梁春鴻，李丹蕾，朱 英，何 珂

(1. 浙江農(nóng)林大學動物科技學院、動物醫(yī)學院，浙江 杭州 311302；2. 海南浙江大學研究院，海南三亞 572000；3. 西南民族大學青藏高原研究院，四川成都 610041)

Toll 樣受體是一類參與非特異性免疫的重要蛋白，參與宿主對病原微生物感染的免疫反應，是宿主防御的重要介質，被稱為宿主防御系統(tǒng)的警報受體.它是一種模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)，是連接天然免疫和適應性免疫的橋梁，在病原體或者宿主自身刺激下被激活.TLR基因與病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)結合介導調(diào)控細胞內(nèi)信號轉導，分泌相關炎癥因子抵御病原微生物侵染[1-2].

目前已發(fā)現(xiàn)TLR基因在脊椎動物、無脊椎動物和植物中廣泛存在. 在脊椎動物中，大量的TLR基因已被識別，并且在結構和功能上均呈現(xiàn)出較高的相似性.但在不同物種中，TLR基因的種類和數(shù)量卻存在較大的差異.在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的23 個TLR基因，鳥類中僅含有其中部分(10 種)，分別是TLR1A、TLR1B、TLR2A、TLR2B、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15 和TLR21[3].其中，TLR15 和TLR21 是鳥類特有的TLR基因，而哺乳動物中存在的TLR8 和TLR9 基因已經(jīng)在鳥類中缺失[4-5]. 鳥類中甚至還存在TLR1 和TLR2基因的重復事件，形成了TLR1A、TLR1B和TLR2A、TLR2B[6-7].

根據(jù)配體來源的不同，可將TLR基因分為外源性配體和內(nèi)源性配體. 因識別的配體不同，又可將其分為病毒型(ViralTLRs)和非病毒型(Non-ViralTLRs).TLR3、TLR7 等為 ViralTLRs，只被表達在如內(nèi)質網(wǎng)和溶酶體的胞內(nèi)膜中，識別外源性配體，如肽聚糖、微生物核酸等.TLR1，TLR2，TLR4，TLR5 等為Non-Viral TLRs，能被表達在細胞表面，識別內(nèi)源性配體，如脂質、脂蛋白等微生物膜組分[8].在禽類的研究中，雞的TLR3、TLR7 和TLR21 基因均有抗病毒功能，其中TLR7 基因在不同類型的細胞上的細胞定位不同，且隨時間的變化而移動，即先定位于內(nèi)質網(wǎng)，移動至核內(nèi)體、溶酶體等細胞器進行相關功能發(fā)揮[9]. 雞的TLR21 基因具有識別細菌基因組DNA、合成寡聚脫氧核苷酸的核苷酸受體的功能[10].

研究結果表明，在哺乳類和鳥類中，ViralTLRs和Non-ViralTLRs基因會表現(xiàn)出不同的進化模式[11]，但關于TLR 基因進化的研究多在脊椎動物和兩棲動物中展開，對鳥類的TLR基因進化研究相對較少. 在兩棲動物的研究中已發(fā)現(xiàn)ViralTLRs比Non-ViralTLRs受到更多的選擇壓力，并且兩棲動物的TLR 基因家族組成介于魚類和羊膜動物之間[12].

不同類型的鳥類面臨不同環(huán)境的病原體選擇壓力，如具有長距離遷徙行為的雁形目物種是多種病原生物的重要載體和病毒的天然儲存庫. 因此，研究鳥類TLR基因家族的進化機制將有助于我們深入理解不同類群鳥類的適應性進化.本研究利用基因組學結合生物信息學研究手段，從基因組數(shù)據(jù)中挖掘鳥類TLR基因，分析TLR基因家族在鳥類中的進化模式，旨在明確鳥類TLR基因物種間拷貝數(shù)量差異和基因進化選擇，進一步了解鳥類免疫系統(tǒng)適應性進化的機制.

1 材料和方法

1.1 實驗數(shù)據(jù)

本研究所采用的基因組數(shù)據(jù)來源于國家生物技術中心信息檢索數(shù)據(jù)庫(National Center for Biotechnology Information Search database，NCBI)，由于三代測序技術能夠獲得更長的測序結果，更有利于基因家族位點預測及序列獲取[13]，因此主要采用其獲得的基因組數(shù)據(jù)進行分析.

