張 杰，趙洋溢，林 靜，羅 蓮，楊 爽，陳安均，劉興艷

（四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安 625000）

【研究意義】藍莓（Vaccinium spp.）屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，起源于北美，目前全世界約有400 多種藍莓，主要分布于北美、南美、東南亞、歐洲等地區(qū)[1]。2020 年中國藍莓總產(chǎn)量為34.72萬噸，其中四川省藍莓種植面積僅次于貴州、遼寧、山東，位居全國第四，總產(chǎn)量為5萬噸，僅次于貴州，位居全國第二。藍莓鮮果呈藍色，近圓形，果肉細膩，果皮柔軟，果實中干物質(zhì)含量高，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)，同時也是膳食纖維的良好來源[2]，具有減少心血管疾病，預防老年癡呆，促進視紅素的再合成，治療肥胖癥、Ⅱ型糖尿病和慢性炎癥等功效[3]。藍莓屬小漿果型水果，由于自身果實小，皮薄等特點，其鮮果不易運輸和貯存，貨架期一般不超過半個月，因此藍莓除鮮食外，常被用來加工成藍莓酒、藍莓蜜餞、藍莓干、藍莓汁等多種產(chǎn)品，以延長其貨架期，提高藍莓產(chǎn)品的附加值?！厩叭搜芯窟M展】藍莓酒是將藍莓鮮果或凍果經(jīng)過破碎、發(fā)酵、陳釀等工藝流程釀制而成的發(fā)酵酒[4]，它不僅具有藍莓發(fā)酵產(chǎn)生的特殊香氣，還富含花色苷(anthocyanins，ACNs）、有機酸（Organic acid）等生物活性物質(zhì)。藍莓酒的品質(zhì)主要受到藍莓品種、酵母菌株、主發(fā)酵工藝、陳釀條件等環(huán)節(jié)的影響，其中主發(fā)酵工藝對藍莓酒的品質(zhì)至關(guān)重要。Yan 等[5]采用響應面法優(yōu)化藍莓酒發(fā)酵參數(shù)，得到主發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵溫度22.65 ℃，初始pH 值3.53，酵母接種量7.37 g/L，在此條件下發(fā)酵的藍莓酒酒精度為7.63%vol、揮發(fā)酸為0.34 g/L；劉彩婷等[6]優(yōu)化了藍莓酒發(fā)酵工藝，使得優(yōu)化后的藍莓酒花色苷(ACNs）保存率達到了64.4%?！颈狙芯壳腥朦c】“DV10”為本實驗室前期所篩選的具有較強花色苷(ACNs）保留能力的優(yōu)勢商業(yè)酵母，目前對于該酵母在藍莓酒中發(fā)酵條件的研究還鮮有報道，對酒體中高級醇及揮發(fā)性風味物質(zhì)的分離鑒定可以為藍莓酒風味品質(zhì)的控制提供數(shù)據(jù)支撐?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗以“萊格西”藍莓為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗對主發(fā)酵工藝參數(shù)進行優(yōu)化，篩選出最佳主發(fā)酵工藝參數(shù)，在此條件下，采用GC、GS-MS 對藍莓酒中高級醇及揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類與含量進行分析，以期為藍莓果酒的生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藍莓：品種為“萊格西”，購買于雅安石棉縣大坪子高山生態(tài)藍莓園，充分成熟，采收后立即運回實驗室，于-18 ℃保存；“DV10”酵母，購于法國拉曼公司。

氫氧化鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸、氯化鈉、福林酚、碳酸鈉、氯化鉀、鹽酸、醋酸鈉、磷酸二氫鈉（二水）、磷酸氫二鈉（十二水）、鐵氰化鉀、三氯化鐵（六水）、三氯乙酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、焦性沒食子酸（均為分析純）、ABTS（2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯丙二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽）、過硫酸鉀、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）（均為分析純），成都市科隆化學品有限公司；甲醇、無水乙醇（色譜純），成都市科隆化學品有限公司；叔戊醇（標準品），上海易恩化學技術(shù)有限公司；乙酸正丁酯、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、苯乙醇（色譜純），上海晶純生化科技股份有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級），煙臺帝仕伯自釀機有限公司。

