張 敏，李 燕，寧 朋，程小毛，黃曉霞

（西南林業(yè)大學 園林園藝學院/國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224）

【研究意義】土壤鹽漬化是限制植物生長發(fā)育的重要非生物脅迫之一，據(jù)統(tǒng)計，中國鹽漬土總面積約為3.6×107hm2，占全國總可用土地面積的4.88%[1-2]，由于不合理灌溉、過度施肥等因素的影響，鹽漬土面積還在進一步擴大，已嚴重影響植物生存環(huán)境，干擾植物正常生長發(fā)育等過程[3]。因此，研究植物耐鹽機制，采取合理措施提高植物耐鹽性，開發(fā)利用鹽漬土是亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M展】一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物體細胞內(nèi)可自由擴散的信號分子，參與植物生長發(fā)育和響應非生物脅迫等過程。研究表明，外施NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP），對緩解植物在非生物脅迫中遭受的毒害作用有一定的效果：鋁脅迫下，根部澆灌SNP參與植株光能分配，提高了西瓜（Citrullus lanatus）葉綠素含量和光合能力[4]；干旱脅迫下，葉面噴施SNP有效緩解了小麥（Triticum aestivum）幼苗的氧化損傷[5]；鎘脅迫下，葉面噴施SNP能促進花生（Arachis hypogaea）生長，提高光合色素含量，增強抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[6]；鹽脅迫下，根部澆灌SNP 可使山葡萄（Vitis amurensis）PSII 反應中心活性維持在較高水平[7]。前人研究表明SNP 既可根部施用，也可葉面噴施，對植物的抗逆性均起到了一定的提高作用，但何種施用方式緩解效果更佳，植物對NO 信號的感知方式以及運輸途徑等還需更深入的研究?！颈狙芯康那腥朦c】中華常春藤（Hedera nepalensisvar.sinensis）為五加科常春藤屬常綠藤本，常攀援于假山、巖石以及房屋墻壁。因其枝蔓茂密、姿態(tài)優(yōu)雅，管理簡單，適應性強，被廣泛運用于園林綠化和城市建設中[8]。目前關(guān)于中華常春藤的研究主要集中在景觀應用和病理研究，對外源物質(zhì)調(diào)控其耐鹽性方面鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對植株進行鹽脅迫處理、外施SNP 處理，探討葉面和根際施用SNP 緩解鹽脅迫傷害中華常春藤的效果，以期提高植株耐鹽性及為鹽漬化地區(qū)植被恢復的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為西南林業(yè)大學校園內(nèi)中華常春藤水培苗。供試試劑為NaCl 溶液和外源一氧化氮（NO）供體硝普鈉（SNP，C5H4FeN6Na2O3）。

1.2 試驗設計

試驗在西南林業(yè)大學主教7 樓陽光溫室內(nèi)進行。于2020 年8 月在校園內(nèi)剪取一年生半木質(zhì)化中華常春藤枝條，清水培養(yǎng)兩個月，生根后移栽至底部直徑10 cm、高15 cm的培養(yǎng)瓶中，并對其進行根部遮光處理。選擇健康且長勢一致的苗木作為處理材料，用不含瓊脂和蔗糖的DKW 培養(yǎng)基[9]進行水培。鹽脅迫用相應濃度NaCl 配置于水培液；通過預實驗處理，確定SNP 濃度為0.1 mmol/L，對植株進行葉面及根際施用。如表1所示，試驗共設置7個處理組。每處理組5個重復，每瓶3株，處理期間，每兩天更換1次培養(yǎng)液。SNP 葉面噴施，施用量為噴施葉面剛好有水珠掉下來（每瓶約10 mL），每天清晨噴施1 次，不噴施組用等量清水作為對照處理；SNP根際施用，以相應濃度配置于水培液。試驗共處理15 d，處理結(jié)束后進行各項生理指標的測定。

表1 試驗設計Tab.1 Experimental design

1.3 測定項目與方法

1.3.1 光合氣體交換參數(shù)的測定 每處理組選擇5 株植株的成熟葉片于晴朗天氣的09：00—11：00 進行。用LI-6400 光合作用儀的標準葉室對植株葉片進行最大凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間二氧化碳濃度（C）i和蒸騰速率（Tr）的測定。測定時，對儀器進行校準調(diào)零，設置溫度為24 ℃，CO2濃度為400 μmol/mol，光強為1 000 μmol（/m2·s），相對濕度為55%。

