韓杰 斯焱 張鵬 陳果 畢夢娜 李鐘 朱江偉 張上上 陳經(jīng)勇

股骨頸骨折首要選擇是手術(shù)治療，其中全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(total hip arthroplasty，THA)在急性移位型股骨頸骨折的治療中具有良好效果。有研究發(fā)現(xiàn)，股骨頸骨折后期繼發(fā)股骨頭壞死行二期THA容易發(fā)生骨溶解等并發(fā)癥，臨床上對于該現(xiàn)象出現(xiàn)的機制尚不完全明確[1]。巨噬細胞可以依據(jù)其細胞的表型以及功能的差異分為兩種類型，其中M1型是經(jīng)典活化型能夠分泌白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎性細胞因子，M2型則是替代性活化型，主要高表達抑炎細胞因子，形成并活化破骨細胞，導(dǎo)致假體周圍發(fā)生骨溶解[2]。Wnt家族蛋白是一類與胚胎骨骼形成、組織修復(fù)等有關(guān)的蛋白，Wnt/β-catenin通路的啟動可以促進巨噬細胞向M1極化而抑制其向M2極化，從而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)參與骨喪失，但是在THA中其作用機制仍不清楚[3]。本文主要基于Wnt/β-catenin信號通路探討巨噬細胞在THA后骨溶解的影響。

對象與方法

一、對象

2018年12月～2020年12月接受THA術(shù)且未出現(xiàn)骨溶解的病人60例為對照組，男27例，女33例；年齡61～75歲，平均年齡(66.72±2.09)歲；均為股骨頸骨折，后期繼發(fā)股骨頭壞死行二期THA；假體均為金屬對聚乙烯全髖關(guān)節(jié)假體。同期出現(xiàn)THA后骨溶解的病人55例作為研究組，男26例，女29例，年齡60～75歲，平均年齡(67.12±1.95)歲；均為股骨頸骨折，后期繼發(fā)股骨頭壞死行二期THA；假體均為金屬對聚乙烯全髖關(guān)節(jié)假體。兩組病人基本資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)過倫理委員會批準。納入標準：(1)年齡60～75歲；(2)均為股骨頸骨折，后期繼發(fā)股骨頭壞死行二期THA；(3)簽署知情同意書。排除標準：合并凝血功能障礙；合并心血管、免疫系統(tǒng)、血液學(xué)疾病、惡性腫瘤；近期內(nèi)使用激素、降鈣素等影響骨代謝的藥物。

二、方法

1.骨密度檢測：通過雙能X射線骨密度儀檢測骨密度，通過Gruen分區(qū)檢測置換髖關(guān)節(jié)周圍7個區(qū)域的骨密度。

2.IL-6、TNF-α及骨代謝因子β膠聯(lián)降解產(chǎn)物(β-CTX)的檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法。在手術(shù)后和出現(xiàn)骨質(zhì)疏松后(對照組同期)收集外周靜脈血，將5 ml血液樣本通過酶聯(lián)免疫吸附測定，根據(jù)試劑盒標準曲線計算炎性細胞因子IL-6和TNF-α的濃度，以及骨代謝因子β膠聯(lián)降解產(chǎn)物(β-CTX)的濃度。

3.蛋白質(zhì)印跡法：通過總蛋白提取試劑盒提取出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的骨組織中的總蛋白。分別通過蛋白質(zhì)印跡法測定，分析目標蛋白條帶相對于β-actin的灰度值，分析CD68、CD206和β-catenin蛋白總表達量。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.兩組病人炎性細胞因子和骨代謝水平比較：研究組的IL-6為(79.16±14.35)pg/ml)，TNF-α為(101.86±15.34)ng/ml和β-CTX為(0.38±0.07)pg/L，對照組分別為(22.84±3.57)pg/ml、(49.62±7.11)ng/ml和(0.17±0.04)pg/L，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.兩組病人巨噬細胞水平比較見圖1。通過標志蛋白CD206和CD68評估M1和M2型巨噬細胞水平。結(jié)果顯示，研究組的CD206蛋白表達量和CD206/CD68比值高于對照組，而CD68蛋白表達量低于對照組。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測兩組CD206和CD68蛋白表達量

3.兩組病人Wnt/β-catenin通路水平比較見圖2。研究組β-catenin蛋白表達量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測兩組β-catenin蛋白表達量

4.β-catenin蛋白表達量與巨噬細胞的相關(guān)性見表1。結(jié)果表明，β-catenin蛋白表達量與M1型巨噬細胞標志蛋白CD206的表達量負相關(guān)，與M2型巨噬細胞標志蛋白CD68的表達量正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，β-catenin蛋白表達量與CD206/CD68比值負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 β-catenin蛋白表達量與巨噬細胞的相關(guān)性