1.2 儀器與設備

SHP 型生化恒溫培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Varioskan Flash 熒光酶標儀，美國Thermo 公司；pH 計（PHS-3C 型），上海精密科學儀器有限公司；1 μL 微量進樣器（W-3 型），上海安亭微量進樣器廠；50/30 μmUM DVB/CAR on PDMS 萃取頭、固相微萃取手動進樣手柄，上海安譜實驗科技股份有限公司；氣相色譜儀（7890B 型）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A/59750 型），美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓酒主發(fā)酵工藝流程 基本工藝流程：冷凍藍莓果→挑選→解凍→打漿→調(diào)整成分（添加偏重亞硫酸鉀、蔗糖、碳酸鈣）→接種酵母→裝罐→主發(fā)酵→倒罐→陳釀→成品酒。

藍莓解凍打漿后，加入80 mg/L SO2，室溫密封放置3 h，加入蔗糖調(diào)整糖度為22°Brix，添加碳酸鈣調(diào)整pH 值為3.5；干酵母DV10 的用量為0.4 g/L，加入10 倍體積的5%蔗糖溫水，37 ℃活化30 min，接種后于設定溫度下進行恒溫發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，倒罐除去酒腳，加入40 mg/L SO2，于20 ℃下陳釀30 d。

1.3.2 指標的測定 （1）還原糖、總酸、揮發(fā)酸：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[7]進行測定；酒精度采用GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》[8]進行測定；可溶性固形物（total soluble solid，TSS）用手持糖度計測定；pH 用酸度計測定；總酚：采用Folin-Ciocalteus 法[9]測定；總黃酮：采用硝酸鋁絡合法[9]測定；花色苷：采用pH 示差法[9]測定。

（2）抗氧化活性：DPPH 自由基清除率的測定參考李安等[10]的方法；ABTS+自由基清除能力、Fe3+還原能力的測定參考孔燕等[11]的方法。

（3）高級醇的測定：參照蔣成等[12]的測定方法，采用GC-FID 進行藍莓酒中高級醇的測定，具體如下：

混合標準溶液的配制：準確稱取稱取乙酸正丁酯0.800 0 g 于100 mL 容量瓶，正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、苯乙醇標準品0.640 0 g 于100 mL 容量瓶，用20%乙醇溶液定容配制成乙酸正丁酯貯備液和混合標準溶液貯備液，將混合標準溶液貯備液進行梯度稀釋，配制成6 種高級醇含量均為20.00，40.00，80.00，160.00，320.00，640.00 mg/L 的混合標準液，不同梯度混合標準液中均含有80.00 mg/L的乙酸正丁酯。

樣品處理：取10 mL 藍莓酒樣品，加入乙酸正丁酯，使乙酸正丁酯質(zhì)量濃度為80.00 mg/L，混勻后取1 μL 進行GC-FID分析。

GC-FID 條件：采用30 m×0.250 mm 的HP-INNOWAX 色譜柱；初始溫度為40 ℃，保持4 min 后，以3.5 ℃/min升至170 ℃，以20 ℃/min升至200 ℃保持10 min；進樣量：1 μL；分流比：50∶1；分流流量50 mL/min；空氣流量400 mL/min；H2流量30 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min。

定量分析：以高級醇峰面積與乙酸正丁酯峰面積比值作為縱坐標，高級醇標準品質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中高級醇的含量。

（4）揮發(fā)性風味化合物的測定：使用HS-SPME-GC/MS 對藍莓酒中的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行測定，參考劉方括等[13]的方法略作修改，具體如下。

萃取條件：取5.0 mL藍莓酒樣，加入20 μL環(huán)己酮（14 g/L）作為內(nèi)標物，混合均勻后，取4 mL于15 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl，在水浴鍋中50 ℃平衡10 min，將SPME 手動進樣柄（萃取頭型號：50/30 μm PDMS/DVB/CAR）插入進樣瓶中，50 ℃萃取30 min，取出萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，解析5 min后取出。