1.3.2 葉綠素熒光參數(shù)的測定 于20：30 暗適應30 min 后，采用PAM-2100（WALZ）調(diào)制式葉綠素熒光儀測定葉片葉綠素熒光參數(shù)[10]。

1.3.3 可溶性物質(zhì)指標的測定 可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法；脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法；淀粉含量測定參照Zhao等[11]的方法。

1.3.4 其他生理指標的測定 選擇成熟葉片，用乙醇浸提法測葉綠素和類胡蘿卜素含量[12]；過氧化氫酶（CAT）活性測定參照Beers 等[13]的方法；過氧化物酶（POD）活性測定參照Lin 等[14]的方法；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定方法參照Yoshiyuki 等[15]；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定方法參照Huang 等[16]；丙二醛（MDA）含量測定參照Dhindsa等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 19.0 和Origin 2017 軟件對本實驗所有數(shù)據(jù)進行分析和繪圖，圖表中數(shù)據(jù)值為均值±標準誤，P＜0.05表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤光合色素的影響

表2 顯示，隨著鹽濃度的增加，中華常春藤葉綠素和類胡蘿卜素含量均呈下降趨勢，到300 mmol/L NaCl 處理下降到最低值，與CK 相比，分別降低了77%和75%。不同程度鹽脅迫下葉面噴施SNP 均顯著提高了葉綠素含量，且以100 mmol/L 鹽濃度下葉面噴施SNP 處理增幅更為顯著，相比100 mmol/L 鹽處理，增加了78.9%；而根際施用SNP葉綠素含量雖有所上升，但均未達到顯著水平。

表2 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤光合色素含量的影響Tab.2 Effects of applying exogenous NO with foliar and rhizosphere methods on photosynthetic pigment contents of Hedera nepalensis var. sinensis under salt stress

2.2 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤光合特性的影響

從圖1 可知，隨著鹽脅迫程度加重中華常春藤Pn、Gs、Tr逐漸降低，且在300 mmol/L NaCl 處理下達到最低值，與CK 相比，分別降低了89%、62%和48%。而Ci隨著鹽脅迫濃度的增加而顯著上升，與CK 相比，低和高濃度鹽處理下分別上升了8%和21%。此外，鹽脅迫下SNP 的不同施用方式均能降低植株葉片Ci值，增加Pn值，但各處理組間差異不顯著，且鹽與SNP交互作用對植株光合特性影響并不顯著。

圖1 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤光合特性的影響Fig.1 Effects of applying exogenous NO with foliar and rhizosphere methods on photosynthetic characteristics of Hedera nepalensis var.sinensis under salt stress

2.3 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤葉片熒光參數(shù)的影響

由表3 可知，中華常春藤葉片初始熒光（F0）在鹽脅迫下逐漸上升，相較于CK，低和高濃度鹽處理下分別上升了33%和58%。外施SNP有效抑制了F0的增加，且以葉面噴施抑制最為顯著。此外，植株葉片最大熒光（Fm）、最大光化學量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、實際光化學量子產(chǎn)量（Y（II））、非光化學淬滅系數(shù)（NPQ）、光化學淬滅系數(shù)（qp）、電子傳遞速率（ETR），均在300 mmol/L NaCl處理下降至最低值，與CK相比，分別降低了57%、49%、59%、66%、31%和59%，而外施SNP 能不同程度提高上述參數(shù)的值，且不論是低鹽脅迫還是高鹽脅迫下，均以葉面噴施SNP組變化更為顯著。

表3 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤葉片熒光參數(shù)的影響Tab.3 Effects of applying exogenous NO with foliar and rhizosphere methods on chlorophyll fluorescence parameters of Hedera nepalensis var. sinensis under salt stress