鳥類被劃分為古顎下綱(古顎總目)和新顎下綱，新顎下綱包括雞雁小綱(雞形目和雁形目)和新鳥小綱(包括雀形目等95%的物種). 所采用的數(shù)據(jù)由兩部分組成，分別是三代測序得到的基因組數(shù)據(jù)，共有41 種，屬16 個目；及二代測序得到的基因組數(shù)據(jù)(由于古鶚總目物種缺少三代測序數(shù)據(jù)，但其在鳥類進化上不可或缺，因此我們采用二代數(shù)據(jù)進行補充；雁形目也用二代數(shù)據(jù)進行補充分析)，共32 種，屬7 個目(見表1).

表1 本項目所用基因組數(shù)據(jù)Table.1 Genome data used in this project

images/BZ_29_207_362_2274_408.pngSylvia atricapilla 黑頂林鶯 GCA＿009819655.1 Taeniopygia guttata 斑胸草雀 GCA＿008822105.2佛法僧目Coraciiformes Merops nubicus 洋紅蜂虎 GCA＿009819595.1鴿形目Psittaciformes Streptopelia turtur 歐斑鳩 GCA＿901699155.1鸛形目Pteroclidiformes Pterocles gutturalis 黃喉沙雞 GCA＿009769525.1 Balearica regulorum 灰冠鶴 GCA＿011004875.1 Cariama cristata 紅腿叫鶴 GCA＿009819825.1 Grus nigricollis 黑頸鶴 GCA＿004360235.1鸻形目Charadriiformes Alca torda 刀嘴海雀 GCA＿008658365.1 Pluvialis apricaria 歐金鸻 GCA＿017639485.1 Sterna hirundo 普通燕鷗 GCA＿009819605.1火烈鳥目Phoenicopteriformes Phoenicopterus ruber 大火烈鳥 GCA＿009819775.1雞形目Galliformes Centrocercus minimus 甘迅尼松雞 GCA＿005890655.1 Gallus gallus 原雞 GCF＿000002315.6 Pavo cristatus 藍孔雀 GCA＿005519975.1鵑形目Cuculiformes Cuculus canorus 大杜鵑 GCA＿017976375.1 Tauraco erythrolophus 紅冠蕉鵑 GCA＿009769465.1隼形目Accipitriformes Aquila chrysaetos 金雕 GCA＿900496995.3 Falco naumanni 黃爪隼 GCA＿017639645.1 Falco rusticolus 海東青 GCA＿015220075.1犀鳥目Bucerotiformes Bucorvus abyssinicus 地犀鳥 GCA＿009769605.1夜鷹目Caprimulgiformes Nyctibius grandis 大林鴟 GCA＿013368605.1 Pogoniulus pusillus 紅額67 補images/BZ_29_1356_1194_1382_1221.pngGCA＿015220805.1鸚形目Psittaciformes Melopsittacus undulatus 虎皮鸚鵡 GCA＿012275295.1 Strigops habroptila 鸮鸚鵡 GCA＿004027225.2雨燕目Apodiformes Calypte anna 紅喉蜂鳥 GCA＿003957575.1雁形目Anseriformes Anas platyrhynchos 綠頭鴨 GCA＿015476345.1 and GCA＿900411745.1 Aythya fuligula 鳳頭潛鴨 GCA＿009819795.1 Cygnus atratus 黑天鵝 GCF＿013377495.1 Cygnus olor 疣鼻天鵝 GCA＿009769625.1以下為2 代測序數(shù)據(jù)雁形目Anseriformes Anas zonorhyncha 斑嘴鴨 GCA＿002224875.1 Anser brachyrhynchus 粉腳雁 GCA＿002592135.1 Anser indicus 斑頭雁 GCA＿006229135.1 Anseranas semipalmata 鵲雁 GCA＿013399115.1 Asarcornis scutulata 白翅棲鴨 GCA＿013398475.1 Branta canadensis 加拿大黑雁 GCA＿006130075.1 Cairina moschata 疣鼻棲鴨 GCA＿009194515.1 Chauna torquata 冠叫鴨 GCA＿013399475.1 Cygnus cygnus 大天鵝 GCA＿014362685.1 Heteronetta atricapilla 黑頭鴨 GCA＿011075105.1 Nettapus auritus 厚嘴棉鳧 GCA＿011076525.1 Oxyura jamaicensis 棕硬尾鴨 GCF＿011077185.1 Stictonetta naevosa 澳洲斑鴨 GCA＿011074415.1無翼鳥目Apterygiformes Apteryx haastii 大斑幾維鳥 GCA＿003342985.1 Apteryx owenii 小斑奇威鳥 GCA＿003342965.1 Apteryx mantelli 北島褐幾維鳥 GCA＿001039765.1 Apteryxrowi 奧卡里托幾維鳥 GCF＿003343035.1鴕鳥目Struthionformes Struthio camelus 非洲鴕鳥 GCA＿000698965.1鶴鴕目Casuariiformes Dromaius novaehollandiae 鴯鹋 GCA＿016128335.1 Casuarius casuarius 鶴鴕 GCA＿003342895.1美洲鴕鳥Rheiformes Rhea americana 大美洲鴕 GCA＿003343005.1 Rhea pennata 美洲鴕鳥 GCA＿003342835.1images/BZ_29_265_2292_291_2319.png形目Tinamiformes Tinamus guttatus 白喉images/BZ_29_1284_2292_1310_2319.pngGCA＿000705375.2 Crypturellus cinnamomeus 棕穴images/BZ_29_1284_2328_1310_2354.pngGCA＿003342915.1 Crypturellus undulatus 波斑穴images/BZ_29_1313_2363_1339_2390.pngGCA＿013389825.1 Nothoprocta ornata 麗色斑images/BZ_29_1313_2399_1339_2425.pngGCA＿013398335.1 Crypturellus soui 小穴images/BZ_29_1284_2434_1310_2461.pngGCA＿013389845.1 Eudromia elegans 鳳頭images/BZ_29_1284_2470_1310_2496.pngGCA＿003342815.1 Nothoprocta pentlandii 安第斯斑images/BZ_29_1342_2505_1369_2532.pngGCA＿013398315.1 Nothoprocta perdicaria 智利斑images/BZ_29_1313_2540_1339_2567.pngGCF＿003342845.1 Nothocercus julius 茶胸林images/BZ_29_1313_2576_1339_2603.pngGCA＿013398735.1 Nothocercus nigrocapillus 斗篷林images/BZ_29_1313_2611_1339_2638.pngGCA＿013398345.1

