周泉勇，劉晨龍，季華員，萬明春，黃美峰，黃江南*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.江西省贛州市畜牧業(yè)發(fā)展和動(dòng)物疫病防控中心，江西贛州 341001）

【研究意義】產(chǎn)仔數(shù)性狀嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)效率及經(jīng)濟(jì)效益，提高母豬產(chǎn)仔數(shù)一直是豬遺傳育種的研究重點(diǎn)。產(chǎn)仔數(shù)是一個(gè)低遺傳力性狀（h2=0.1）。利用性能測(cè)定、遺傳評(píng)估等常規(guī)育種技術(shù)短時(shí)間內(nèi)較難取得明顯進(jìn)展，通過篩選獲得影響母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記，從而利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選育無疑是更為理想的手段[1-2]。【前人研究進(jìn)展】產(chǎn)仔數(shù)的高低取決于妊娠期間胎兒的存活率[3]。已有研究表明，Ⅰ型干擾素通過建立免疫耐受、識(shí)別妊娠信號(hào)、促進(jìn)血管發(fā)育等多種途徑在妊娠建立過程中起著極為關(guān)鍵作用[4-5]。干擾素刺激基因15（Interferon-stimulated gene 15，ISG15）屬類泛素蛋白家族成員，是Ⅰ型干擾素作用于機(jī)體后上調(diào)表達(dá)的典型基因[6]。目前，在人[7]、鼠[8]、狒狒[9]、牛[10]、羊[11]和馬[12]等眾多哺乳動(dòng)物中均已檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ISG15在妊娠早期子宮內(nèi)膜中被誘導(dǎo)表達(dá)。這一保守基因的子宮反應(yīng)，暗示著該基因在妊娠建立過程中起著重要作用。妊娠的建立依賴于母體對(duì)胚胎抗原的免疫耐受。此過程中，母體子宮內(nèi)膜中免疫基因的表達(dá)模式?jīng)Q定了母體胎兒的免疫特征[12]。ISG15是免疫通路中重要的調(diào)節(jié)因子[13]。研究顯示，在原代牛子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞中，ISG15參與上調(diào)MHC 分子表達(dá)從而維持妊娠早期的免疫耐受環(huán)境，促進(jìn)胚胎成功黏附[14]。體外細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牛病毒性腹瀉病毒可通過抑制子宮內(nèi)膜中ISG15 蛋白的表達(dá)，從而降低子宮免疫功能和破壞妊娠識(shí)別信號(hào)導(dǎo)致早期胚胎死亡[15-16]。在ISG15基因敲除小鼠中，ISG15基因缺失會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜中黏附和細(xì)胞存活功能相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生改變，從而致使交配后50%的胚胎死亡于妊娠7.5～12.5 d[17-18]。顯然，妊娠期子宮內(nèi)膜中ISG15表達(dá)水平的變化與胚胎存活密切相關(guān)。此外，在牛中，ISG15已被作為早期妊娠診斷的生物標(biāo)志物。ISG15的高表達(dá)，可有效促進(jìn)牛胚胎的發(fā)育，而敲除ISG15后，囊胚的孵化率將顯著性降低[19]。這些結(jié)果提示，妊娠過程中，ISG15可能通過表達(dá)豐度的改變參與調(diào)控胚胎的存活率從而影響產(chǎn)仔數(shù)性能的發(fā)揮?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于ISG15在繁殖功能方面的研究主要集中在牛和鼠中，在豬中的報(bào)道尚少，且其與產(chǎn)仔數(shù)性狀之間的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究來闡述。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于此，本實(shí)驗(yàn)利用熒光定量PCR 方法檢測(cè)ISG15在豬妊娠早中期子宮內(nèi)膜和絨毛膜中的表達(dá)水平變化，并通過測(cè)序篩選ISG15的多態(tài)位點(diǎn)，分析其在中外豬群中的遺傳多樣性及與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)性，擬為研究ISG15在豬繁殖功能中發(fā)揮的作用提供重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于基因表達(dá)分析的樣本來源于9 頭體況相近的大白后備母豬，配種后同等條件飼養(yǎng)至妊娠15，26，50 d 進(jìn)行屠宰取樣。其中妊娠15 d 僅采集子宮內(nèi)膜，妊娠26，50 d 分別采集絨毛膜和附植點(diǎn)子宮內(nèi)膜。每頭母豬按胎兒附植情況采集樣本5 份以上，采集后于液氮中保存。用于遺傳多樣性分析和關(guān)聯(lián)性分析的DNA 樣本均取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室樣本庫。其中遺傳多樣性分析樣本共180個(gè)，包括大白豬30個(gè)，梅山豬38個(gè)，清平豬29個(gè)，通城豬49個(gè)，大花白豬34個(gè)，分別來源于昆山市梅山豬原種場(chǎng)、當(dāng)陽市清平豬原種場(chǎng)、通城縣種畜場(chǎng)和新豐縣板嶺原種豬場(chǎng)，且品種個(gè)體間3 代以內(nèi)無血緣關(guān)系。關(guān)聯(lián)性分析樣本為大白母豬個(gè)體365 個(gè)，來源于廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺(tái)豬場(chǎng)同一批次產(chǎn)5 胎以上生產(chǎn)母豬，收集的性狀數(shù)據(jù)為胎次、總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和初生重。RNA 提取試劑盒購自Tiangen Biochemical Technology 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega 公司，PCR 純化試劑盒購自Beijing Baitek Biotechnology 公司，內(nèi)切酶HindⅢ購自MBI 公司，熒光定量試劑盒購自TOYOBO 公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從NCBI 網(wǎng)站中調(diào)取豬ISG15基因mRNA 序列（NM_001128469.3），應(yīng)用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)相關(guān)檢測(cè)引物（表1），并委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行合成。