GC 條件：HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），不分流進樣，柱溫采用程序升溫，40 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至90 ℃保持1 min，再以1 ℃/min升至100 ℃保持3 min，再以2 ℃/min升至120 ℃保持1 min，最后以6 ℃/min升至250 ℃。進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min。

MS 條件：電離方式EI，電離電壓70 eV，燈絲電流0.25 mA，電子倍增器電壓為1 500 V，掃描范圍30～350 m/z。

定性分析：通過檢索工作站自帶的NIST11標準譜庫定性，選擇匹配度≥70%的物質(zhì)為有效物質(zhì)。

定量分析：采用內(nèi)標法進行半定量分析，計算公式為：待測揮發(fā)性物質(zhì)濃度=內(nèi)標物質(zhì)濃度/內(nèi)標物質(zhì)峰面積×待測揮發(fā)性物質(zhì)峰面積。

（5）感官評分：具體方法參照GB/T 32783—2016《藍莓酒》[14]和劉彩婷等[6]的方法，由四川農(nóng)業(yè)大學食品學院15 名經(jīng)過培訓的具有一定感官評定經(jīng)驗的評定員，對藍莓酒進行感官評價，評價指標、標準如表1 所示。

表1 藍莓果酒感官評分標準Tab.1 Sensory evaluation standards of blueberry wine

1.3.3 藍莓果酒主發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化 按照1.3.1工藝流程進行發(fā)酵試驗，固定基礎(chǔ)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度24 ℃，初始pH 值3.3，酵母接種量0.4 g/L，SO2添加量80 mg/L。分別設置酵母接種量為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 g/L；發(fā)酵溫度為20，22，24，26，28 ℃；初始pH 值為3.1、3.3、3.5、3.7、3.9；SO2添加量為40，60，80，100，120 mg/L。發(fā)酵結(jié)束后測定基礎(chǔ)理化指標、花色苷、總酚、總黃酮及抗氧化活性，以探究酵母接種量、發(fā)酵溫度、初始pH值、SO2添加量對藍莓果酒品質(zhì)的影響。

1.3.4 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取初始pH 值（A）、SO2添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、酵母接種量（D）這4 個因素，采用L9（34）進行4 因素3 水平正交試驗，分別以花色苷含量、感官評分為評價指標，篩選出最佳主發(fā)酵工藝參數(shù)。試驗因素水平表見表2。

表2 正交試驗因素水平表Tab.2 Factors and levels in orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8.0、SPSS 22.0 軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析，P＜0.05，差異顯著，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 初始pH 值對藍莓果酒品質(zhì)的影響 pH 值是影響果酒發(fā)酵的重要因素之一，適宜微酸性環(huán)境可以抑制果酒發(fā)酵期間雜菌的代謝活性，有助于保持酵母的優(yōu)勢生長；pH 值太低，雖能起到抑制有害微生物的作用，但會影響酵母發(fā)酵，還會促使乙酸酯的水解，影響果酒的口感；pH 值過高則會導致花色苷的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得果酒的顏色下降，嚴重影響果酒的品質(zhì)。初始pH值對藍莓果酒品質(zhì)的影響，具體見表3、圖1和圖2。

圖1 初始pH值對藍莓酒中酚類物質(zhì)的影響Fig.1 Effects of initial pH value on phenolic compounds of blueberry wine

表3 初始pH值對藍莓酒理化指標的影響Tab.3 Effects of initial pH value on physicochemical indicators of blueberry wine