2.4 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，中華常春藤CAT、APX、POD活性均隨著鹽脅迫程度的加重而顯著上升，且在300 mmol/L NaCl處理下達到巔峰值，分別是CK的3.0倍、3.4倍、5.8倍。鹽脅迫下施加SNP進一步提高了CAT、APX、POD 活性，低鹽濃度下葉面噴施和根際施用SNP組提升上述酶活性的水平相當，而高鹽濃度下葉面噴施SNP組更能促進上述酶活性的提升。在300 mmol/L NaCl處理下，葉面噴施SNP組比未施用組植株CAT、APX、POD活性分別上升了36%、49%和70%。此外，無論是鹽脅迫還是外施SNP處理，SOD活性與CK相比雖有上升，但均未達到顯著水平。

圖2 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effects of applying exogenous NO with foliar and rhizosphere methods on antioxidant enzyme activities of Hedera nepalensis var.sinensis under salt stress

2.5 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤丙二醛含量的影響

由圖3 可知，低鹽和高鹽處理下MDA 含量相較于CK，顯著上升了46%和88%。低鹽脅迫下施加SNP雖使得MDA含量下降，但差異并不顯著；而高鹽脅迫下外施SNP能有效抑制MDA含量的上升，且葉面噴施和根際施用SNP組比未施用組分別降低了30%和16%。

圖3 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of applying exogenous NO with foliar and rhizosphere methods on MDA content of Hedera nepalensis var.sinensis under salt stress

2.6 葉面及根際施用NO對鹽脅迫下中華常春藤可溶性物質(zhì)含量的影響

由表4 可知，中華常春藤可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖和淀粉含量在300 mmol/L NaCl 處理下達最大值，與CK 相比，分別增加了1.0 倍、1.4 倍、2.6 倍和0.9 倍。鹽脅迫下外施SNP 提高了可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖和淀粉含量，在100 mmol/L NaCl 處理下，葉面噴施和根際施用SNP 組比未施用組分別上升了23%/8%、41%/32%、69%/8%、36%/27%。在300 mmol/L NaCl 處理下，葉面噴施SNP 組比未施用組分別上升了13%、116%、31%、40%；而根際施用SNP 僅脯氨酸上升了25%，其他指標并無顯著變化。

表4 葉面及根際施用外源NO對鹽脅迫下中華常春藤可溶性物質(zhì)含量的影響Tab.4 Effects of applying exogenous NO with foliar and rhizosphere methods on soluble substance contents of Hedera nepalensis var. sinensis under salt stress

3 討論與結(jié)論

光合作用是植物獲得能量和物質(zhì)的來源，光合色素是光合作用的基礎[18]。鹽脅迫下，植物葉片類囊體膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，葉片光合色素含量降低，光合作用能力減弱[19]，前人研究表明外施SNP可以緩解葉片葉綠素的分解，提高植株耐鹽性[20-21]。本研究結(jié)果顯示：光合色素含量在鹽脅迫下顯著降低，外施SNP后顯著上升，這可能是因為SNP刺激了植株葉片葉綠素合成酶的活性，促進了類囊體膜蛋白復合體的穩(wěn)定性，從而保護光合機構(gòu)，提高光合色素含量[22]，而低鹽脅迫對植株葉片損傷較小，因此SNP 施用的緩解效果更為顯著。植物光合作用也受Ci、Pn、Gs、Tr等因素的影響。本研究結(jié)果顯示：鹽脅迫下Pn顯著下降，Ci卻顯著上升，外施SNP 對Pn、Ci并無顯著影響。這一結(jié)果與楊妮等[23]在茶樹（Camellia sinensis）的研究中“鹽脅迫下施用外源亞精胺顯著提高了植株葉片Pn、Gs、Tr的值”不同。這可能是因為鹽脅迫抑制了葉肉細胞內(nèi)的氣體擴散，造成外源NO與受體結(jié)合受阻，CO2溶解度降低，導致光合穩(wěn)定性降低，凈光合速率變化不顯著[24]。

