序列的比對(duì)使用DNAMAN軟件；蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建使用MEGA5軟件．

2 結(jié)果與分析

2.1 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2干旱、高鹽、低溫脅迫表達(dá)分析

從PlantTFDB，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取2個(gè)大豆VOZ轉(zhuǎn)錄因子（Genebank登錄號(hào)分別為XM003527355，XM006594138），分別命名為，，它們的功能均未被鑒定．實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果見(jiàn)圖1．由圖1可見(jiàn)，，對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答最顯著．干旱脅迫處理后，，的表達(dá)量迅速升高，的表達(dá)量在處理2 h時(shí)達(dá)到最大值，的表達(dá)量在處理1 h時(shí)達(dá)到最大值，分別達(dá)到對(duì)照0 h的220倍和106倍（見(jiàn)圖1a）．高鹽脅迫處理后，的表達(dá)量先下降后升高，然后再下降，處理10 h時(shí)達(dá)到最大值，表達(dá)量為對(duì)照的2.2倍；的表達(dá)量在處理1 h后開(kāi)始下降，處理24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低值（見(jiàn)圖1b）．低溫脅迫處理后，，的表達(dá)量均升高，的表達(dá)量在處理5 h時(shí)達(dá)到最大值，表達(dá)量在處理24 h時(shí)達(dá)到最大值，分別達(dá)到對(duì)照的7.1，4.4倍（見(jiàn)圖1c）．

圖1 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2在干旱、高鹽和低溫脅迫下的表達(dá)

2.2 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2克隆及序列分析

分別從大豆葉片cDNA中擴(kuò)增獲得1 437 bp的基因編碼序列，1 380 bp的基因編碼序列（見(jiàn)圖2）．將，分別與克隆載體連接后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄序列一致．

位于大豆6號(hào)染色體上，位于大豆13號(hào)染色體上，它們分別編碼含有478，459個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量分別為54.02，51.16 kD，等電點(diǎn)分別為5.56，5.83．GmVOZ1-1，GmVOZ1-2的氨基酸序列相似度達(dá)到47.62%，它們均含有1個(gè)保守的VOZ結(jié)構(gòu)域（GmVOZ1-1氨基酸序列的235-451位；GmVOZ1-2氨基酸序列的193-410位）．亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GmVOZ1-1，GmVOZ1-2的VOZ結(jié)構(gòu)域中均含有1個(gè)核定位信號(hào)，均為細(xì)胞核蛋白（見(jiàn)圖3）．

圖2 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2基因的PCR擴(kuò)增

注：M為DNA分子量標(biāo)記物2000；1為的PCR擴(kuò)增；2為的PCR擴(kuò)增．

圖3 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2的氨基酸序列比對(duì)

注：方框代表預(yù)測(cè)的核定位信號(hào)；下劃線代表VOZ結(jié)構(gòu)域．

2.3 GmVOZ1-1，GmVOZ1-2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

將GmVOZ1-1，GmVOZ1-2與其它植物中的VOZ蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化關(guān)系見(jiàn)圖4．由圖4可見(jiàn)，GmVOZ1-1與白羽扇豆LaVOZ的親緣關(guān)系最近，GmVOZ1-2與蒺藜苜蓿MtVOZ的親緣關(guān)系最近，這些VOZ蛋白均來(lái)自豆科植物．

圖4 植物VOZ蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

VOZ轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物應(yīng)答非生物脅迫已在擬南芥[4-7]、水稻[8-9]、菠蘿[10]中得到鑒定．序列分析顯示，GmVOZ1-1，GmVOZ1-2的氨基酸序列中均含有1個(gè)保守的VOZ DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域也具有蛋白質(zhì)二聚化功能[3]846．轉(zhuǎn)錄因子一般定位在細(xì)胞核中行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能．如齒肋赤蘚具有核定位潛力及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[12]．在GmVOZ1-1，GmVOZ1-2的氨基酸序列中均預(yù)測(cè)到1個(gè)核定位信號(hào)，因此推測(cè)它們?yōu)榧?xì)胞核蛋白．GmVOZ1-1與LaVOZ的親緣關(guān)系最近，GmVOZ1-2與MtVOZ的親緣關(guān)系最近，推測(cè)這2個(gè)同樣來(lái)自豆科植物的VOZ轉(zhuǎn)錄因子也存在響應(yīng)非生物脅迫的可能性．

，能夠在大豆幼苗中應(yīng)答干旱、高鹽、低溫脅迫，推測(cè)它們的啟動(dòng)子中應(yīng)該含有與脅迫相關(guān)的順式作用元件或與逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)[13]．，在非生物脅迫下的表達(dá)量均具有升高的趨勢(shì)，尤其在干旱脅迫下它們的表達(dá)量升高非常明顯，由此推測(cè)，在大豆中可能正調(diào)控非生物脅迫．這種調(diào)控方式前人也有報(bào)道，如水稻正調(diào)控水稻的鹽脅迫抗性[8]46，擬南芥正調(diào)控?cái)M南芥的鹽脅迫抗性[14]．此外，VOZ轉(zhuǎn)錄因子在植物生物脅迫響應(yīng)途徑中一般也發(fā)揮正調(diào)控的作用[4-5]．VOZ轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物抗逆性的影響主要通過(guò)調(diào)控靶基因?qū)崿F(xiàn)．如，對(duì)鹽脅迫抗性的正調(diào)控是通過(guò)直接或間接的調(diào)控大量鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但在低溫脅迫下它們則負(fù)調(diào)控等逆境相關(guān)基因的表達(dá)[5]762-766．后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步對(duì)，的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行抗性鑒定，并探索它們?cè)谀婢承盘?hào)網(wǎng)絡(luò)中的作用及機(jī)制，從而豐富大豆抗逆基因資源．