由表3可知，隨著初始pH值的增加，酒精度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，初始pH值為3.5時，酒精度達到最高，為12.31%vol。發(fā)酵液pH 值的不同可以導致酵母細胞表面帶電狀態(tài)不同，進而影響糖、酒精和二氧化碳通過細胞壁的傳質(zhì)、傳熱過程，影響細胞的生長和代謝[15]，因此過高與過低的pH 值都不利于酵母菌的生長?？偹岬暮侩S著初始pH 值的增加而降低，當pH 值為3.1時，總酸的含量達到16.46 g/L，此時的藍莓酒刺激性酸味突出，口感較差；pH 值為3.3時，藍莓酒感官評分最高，隨著pH 值的增加，感官評分逐漸下降，這是由于pH 值的上升會導致藍莓酒的顏色損失，色度下降。由圖1 可知，花色苷含量隨發(fā)酵醪液初始pH 值的增加而顯著降低，在酸性溶液中，當pH 值＜2 時，花色苷主要以紅色的黃烊陽離子形式存在，當pH值為3～6時，黃烊陽離子被水親核攻擊而水合，濃度下降，使花色苷主要以無色的甲醇假堿和查爾酮假堿的形式存在，導致藍莓酒的顏色變淺[16]；當pH 值為3.1 時，花色苷的含量達到最高為100.04 mg/L，這可能是藍莓酒花色苷色素在pH 3.0 左右穩(wěn)定性較好[10]。由圖2 可知，隨著pH 值的增加，還原鐵能力、DPPH自由基清除率及ABTS自由基清除能力均呈現(xiàn)出下降趨勢，這可能是由于花色苷具有抗氧化的作用，隨著其含量的下降，藍莓酒的抗氧化能力也隨之降低，焦揚等[17]發(fā)現(xiàn)果酒中花色苷的含量與ABTS 自由基清除能力及DPPH 自由基清除率呈正相關(guān)。綜上，當pH 值為3.1 時，其花色苷含量及抗氧化能力最高，但此時藍莓酒口感較差，pH 值為3.3時，酒精度與pH 值為3.5時差異不顯著，且感官評分最高，故認為本次試驗3.3為最佳pH值。

圖2 初始pH值對藍莓酒抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of initial pH value on antioxidant activity of blueberry wine

2.1.2 SO2添加量對藍莓果酒品質(zhì)的影響 在果酒發(fā)酵過程中添加適量的SO2具有抑制雜菌、抗氧化、澄清、增酸作用，并且能防止褐變，保持原果香味和果酒酒色。SO2添加量不足時，不僅無法抑制雜菌生長、也無法延緩果酒中多酚、單寧、色素等物質(zhì)的氧化[4]，導致酒體氧化渾濁過早褐變，從而破壞酒體的色澤。但SO2添加過量時，一方面會在酸性條件下形成HSO3-，與花色苷的C2或C4位置親核形成無色的花色苷亞硫酸鹽復合物[18]，導致果酒的顏色衰退，另一方面，若添加量超過國標所規(guī)定的250 mg/L，還會對人體產(chǎn)生危害。因此，果酒生產(chǎn)中常會探討SO2的適宜添加量。

由表4可知，當SO2添加量為40 mg/L時，酒精度最低，這可能是由于較低的SO2添加量雖抑制了雜菌的生長，但對其抑制較??；當添加量為60～120 mg/L 時，酒精度無顯著差異（P＞0.05）；添加SO2對pH 值無顯著影響（P＞0.05），這與袁夢等[19]的研究結(jié)論一致；總酸的含量隨著SO2添加量的增加而提高，一方面，SO2可在基質(zhì)中轉(zhuǎn)化為酸，另一方面，SO2可一定程度地抑制分解酒石酸，蘋果酸的細菌，又可與酒石酸的鉀鈣等鹽作用，使它們的酸游離，增加了總酸的含量[20]；由圖3可知，總酚與總黃酮的含量與SO2添加量存在正相關(guān)趨勢，花色苷的含量在添加量為100 mg/L 時達到最高，為69.36 mg/L，隨著添加量繼續(xù)增加，藍莓酒中的花色苷含量顯著降低，過多的游離SO2會與花色苷形成新的無色復合物物質(zhì)，也可能是同鄰醌結(jié)合形成無色二酚，從而抑制鄰醌生成褐色素非酶氧化縮合反應[21]，并且SO2還具有漂白的作用，使得藍莓酒的顏色下降。由圖4可看出，鐵還原能力、DPPH 自由基清除率及ABTS自由基清除能力均隨添加量的增加而提高，這可能是SO2抑制了酒體中多酚氧化酶活性，減少多酚類物質(zhì)的氧化，從而使得藍莓酒的抗氧化能力提高。綜上，100 mg/L 的添加量感官評分、酒精度及花色苷含量最高，故本次試驗的最佳SO2添加量為100 mg/L。