葉綠素熒光參數(shù)的變化可以反映光合機構(gòu)的狀況，因此，葉綠素熒光被稱為植物光合作用的探針。本研究結(jié)果顯示：鹽脅迫顯著抑制了Fm、Fv/Fm、Y（II）、ETR的上升，促進了F0的上升，這可能是因為鹽脅迫導致光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換能力減弱，電子傳遞速率下降，ATP 和NADPH 合成受阻，光合作用受抑。鹽脅迫下施加SNP 顯著增加了Fv/Fm、Y（II）、ETR，這可能是因為外源NO 通過增加分配給碳和氮同化的光能來緩解鹽脅迫帶來的光抑制，這說明外源NO 間接地參與了植株光合作用過程，有利于維持PSII 反應中心的活性，提高光合作用能力，提高碳同化量[25]。同時，本研究結(jié)果亦顯示：外施SNP 促進了qp和NPQ的上升，這說明鹽脅迫抑制了植株葉片PSII 反應中心電子傳遞活性，植株光保護能力機制失效，而NO 作為一種信號分子顯著提高了PSII 反應中心的活性，有利于光合作用同化物質(zhì)的積累。這與楊美森等[26]對棉花（Gossypium hirsutum）幼苗的研究中指出“冷害脅迫顯著降低了qp和NPQ，低溫已導致PSII 反應中心遭到不可逆的損傷，而外源NO 避免了過量的光損傷，維持較高的PSII 反應中心的活性”的結(jié)果相似。

研究表明，鹽脅迫下，植株體內(nèi)活性氧水平升高，細胞膜損傷加重，導致植株遭受氧化脅迫，而添加適量濃度SNP 能夠緩解過氧化反應對植株造成的傷害[27-28]。本研究結(jié)果顯示：不同程度鹽脅迫下施加SNP 均促進了抗氧化酶活性的增加，抑制了MDA 含量上升，這可能是因為NO 可直接與血紅素鐵結(jié)合，調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，也可作為活性氧清除劑，直接清除ROS，或作為抗氧化系統(tǒng)誘導劑，誘導體內(nèi)抗氧化酶活性的升高，來增強植株對鹽脅迫的抗性[29]。此外，本實驗中，SOD 活性在不同處理下均無顯著變化，這可能是因為植株本身的SOD活性水平較高，在一定鹽濃度內(nèi)增長并不顯著，也可能是因為植株對本實驗下的鹽濃度具有一定的耐性，SOD不作為主要的抗氧化酶。

研究表明鹽脅迫會造成植物膜組分、透性及離子運輸變化，使膜結(jié)構(gòu)和功能受到傷害，對植物產(chǎn)生滲透脅迫，而外施SNP有利于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，從而緩解鹽害[30-31]。本研究結(jié)果顯示：植株葉片可溶性物質(zhì)含量在鹽脅迫下顯著上升，這可能是中華常春藤適應鹽脅迫的一種方式，以此來調(diào)節(jié)細胞滲透勢，維持細胞保水能力，提高植株抗鹽性。施用SNP 后，其含量進一步上升，推測原因可能是NO 通過Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)錄來減少Na+的積累、增加K+/Na+比率，從而維持離子平衡，促進脯氨酸等可溶性物質(zhì)的積累來緩解植株所遭受的鹽脅迫[32]。

本研究結(jié)果亦顯示：葉面噴施比根際施用SNP對中華常春藤受鹽脅迫傷害的緩解效果更為顯著，推測原因可能為葉面噴施SNP可通過葉片氣孔進入保衛(wèi)細胞，直接與胞內(nèi)受體結(jié)合響應鹽脅迫，而根際施用SNP 可能首先與植株根部的生長素等內(nèi)源激素協(xié)同作用或通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）參與根系調(diào)控[33]，再與葉片受體結(jié)合其含量就相對較少，從而導致其效果相較于葉面噴施較差。但葉面噴施和根際施用SNP對植株抗鹽性效果差異的作用機制還有待更深入的研究。

綜上所述，鹽脅迫顯著抑制了中華常春藤的生理特性，而外源NO可以通過提高光合色素含量，增加光能吸收和傳遞效率，從而提高光合能力，緩解鹽對植株的光合損傷；還可以通過提高抗氧化酶活性，清除活性氧，降低MDA 含量，保護植株免受氧化損傷；此外，NO 還能誘導可溶性物質(zhì)的積累，降低細胞內(nèi)的滲透勢，維持膜內(nèi)外離子平衡，減輕鹽脅迫對膜結(jié)構(gòu)的破壞，提高植株耐鹽性，且相較于根際施用，葉面噴施的效果更好。