[1] Yoon Y，Seo D H，Shin H，et al．The role of stress-responsive transcription factors in modulating abiotic stress tolerance in plants[J]．Agronomy，2020，10（6）：788．

[2] Yasui Y，Mukougawa K，Uemoto M，et al．The phytochrome-interacting vascular plant one-zinc finger1 and VOZ2 redundantly regulate flowering in[J]．The Plant Cell，2012，24（8）：3248-3263．

[3] Mitsuda N，Hisabori T，Takeyasu K，et al．VOZ：isolation and characterization of novel vascular plant transcription factors with a one-zinc finger from[J]．Plant and Cell Physiology，2004，45（7）：845-854．

[4] Nakai Y，F(xiàn)ujiwara S，Kubo Y，et al．Overexpression ofconfers biotic stress tolerance but decreases abiotic stress resistance in[J]．Plant Signaling & Behavior，2013，8（3）：e23358．

[5] Nakai Y，Nakahira Y，Sumida H，et al．Vascular plant one-zinc-finger protein 1/2 transcription factors regulate abiotic and biotic stress responses in[J]．The Plant Journal，2013，73（5）：761-775．

[6] Koguchi M，Yamasaki K，Hirano T，et al．Vascular plant one-zinc-finger protein 2 is localized both to the nucleus and stress granules under heat stress in[J]．Plant Signaling & Behavior，2017，12（3）：e1295907．

[7] Song C，Lee J，Kim T，et al．VOZ1，a transcriptional repressor of DREB2C，mediates heat stress responses in[J]．Planta，2018，247（6）：1439-1448．

[8] 談存梅．水稻基因的克隆與功能分析[D]．雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014．

[9] 朱海鳳．水稻和蕎麥抗鋁毒轉(zhuǎn)錄因子ART1調(diào)控機(jī)制的研究[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016．

[10] 夏楊，蘇初連，晁駿，等．菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子序列特征及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)[J]．西北植物學(xué)報(bào)，2018，38（7）：1228-1234．

[11] Qiu S，Zhang J，He J，et al．Overexpression of，a soybean galactinol synthase gene，enhances transgenic tobacco drought tolerance[J]．Plant Cell Tissue and Organ Culture，2020，143（3）：507-516．

[12] 高貝，李小雙，張道遠(yuǎn)．基于HMM的齒肋赤蘚VOZ轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)與分析[J]．生物信息學(xué)，2014，12（2）：77-83．

[13] 孫孟思．?dāng)M南芥基因在非生物脅迫中的功能研究[D]．長(zhǎng)沙：湖南大學(xué)，2018．

[14] Prasad K，Xing D，Reddy A．Vascular plant one-zinc-finger （VOZ）transcription factors are positive regulators of salt tolerance in[J]．International Journal of Molecular Sciences，2018，19（12）：3731．

Clone and expression analysis of two VOZ transcription factors in soybean under abiotic stress

WU Changle1，2，ZHANG Jun3，HE Jiaqi1，2，LI Mingyang1，2，YU Haiwei1，2，LI Shanshan1，2，ZHAI Ying1，2

（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；3. BranchofAnimalHusbandryandVeterinaryofHeilongjiangAcademyof AgriculturalSciences，Qiqihar 161005，China）

In order to investigate the sequence characteristics of VOZ transcription factors in soybean and their expression patterns under abiotic stress，the expression levels of，under abiotic stress were detected by real-time fluorescence quantitative PCR，and the gene cloning and sequence analysis were also carried out．，responded to drought，salt and cold stresses，and their expression levels increased most obviously under drought stress．was located on chromosome 6 of soybean and encoded a protein containing 478 amino acids．was located on chromosome 13 of soybean and encoded a protein containing 459 amino acids．The amino acid sequences of GmVOZ1-1，GmVOZ1-2 both contained a conserved VOZ domain．GmVOZ1-1 and GmVOZ1-2 both contained a nuclear localization signal，which were predicted to be nuclear proteins．GmVOZ1-1 was most closely related to LaVOZ of，and GmVOZ1-2 was most closely related to MtVOZ of．

soybean；VOZ transcription factor；abiotic stress；expression analysis

Q37

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.06.014

1007-9831（2022）06-0080-05

2022-02-26

齊齊哈爾大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202110232163）；黑龍江省省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（145109506）；齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2020041）

鄔長(zhǎng)樂(lè)（2001-），男，河南信陽(yáng)人，在讀本科生．E-mail：wuchanglevip@icloud.com

翟瑩（1982-），女，吉林省吉林人，教授，博士，從事大豆分子遺傳育種研究．E-mail：fairy39809079@126.com