1.2 實驗方法

1.2.1 鳥類TLR基因篩選

利用BLAST 程序[14]對鳥類基因組進行目的序列的查找，參數(shù)為e value ≤10-5.檢索序列來源于原雞(Gallus gallus)和斑胸草雀(Zebra finch)(見表2)[15].利用原雞相關序列集進行非雀形目鳥類TLR基因搜索；斑胸草雀相關序列集進行雀形目相關分析.

表2 TLR 基因BLAST 檢索的相關序列Table.2 ID of TLR query genes in avian

由于預測到的結果長短不一，在原始數(shù)據(jù)上，通過以下標準篩選出有效的TLR基因:(1)基因的長度應滿足目標序列原長的60%；(2)比對相似度百分比應大于70%；(3)bit score 值要盡可能大且比對期望值要小于10-5. 在判定過程中，只有同時滿足上述三者的才被認定是真基因，作為后續(xù)分析.

1.2.2 不同物種的TLR基因拷貝位點分析

利用Phylogeny subsets(http:/ /birdtree. org/subsets/)建立本研究中采用的鳥類系統(tǒng)進化關系，并在iTOL(https:/ /itol. embl. de/itol. cgi)中進行可視化.同時，TLR基因拷貝數(shù)目用R 軟件中的Pheatmap 包和ggplot2 包進行可視化.

1.2.3 選擇壓力分析

對篩選后得到的TLR基因位點進行選擇壓力分析.首先，利用 samtools(https:/ /www. htslib. org. )對下載的73 種鳥類基因組進行目的序列提??；其次，利用MEGA-X(10.2.5)軟件對序列進行比對；采用非同義突變速率和同義突變速率比值(ω =dN/dS)進行選擇壓力分析.其中ω ＞1 表示基因存在正向選擇作用，ω =1 為中性選擇，ω ＜1 為凈化選擇.

1.2.4TLR相關基因的系統(tǒng)樹構建

由于TLR3、TLR7 和TLR21 在選擇壓力中出現(xiàn)選擇差異，因此利用這三個基因進行系統(tǒng)進化關系分析.利用MEGA-X(10.2.5)軟件對所有有效的核酸序列進行比對，選擇建樹模型為Tamura-Nei(TN)，建樹中采用Bootstrap 重復取樣次數(shù)為1 000 次，接著采用最大似然法(Maximum likelihood)進行系統(tǒng)樹的構建.系統(tǒng)樹利用人、黑猩猩等相關序列作為外類群.

2 結果

2.1 TLR 基因數(shù)目分析

本實驗中73 個物種均能有效預測到TLR基因，說明采用的BLAST 方法可靠、可行. 在鳥類基因組中，預測到的TLR基因0 ～4 個不等，我們篩選了具有代表性(TLR基因存在或者重復)的共33 個物種進行作圖(圖1).