表1 引物信息Tab.1 The information of primer sequences

1.3 ISG15基因表達(dá)水平分析

樣本RNA 的提取和cDNA 的制備按相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行操作。隨后以TBP1基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行熒光定量分析，相關(guān)擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考周泉勇等[20]文章中方法進(jìn)行。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCt方法。

1.4 ISG15基因多態(tài)位點(diǎn)篩選及分型

分別以大白豬和梅山豬子宮內(nèi)膜組織cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物檢測(cè)合格后，瓊脂糖凝膠電泳回收并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAstar軟件進(jìn)行比對(duì)，篩選獲得多態(tài)位點(diǎn)。以用于遺傳多樣性分析和關(guān)聯(lián)性分析的DNA樣本為模板，PCR擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)所在DNA序列，產(chǎn)物擴(kuò)增檢測(cè)合格后，65 ℃酶切消化過夜。酶切體系為10 μL，其中DNA 2.5 μL，HindⅢ1.0 μL，無核酸水6.5 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后統(tǒng)計(jì)基因型。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel 2016軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析，分別計(jì)算5個(gè)品種的基因型頻率、等位基因頻率、群體平均雜合度、多態(tài)信息含量及Hardy-Weinberg 平衡卡方值。應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，采用雙因素方差分析比較不同基因型母豬在繁殖性狀方面的差異顯著水平，其一般線性模型為：yi=μ+αi+pk+ei，其中yi為性狀值，μ為總體平均數(shù)，αi為基因型效應(yīng)值（i=GG，TG，TT），pk為胎次效應(yīng)（按初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)劃分），ei為隨機(jī)誤差。然后采用最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠早中期子宮內(nèi)膜和絨毛膜中ISG15基因表達(dá)水平分析

利用熒光定量PCR 方法檢測(cè)妊娠早中期大白豬子宮內(nèi)膜和絨毛膜組織中ISG15的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1 所示，子宮內(nèi)膜中，ISG15在妊娠26 d 表達(dá)水平顯著高于妊娠15 d 和50 d（P＜0.01），在絨毛膜中，ISG15在妊娠26 d表達(dá)水平顯著高于妊娠50 d（P＜0.01）。

圖1 不同妊娠時(shí)期子宮內(nèi)膜和絨毛膜中ISG15基因的表達(dá)水平變化Fig.1 Expression of variation of ISG15 gene in endometrium and chorion at different pregnant stages