5.巨噬細胞與炎性細胞因子和骨代謝水平的相關(guān)性見表2。結(jié)果表明，CD206蛋白表達量與炎性細胞因子IL-6和TNF-α、骨吸收因子β-CTX正相關(guān)；CD68蛋白表達量與IL-6、TNF-α、β-CTX負相關(guān)；CD206/CD68比值與IL-6、TNF-α、β-CTX正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 巨噬細胞與炎性細胞因子和骨代謝水平的相關(guān)性

討論

有研究發(fā)現(xiàn)，假體周圍磨損顆粒會導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)假體的周圍界膜組織中產(chǎn)生大量的巨噬細胞并發(fā)生一系列的生物化學(xué)反應(yīng)，最終造成了THA術(shù)后骨溶解；此外，骨髓源性的巨噬細胞在THA術(shù)后骨溶解的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其中界膜組織中數(shù)量眾多的巨噬細胞吞噬摩擦界面的顆粒，從而分泌大量炎性細胞因子包括IL-6、TNF-α等，形成正反饋循環(huán)，讓細胞宿主產(chǎn)生防御反應(yīng)；而接下來在骨吸收期間作為破骨細胞前體，可以分化為成熟破骨細胞發(fā)揮骨吸收功能，最終造成THA術(shù)后骨溶解[4]。巨噬細胞作為磨損顆粒靶向作用期間最為重要的細胞，檢測骨溶解位置獲取的界膜組織均能夠發(fā)現(xiàn)大量的巨噬細胞，其內(nèi)部具有大量磨損顆粒，說明吞噬功能已經(jīng)被活化。張晨等[5]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在吞噬大量的磨損顆粒后會分泌大量的IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)；其中，巨噬細胞主要M1型和M2型兩種類型，M1型巨噬細胞正向參與免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能；M2型巨噬細胞抑制免疫應(yīng)答[6]。β-CTX是膠原被降解后釋放入血的小分子片段，β-CTX水平的升高提示破骨細胞活性增加，出現(xiàn)骨溶解[7]。本研究結(jié)果顯示，出現(xiàn)骨溶解的THA病人的β-CTX、IL-6和TNF-α水平高于對照組。此外，出現(xiàn)骨溶解的THA病人中，CD206升高而CD68降低，表示巨噬細胞向M1極化，而M1型巨噬細胞會通過分泌炎性因子導(dǎo)致骨溶解，從而導(dǎo)致溶骨性疾病中的骨吸收和抑制骨形成[8]。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-6和TNF-α、骨吸收因子β-CTX與CD206和CD206/CD68正相關(guān)，與CD68負相關(guān)。提示在THA骨溶解過程中，巨噬細胞向M1極化分泌IL-6、TNF-α引起炎性反應(yīng)，從而啟動破骨細胞導(dǎo)致骨溶解。

β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路內(nèi)的關(guān)鍵因子，可以結(jié)合細胞核內(nèi)的淋巴增強因子/T細胞轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，發(fā)揮調(diào)控Wnt/β-catenin靶基因轉(zhuǎn)錄的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Wnt/β-catenin被抑制以后，細胞質(zhì)中的β-catenin水平水迅速上升，然后進入細胞核內(nèi)，結(jié)合淋巴增強因子/T細胞轉(zhuǎn)錄因子形成一種新型復(fù)合體，作用于DNA，從而誘導(dǎo)下游信號的靶基因進行轉(zhuǎn)錄，改變成骨細胞的細胞周期，讓其從G1期轉(zhuǎn)為S期，同時促進成骨細胞成熟；當(dāng)β-catenin的功能缺失將會直接抑制了成骨細胞分化、成熟[9]。此外，相關(guān)研究已經(jīng)顯示，Wnt通路在骨溶解中的關(guān)鍵作用，Wnt信號通路下調(diào)會抑制成骨細胞的增殖導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[10]。啟動Wnt /β-catenin通路后，巨噬細胞的M1型極化被抑制，TNF-α細胞因子的表達降低，從而促進軟骨細胞的分化[11]。本研究結(jié)果顯示，出現(xiàn)骨溶解的THA病人中β-catenin蛋白表達量顯著降低，且與M1型巨噬細胞標志蛋白CD206的表達量負相關(guān)，與M2型巨噬細胞標志蛋白CD68的表達量正相關(guān)。提示在出現(xiàn)骨溶解的THA病人中，β-catenin通路的抑制會促進巨噬細胞向M1型極化而抑制向M2型極化，從而引起炎性反應(yīng)導(dǎo)致骨溶解。此外，β-catenin調(diào)控巨噬細胞極化，而巨噬細胞水平與骨溶解指標正相關(guān)，提示β-catenin蛋白可能成為預(yù)測和評估骨溶解的指標。