表4 SO2添加量對藍莓酒理化指標的影響Tab.4 Effects of SO2 on physicochemical indicators of blueberry wine

圖3 SO2添加量對藍莓酒中酚類物質(zhì)的影響Fig.3 Effect of SO2added content on antioxidant activity of blueberry wine

圖4 SO2添加量對藍莓酒抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of SO2added content on antioxidant activity of blueberry wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對藍莓果酒品質(zhì)的影響 發(fā)酵溫度是影響果酒品質(zhì)的重要因素。溫度過高，會導致酵母生長代謝加快，細胞衰老過快，氧化損失加大，加快花色苷的分解，還會引起高級醇、揮發(fā)酸、醛類等副產(chǎn)物增加[22]；溫度過低，酵母生長緩慢，發(fā)酵周期長，不利于酒精的積累，酶活也會受到一定的影響。

由表5 可知，酒精度的含量隨著溫度的上升逐漸下降，說明酵母過早的老化，代謝能力下降，進而酒精度較低；溫度對于pH值和總酸的含量影響較小；揮發(fā)酸的含量與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)趨勢，這表明過高的溫度可能會引起揮發(fā)酸的積累；發(fā)酵溫度為22℃時藍莓酒感官評分最高為78.38 分，這可能是由于較低的發(fā)酵溫度風味損失較小，口味純正，香味協(xié)調(diào)；由圖5 可知，20 ℃和22 ℃下，總酚與總黃酮的含量顯著均高于其它溫度（P＜0.05），可見溫度越高越不利于酚類物質(zhì)的生成和累積[23]；花色苷的含量與溫度呈現(xiàn)出負相關(guān)的趨勢，高溫會造成氧化損失加大，且酒精度的降低不利于花色苷的浸出[10]。由圖6可知，鐵還原能力、DPPH自由基清除率及ABTS自由基清除能力均隨發(fā)酵溫度的升高而下降，這也證實了溫度過高會加快氧化損失這一觀點?？紤]到低溫發(fā)酵周期較長，且22 ℃下的總酚、總黃酮及抗氧化能力與20 ℃無顯著差異，綜上，認為22 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對藍莓酒中酚類物質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on antioxidant activity of blueberry wine

圖6 發(fā)酵溫度對藍莓酒抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on antioxidant activity of blueberry wine

表5 發(fā)酵溫度對藍莓酒理化指標的影響Tab.5 Effects of fermentation temperature on physicochemical indicators of blueberry wine

2.1.4 酵母接種量對藍莓果酒品質(zhì)的影響 酵母是果酒酒精發(fā)酵過程中最關(guān)鍵的因素，其接種量的高低嚴重影響著發(fā)酵周期和發(fā)酵進程。適宜的酵母接種量可以促進酒精發(fā)酵的啟動和代謝產(chǎn)物的生成，也能降低雜菌的污染，過高會導致酵母迅速繁殖，產(chǎn)生過多的代謝副產(chǎn)物[15]，影響發(fā)酵的過程，使得果酒產(chǎn)生異味，從而導致其整體品質(zhì)的下降。