2.2 ISG15基因SNP位點(diǎn)篩選驗(yàn)證

對(duì)豬ISG15基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖2 所示，ISG15基因第二外顯子中存在一個(gè)NM_001128469.3：c.301A＞G 同義突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)可被內(nèi)切酶HindⅢ識(shí)別。進(jìn)一步利用PCR-RFLP方法進(jìn)行分型驗(yàn)證，結(jié)果如圖3 所示，GG 基因型時(shí)酶切產(chǎn)物大小為435 bp，AA 基因型時(shí)酶切產(chǎn)物大小為225 bp+210 bp。

圖2 豬ISG15基因c.301A＞G位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果（反義鏈）Fig.2 c.301A＞G mutation in sequences of ISG15 gene（antisense）

圖3 豬ISG15基因c.301A＞G多態(tài)位點(diǎn)酶切圖Fig.3 c.301A＞G mutation of ISG15 gene after digestion by HindⅢenzyme

2.3 ISG15基因c.301A＞G位點(diǎn)遺傳多樣性分析

利用PCR-RFLP方法檢測(cè)ISG15基因c.301A＞G位點(diǎn)在5個(gè)豬群中基因型并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2所示，在大白豬、梅山豬、清平豬和通城豬群體中，c.301A＞G 位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。但在地方豬群體中，c.301A＞G 位點(diǎn)以AA 基因型為主，A 等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，且PIC 分別為0.09、0.09和0.26，多表現(xiàn)為低度多態(tài)。而在大白群體中，c.301A＞G 位點(diǎn)以AG 基因型為主，等位基因A與G的基因頻率無明顯區(qū)別，且PIC為0.37，表現(xiàn)為中度多態(tài)。

表2 ISG15基因c.301A＞G位點(diǎn)在5個(gè)豬種中遺傳多樣性分析Tab.2 Genetic diversity analysis of c.301A＞G mutation of ISG15 gene in five different pig breeds

2.4 ISG15基因c.301A＞G位點(diǎn)與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析

利用PCR-RFLP 方法檢測(cè)ISG15基因c.301A＞G 位點(diǎn)在大白母豬群體中基因型并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果如表3 所示，初產(chǎn)大白母豬群體中，c.301A＞G 位點(diǎn)GG、AG、AA 基因型母豬在產(chǎn)活仔數(shù)、總產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重等性狀中差異不顯著（P＞0.05）。而在經(jīng)產(chǎn)大白母豬群體中，c.301A＞G 位點(diǎn)3 種基因型對(duì)總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)性狀影響顯著（P＜0.05），其中，AA 基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)和總產(chǎn)仔數(shù)最多，AG 基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)和總產(chǎn)仔數(shù)最少。

表3 c.301A＞G位點(diǎn)基因型與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Association analyses of c.301A＞G polymorphism with reproduction traits

3 討論

ISG15是一個(gè)經(jīng)典的Ⅰ型干擾素刺激基因。研究顯示，ISG15在人、鼠、牛、羊等多種哺乳動(dòng)物妊娠早期子宮內(nèi)膜中被誘導(dǎo)表達(dá)[21]。試驗(yàn)利用熒光定量PCR 方法檢測(cè)ISG15在豬妊娠早期子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ISG15在妊娠26 d 中表達(dá)量顯著高于妊娠15 d。顯然，在豬妊娠早期，同樣存在子宮內(nèi)膜中ISG15誘導(dǎo)表達(dá)這一妊娠反應(yīng)。Austin 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在牛子宮內(nèi)膜中，細(xì)胞內(nèi)ISG15出現(xiàn)于妊娠17 d，至妊娠23 d 表達(dá)達(dá)到高峰，隨后至妊娠50 d 基本不表達(dá)。在羊中，同樣發(fā)現(xiàn)ISG15在妊娠15～25 d 子宮內(nèi)膜中高水平表達(dá)，隨后表達(dá)水平急劇下降[23]。試驗(yàn)中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ISG15在豬妊娠26～50 d 子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平顯著降低。這一結(jié)果與牛和羊中研究結(jié)果類似。妊娠早期子宮內(nèi)膜中ISG15被誘導(dǎo)表達(dá)，暗示著ISG15在早期妊娠建立過程中發(fā)揮重要功能。在妊娠早期，胚胎和子宮互作并建立生理聯(lián)系對(duì)妊娠建立至關(guān)重要[24]。此過程中，母胎界面表達(dá)一系列調(diào)控因子并相互作用，從而建立對(duì)話并傳遞信號(hào)是母胎互作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[25]。Passaro 等[26]通過構(gòu)建胚胎與子宮內(nèi)膜外植體共培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)，囊胚期胚胎可有效刺激子宮內(nèi)膜中ISG15的表達(dá)。Forde 等[27]研究表明，ISG15在妊娠期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)差異隨著胚胎附植的發(fā)生而呈現(xiàn)。這些研究提示，ISG15可能是一個(gè)重要的胚胎-母體通訊基因。絨毛膜是母胎界面的重要組成部分。試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)ISG15在妊娠早中期絨毛膜中表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)趨勢(shì)與子宮內(nèi)膜中表達(dá)趨勢(shì)相同，均表現(xiàn)為妊娠26 d 高水平表達(dá)，而至妊娠50 d 低水平表達(dá)。ISG15在母胎界面中表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)性及一致性，說明ISG15的表達(dá)調(diào)控是母胎界面微環(huán)境中的一個(gè)重要組成部分，且可能在母胎互作中發(fā)揮著重要功能。