圖1 BLAST 預測的部分鳥類TLR 位點數(shù)目進化樹中紅色分支表示古顎總目下的物種，黃色表示雞形目，綠色表示雁形目，藍色表示雀形目.圖中不同的色塊表示真基因不同的數(shù)目.Fig.1 BLAST predicts the number of TLR sites for some birdsThe red branch in the evolutionary tree represents the species under the order Palaeognathus，yellow represents Galliformes，green represents Anseriformes，and blue represents passerines.The different color blocks in the heatmap represent the different numbers of true genes.

預測到的鳥類10 個TLR基因共可以分為以下三類:(1)TLR1A、TLR2A、TLR2B、TLR3、TLR4 和TLR5 中均出現(xiàn)少量基因多拷貝現(xiàn)象，其中TLR2A和TLR2B僅在非雀形目中出現(xiàn)多拷貝現(xiàn)象，TLR3 和TLR5 多拷貝現(xiàn)象僅出現(xiàn)在雀形目中. (2)TLR1B、TLR15 和TLR21 沒有出現(xiàn)基因多拷貝現(xiàn)象，其中TLR21 基因在34 個物種中沒有成功預測(有24 個物種未檢測到TLR21 基因，其余則是不滿足真基因的篩選標準).(3)有17 個物種出現(xiàn)TLR7 多拷貝現(xiàn)象(占所有物種的23.28%)，雀形目的多拷貝現(xiàn)象(92.31%)和拷貝數(shù)目多于非雀形目(8.33%)，并且雀形目內(nèi)拷貝數(shù)目存在物種間差異.

2.2 選擇壓力分析

根據(jù)鳥類進化過程中的主要類群進行分類群選擇壓力分析，判斷是否在不同的進化簇中存在不同的進化選擇壓力.由于雀形目是特別快速輻射的類群，因此我們又將其從新鳥小綱中分離出來.

結果表明，其中TLR1A、TLR5 和TLR15 在所有類群中均體現(xiàn)出凈化選擇；其他TLR基因在不同類群中存在差異的選擇作用(見表3). 如，TLR1B在古鶚總目和雁形目中為正向選擇，其余類群中為凈化選擇或中性選擇；TLR2A僅在雀形目存在微弱的正向選擇，其他類群均為凈化選擇；TLR2B僅在雞形目中為正向選擇；TLR3 在除古顎總目的其他類群中均為正向選擇；TLR4 僅在古顎總目中為正向選擇；TLR7 的正向選擇發(fā)現(xiàn)在古顎總目(作用強烈)和雞形目中(作用微弱)；TLR21 在新鳥小綱中均體現(xiàn)出正向選擇作用.

表3 不同類群中TLR 基因進化選擇分析Table3 Selection of TLR gene in different evolutionary groups

2.3 序列進化系統(tǒng)樹分析

由于TLR3、TLR7 和TLR21 在不同類群選擇壓力中出現(xiàn)差異，因此選擇這三個基因進行系統(tǒng)進化關系分析(圖2).總體來說，三個基因的系統(tǒng)進化關系基本上符合物種進化關系，物種均按照“目”進行聚類，相同目之間聚類的置信值基本均超過75%. TLR3 在多數(shù)物種中沒有出現(xiàn)基因重復事件，并且系統(tǒng)進化關系符合鳥類各目的進化聚類(圖2a)，其出現(xiàn)的正向選擇作用可能和其介導的病原體呈遞選擇有關.TLR7盡管在多數(shù)物種中存在基因重復事件，但在系統(tǒng)樹中未出現(xiàn)明顯的不同基因位點分枝(圖2b)，推測該基因經(jīng)歷了嚴重的純化選擇，同個物種的重復基因座之間的相似度很高.在TLR21 基因的進化樹中，古顎總目形成了獨特的一顯著分枝，而其他鳥類形成另一顯著分枝，兩者之間距離較遠(圖2c).