由表6 可知，隨著接種量的增加，酒精度先上升后下降，當接種量超過0.4 g/L 時，酒精度達到最大值，為12.26%vol，可見較高或較低的接種量均不利于酵母的酒精積累；接種量對于藍莓酒pH 值無顯著影響（P＞0.05），對總酸及揮發(fā)酸的含量的影響不大；接種量為0.4 g/L 時，感官得分最高，此時藍莓酒口感、色澤、香氣較好，當接種量為0.6 g/L 時，由于酵母迅速繁殖，產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物，破壞了酵母菌群的發(fā)酵環(huán)境致使提前衰老并發(fā)生自溶的現(xiàn)象，增強了藍莓酒的“酵母”味[24]，從而導致感官得分最低；由圖7 可知，接種量的為0.4 g/L，總酚、總黃酮及花色苷的含量達到最高，隨著接種量的增加，其含量顯著降低，這可能是由于酵母后期產(chǎn)生大量次級代謝產(chǎn)物，其多酚類化合物與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合或吸附，使致酒液中總酚下降[25]；由圖8 可知，DPPH 自由基清除率與還原鐵能力隨接種量的增加呈現(xiàn)出先升后下降的趨勢，接種量為0.4 g/L 時達到最大，而接種量對于ABTS 自由基清除能力的影響較小，綜上，選擇0.4 g/L為最佳的酵母接種量。

表6 酵母接種量對藍莓就理化指標的影響Tab.6 Effects of yeast inoculation on physicochemical indicators of blueberry wine

圖7 酵母接種量對藍莓酒中酚類物質(zhì)的影響Fig.7 Effect of yeast inoculation on antioxidant activity of blueberry wine

圖8 酵母接種量對藍莓酒抗氧化活性的影響Fig.8 Effect of yeast inoculation on antioxidant activity of blueberry wine

2.2 正交試驗結(jié)果

選取初始pH 值、SO2添加量、發(fā)酵溫度、酵母接種量為考察因素，以花色苷、感官評分為評價指標，對藍莓酒主發(fā)酵工藝參數(shù)進行L9（34）正交優(yōu)化，確定出藍莓酒的最佳主發(fā)酵工藝參數(shù)。藍莓酒正交試驗結(jié)果見表7。

表7 正交試驗設計及結(jié)果Table 7 Experimental design and results of the orthogonal array design

由極差大小可知各主發(fā)酵工藝參數(shù)對花色苷含量的影響程度大小關(guān)系為：A、B、C、D，即初始pH 值影響最大，其次為SO2添加量和發(fā)酵溫度，影響最小的是酵母接種量；從K 值可得出，最佳的主發(fā)酵條件為：A1B3C2D2，即初始pH 值為3.1、SO2添加量為120 mg/L、發(fā)酵溫度為22 ℃、酵母接種量為0.4 g/L。以感官評分為評價指標時，各因素影響發(fā)酵結(jié)果的主次順序為：初始pH 值、發(fā)酵溫度、酵母接種量、SO2添加量，最佳主發(fā)酵工藝參數(shù)組合為A1B3C3D3，為正交試驗設計中的3 號組合，即初始pH 值為3.1、SO2添加量為120 mg/L、發(fā)酵溫度為24 ℃、酵母接種量為0.5 g/L。以A1B3C2D2組合進行驗證試驗，重復3 次，結(jié)果表明，花色苷含量為（103.23±2.32）mg/L，感官評分為81.25，均低于A1B3C3D3組合，最終確定最佳主發(fā)酵工藝參數(shù)組合為A1B3C3D3，即初始pH 值為3.1、SO2添加量為120 mg/L、發(fā)酵溫度為24 ℃、酵母接種量為0.5 g/L，在此優(yōu)化條件下，花色苷含量為（110.78±3.56）mg/L，感官評分為82.54。釀造而成的藍莓酒果香味明顯，酒味純正、協(xié)調(diào)，香氣豐富，酒體清澈透明。