母豬產(chǎn)仔數(shù)的高低取決于妊娠期間胎兒的存活率[3]。已有研究表明，子宮內(nèi)膜中ISG15基因表達(dá)豐度的改變參與調(diào)控妊娠早期胚胎的存活率[17-18]。相比于大白豬，中國地方豬普遍具有較高的窩產(chǎn)仔數(shù)。試驗(yàn)中，通過對(duì)ISG15基因c.301A＞G 位點(diǎn)在中外豬種中遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)A 基因頻率在地方豬種中明顯高于大白，且在地方豬種中以AA 基因型分布為主，而在大白中以AG 基因型分布為主。中外豬種中c.301A＞G 位點(diǎn)多態(tài)性的差異分布初步表明ISG15可能是影響母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的候選基因。在ISG15基因多態(tài)性研究方面，Huang 等[28]通過對(duì)ISG15基因c.347T＞C 位點(diǎn)與長白豬初生重和血液免疫指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)多態(tài)性與初生重性狀顯著相關(guān)。試驗(yàn)中，在c.301A＞G 位點(diǎn)，同樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AA 基因型母豬所產(chǎn)仔豬的平均初生重均低于GG 基因型和AG 基因型母豬。以往研究顯示，當(dāng)初生重逐漸降低，母豬產(chǎn)活仔數(shù)呈上升趨勢(shì)，且母豬產(chǎn)活仔數(shù)與初生重呈極強(qiáng)負(fù)相關(guān)[29]。研究進(jìn)一步對(duì)c.301A＞G 位點(diǎn)與大白豬群產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬中，c.301A＞G 位點(diǎn)的AA 基因型母豬在產(chǎn)活仔數(shù)、總產(chǎn)仔數(shù)方面均高于GG 基因型和AG 基因型。雖然在初產(chǎn)母豬中差異不顯著，這可能與初產(chǎn)母豬平均產(chǎn)仔數(shù)較低有關(guān)，但在經(jīng)產(chǎn)母豬中，c.301A＞G 位點(diǎn)與產(chǎn)活仔數(shù)、總產(chǎn)仔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。該結(jié)果表明，在大白母豬群體中，AA 基因型母豬在產(chǎn)仔數(shù)性能發(fā)揮方面更具有優(yōu)勢(shì)。這也與c.301A＞G 位點(diǎn)在中外豬種中遺傳多樣性分析相符合。ISG15基因可作為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀早期篩選的候選基因。

4 結(jié)論

ISG15基因在妊娠早期子宮內(nèi)膜和絨毛膜中特異性高表達(dá)，暗示ISG15基因的表達(dá)水平變化是母胎界面微環(huán)境中的一個(gè)重要組成部分。ISG15基因c.301A＞G 位點(diǎn)在中外豬種中的基因型差異分布及與產(chǎn)仔數(shù)性狀的顯著關(guān)聯(lián)，表明ISG15對(duì)豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的早期選育具有一定參考意義。

致謝：江西省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（JXARS-01）和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意!