圖2 TLR3(a)、TLR7(b)和TLR21(c)基因的系統(tǒng)進化關系分析★代表置信值≥75%.紅色表示Palaeognathe(古顎總目)；黃色表示Galliformes(雞形目)；綠色表示Anseriformes(雁形目)；藍色表示Passeriformes(雀形目)；黑色表示Neoave*(新鳥小綱(除雀形目)).系統(tǒng)樹中所采用的外類群為:TLR3(人XM＿009 448543.3 和黑猩猩 NM＿003265.3)，TLR7(人 NM＿016562.4 和黑猩猩 NM＿001130133.2)，TLR21(虹鱒 XM＿021591169.2 和大西洋鮭魚XM＿014201342.2).Fig.2 Phylogenetic trees of TLR3(a)，TLR7(b) and TLR 21(c) genes★represents the confidence value ≥ 75%.Red for Palaeognathe；yellow for Galliformes；green for Anseriformes；blue for Passeriformes (except passerine).The outgroups used in the phylogenetic tree were:TLR3 (Homo sapiens XM＿009448543.3 and Pan troglodytes NM＿003265.3)，TLR7 (Homo sapiens NM＿016562.4 and Pantroglodytes NM＿001130133.2)，TLR21 (Oncorhynchus mykiss XM＿021591169.2 and Salmo salar XM＿014201342.2).

3 討論

TLR基因是一種在動植物中廣泛存在的古老的免疫基因，具有保守的進化模式. 以往大多數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，TLR基因在哺乳動物進化上往往表現(xiàn)出凈化選擇的作用[16-17]，這和我們的結果一致. 在本研究結果中，我們發(fā)現(xiàn)鳥類類群均存在不同程度的進化選擇.

鳥類廣泛分布在不同的環(huán)境中，如突胸總目、雞形目等陸禽主要以陸地為生境，雁形目等水禽生活史中大量涉及水環(huán)境，雀形目大多數(shù)為林鳥. 外部環(huán)境和食物種類對病原微生物的多樣性和組成起著關鍵作用[18].在長期的進化過程中，不同環(huán)境下的鳥類為了更好地適應其所在環(huán)境，免疫功能也隨之進化，TLR基因可能存在不同的進化方向.

根據(jù)研究結果我們發(fā)現(xiàn)，古顎總目的TLR3、TLR4和TLR7 基因的選擇作用和其他鳥類存在差異. 相較于其他鳥類翼長且有飛行的能力，古鶚總目的鳥類均翼短不能飛翔，僅能在地面行走，這使得古顎總目需要面對更加復雜多樣化的環(huán)境和更多的病原微生物.根據(jù)研究表明，TLR3 基因主要識別雙鏈RNA 病毒，TLR4 基因主要識別脂多糖類，TLR7 基因主要識別單鏈RNA 病毒[7].因此我們推測環(huán)境中差異的病原微生物豐度可能是古顎總目TLR基因的選擇作用與其他鳥類存在差異的原因之一.雀形目為中、小型飛鳥，體型小于其他鳥類，多棲息于樹木生長的環(huán)境中，食物多為雜食性，以昆蟲、漿果等為食.研究結果發(fā)現(xiàn)雀形目的TLR2A基因選擇作用與其他鳥類存在差異，TLR7 基因有明顯的基因重復事件，TLR21 基因相較于其他鳥類存在更少的基因丟失情況.我們推測雀形目的這些TLR基因差異可能與其需要發(fā)揮特異的免疫作用有關.

在基因重復上，在TLR1A、TLR2A、TLR2B、TLR3、TLR4、TLR5 和TLR7 基因發(fā)現(xiàn)了基因拷貝現(xiàn)象. 其中TLR7 重復在雀類中較為常見，我們推測該基因重復事件發(fā)生在雀形目快速輻射之前，但在系統(tǒng)樹中未體現(xiàn)出位點相關的進化枝，而TLR3 和TLR21 在系統(tǒng)樹中未存在類群相關特征，推測可能為獨立事件.此外，我們發(fā)現(xiàn)新鳥小綱中除了雀形目，其他大多數(shù)鳥類的TLR21 基因未能被預測到，我們猜測可能是因為基因組裝配上出現(xiàn)了問題，從而導致未能成功預測到TLR21 基因位點.古顎總目的TLR21 基因在進化中形成了一個獨特的進化分枝，而TLR21 基因在古顎總目中的缺失可能是因為其在進化中丟失了.

4 結論

本研究通過BLAST 在鳥類基因組中成功篩選出TLR基因家族，發(fā)現(xiàn)TLR基因的多拷貝現(xiàn)象在物種間存在差距，TLR7 基因是出現(xiàn)基因多拷貝現(xiàn)象最多的基因，且雀形目基因多拷貝數(shù)量明顯多于非雀形目.在鳥類不同類群中，TLR基因的選擇存在差異，尤其是古顎總目的基因進化和其他鳥類不同.在大多鳥類物種中，TLR3 基因和TLR21 基因表現(xiàn)出正向選擇，形成適應性變化.推測鳥類TLR基因存在不同的進化選擇機制，本研究結果為之后鳥類的TLR基因研究提供了一定基礎.