2.3 最佳主發(fā)酵工藝參數(shù)下藍莓酒品質(zhì)分析

2.3.1 高級醇 含有3個及3個以上碳原子一元醇結(jié)構(gòu)的醇類，稱為高級醇（雜醇油），主要包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、苯甲醇等醇類[26]。本試驗對藍莓酒中的正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、正戊醇、苯乙醇這6種高級醇的含量進行測定，由表8可知，從藍莓酒中共檢測出4種高級醇，總量為252.98 mg/L，分別為異戊醇、正丙醇、正丁醇、苯乙醇，異丁醇及正戊醇均未在酒樣中檢出；其中異戊醇的含量顯著高于正丙醇、正丁醇及苯乙醇，為133.43 mg/L，可見異戊醇是藍莓酒中主要的高級醇，對藍莓酒感官風味的影響貢獻較大，這與De-La-Fuente-Blanco 等[27]的研究結(jié)論一致；異戊醇是由葡萄糖經(jīng)糖代謝生成丙酮酸，接著轉(zhuǎn)化為α-酮異己酸，再由α-酮異己酸形成異戊醛，還原為異戊醇[28]，其含量超過30 mg/L時，可以為藍莓酒帶來草本味；正丁醇、正丙醇的含量分別為59.72，32.28 mg/L；苯乙醇的含量最低，為27.55 mg/L，它主要是由苯丙氨酸通過轉(zhuǎn)氨基作用在氨基酸分解代謝途徑中合成的，當含量超過14 mg/L 時，可以使得藍莓酒具有明顯玫瑰花香、甜香及蜂蜜香。

表8 藍莓酒高級醇含量Tab.8 Higher alcohol conten of blueberry wine

2.3.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)分析 采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)對藍莓酒中的揮發(fā)性風味化合物進行了定性定量分析，結(jié)果如表9。藍莓酒中共檢測出了28種揮發(fā)性風味化合物，根據(jù)揮發(fā)性風味化合物成分的類型可分為酯類、萜烯類、醇類、酚類和酸類5 個類別，其中酯類10 種，萜烯類9 種，醇類3 種，酚類3 種、酸類2 種，酯類物質(zhì)的占比最多，其他類別依次為醇類、萜烯類、酚類、酸類。酯類物質(zhì)是藍莓酒中的主要呈香物質(zhì)，主要來源于果實及果酒發(fā)酵階段，賦予藍莓酒令人愉悅的花香、果香[29]，增加酒體的復雜性、多樣性。本研究中，酯類物質(zhì)的含量最高，約占香氣物質(zhì)總量的49.24%，含量較高的前4 種酯類物質(zhì)依次為正己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯，正己酸乙酯的含量為131 196.52 μg/L，占到酯類物質(zhì)總量的73.78%，表明正己酸乙酯是藍莓酒中主要的酯類呈香物質(zhì)，這與劉方恬等[13]的研究結(jié)論一致；正己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯這4 種物質(zhì)均具有典型的水果香型，可以增加酒體的果香型風味。醇類化合物是酵母通過糖分解代謝或脫羧反應和氨基酸的脫氨基作用形成的代謝產(chǎn)物[30]，適宜濃度的醇類物質(zhì)可以促進酯類物質(zhì)香氣成分的散發(fā)，使得酒體風味更加飽滿。本試驗檢測出了3 種醇類物質(zhì)，分別為異戊醇、苯乙醇、1-辛醇，異戊醇是藍莓酒中含量最高的醇類物質(zhì)，具有酒精味、澀味，苯乙醇使得酒體具有玫瑰花香的氣味。萜烯類化合物是果酒品種香氣的主要貢獻者，一般以糖苷形式存在于果實中，發(fā)酵過程中經(jīng)酸解或酶解釋放出游離態(tài)的揮發(fā)性風味物質(zhì)，該類物質(zhì)香氣閾值較低，即使在較低濃度下對果酒香氣也有較大貢獻[31]，由表9 可知，藍莓酒中共檢測出9 種萜烯類物質(zhì)，約占香氣物質(zhì)總量的15.92%，其中芳樟醇、β-香茅醇的含量較高，分別為29 590.03 μg/L、10 372.98 μg/L，表明芳樟醇、β-香茅醇可能是“萊格西”藍莓的主要品種香氣物質(zhì)，芳樟醇具有溫和優(yōu)雅的花香、熏衣草香，β-香茅醇具有令人愉快的玫瑰香、甜香。酚類和酸類物質(zhì)分別檢測出了3 種、2 種，占到香氣物質(zhì)總量的1.81%、1.18%，丁香酚是含量最高的酚類物質(zhì)，具有丁香味、辛香味；正癸酸約占酸類物質(zhì)的98.04%，具有脂肪味，脂肪酸類物質(zhì)在濃度較低時呈奶油和奶酪香，濃度太高則會產(chǎn)生酸澀味和腐臭味。

表9 藍莓酒中揮發(fā)性風味化合物的含量與風味特征Tab.9 Contents and flavor characteristics of volatile compounds identified in blueberry wine

3 結(jié)論與討論

果酒的風格和品質(zhì)是在合適的主發(fā)酵條件下通過酵母作用將原料本身的特性盡可能地體現(xiàn)在成品酒中，但在實際發(fā)酵過程中，即使篩選并接種了合適的酵母，若生長環(huán)境不適宜，其繁殖及發(fā)酵情況也會受到很大的影響，釀造而成的藍莓酒會缺乏新鮮的果香，酒質(zhì)不細膩，并且顏色及功能性成分損失也會很大。因此，為了獲得品質(zhì)優(yōu)良的藍莓酒，對主發(fā)酵工藝參數(shù)進行優(yōu)化，將酵母的生長環(huán)境控制在最佳狀態(tài)，才能穩(wěn)定和提高藍莓酒的質(zhì)量[32]。本研究通過單因素及正交試驗得到藍莓果酒的最佳主發(fā)酵參數(shù)為初始pH 值為3.1、SO2添加量為120 mg/L、發(fā)酵溫度為24 ℃、酵母接種量為0.5 g/L，在此條件下藍莓酒中花色苷含量可達（110.78±3.56）mg/L，感官評分為82.54，酒體呈紫紅色，清澈有光澤，果香味明顯，酒味純正、協(xié)調(diào)，香氣豐富，試驗結(jié)果為藍莓酒釀造工藝的改進提供了科學依據(jù)。

高級醇是果酒中主要的呈香物質(zhì)，可以增加酒體的果香和花香以及香氣的復雜度，約一半的香氣由這類物質(zhì)提供。一般來說，高級醇含量低于300 mg/L時，對果酒的香氣具有積極貢獻，含量高于400 mg/L時，會明顯加重酒中的辛辣刺激感，產(chǎn)生惡心嘔吐、頭暈頭痛等不良反應[33]，因此，高級醇的含量對藍莓果酒的品質(zhì)具有重要意義。從優(yōu)化后的藍莓酒中共檢測出4種高級醇，總量為252.98 mg/L，分別是異戊醇、正丙醇、正丁醇、苯乙醇，其中異戊醇的含量最高，為133.43 mg/L，可見異戊醇是藍莓酒中主要的高級醇，對藍莓酒感官風味的影響貢獻較大。香氣成分是構(gòu)成藍莓酒品質(zhì)的一個重要指標，香氣物質(zhì)的種類、濃度及和諧程度決定了酒體本身的風味特征[29]。經(jīng)HS-SPME-GC/MS 分析，藍莓酒中共檢出28種揮發(fā)性風味化合物，其中酯類10 種，萜烯類9 種，醇類3 種，酚類3 種、酸類2 種，酯類與醇類的含量相對較高；酯類物質(zhì)中含量較高的有正己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯，其中正己酸乙酯的含量占到酯類物質(zhì)總量的73.78%，是藍莓酒中主要的酯類呈香物質(zhì)，具有典型的水果香型；萜烯類物質(zhì)中，芳樟醇、β-香茅醇的含量較高，分別為29 590.03 μg/L、10 372.98 μg/L，這表明芳樟醇、β-香茅醇可能是“萊格西”藍莓的主要品種香氣物質(zhì)，為藍莓酒帶來溫和優(yōu)雅的熏衣草香及令人愉快的玫瑰香、甜香。試驗結(jié)果為藍莓酒特征香氣物質(zhì)的評價提供了數(shù)據(jù)支撐。