王雪峰 ，劉文暢 ，樊利鵬，譚洪新，羅國芝 ，孫大川

(1 上海海洋大學上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2 上海市水產(chǎn)動物良種創(chuàng)制與綠色養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；3 江蘇省沿海開發(fā)(東臺)有限公司，江蘇東臺 224200)

2020年，中國沿海養(yǎng)殖池塘面積達9 613.66 km2，水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為沿海地區(qū)土地復墾的重要途徑之一[1]。然而，沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖一直是重要的陸源海洋污染物的輸入源，會導致沿海地下水富營養(yǎng)化[2]。除氮、磷等常見的污染物外，pH在沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖中同樣需要關(guān)注。全國各級養(yǎng)殖尾水排放標準均要求池塘尾水的pH應(yīng)小于9，超標的尾水須經(jīng)處理達標后方可排放[3-4]。李云夢等[5]研究發(fā)現(xiàn)，濱海圍墾灘涂養(yǎng)殖池塘中的pH最高可達9.8。高pH除了是導致該池塘凡納濱對蝦高死亡率的原因外，亦無法滿足尾水的排放要求。人工濕地因綜合高效的處理能力在養(yǎng)殖尾水的處理中被重視[6]，但研究者卻很少強調(diào)其有效的降pH效果。倘若人工濕地可以兼具降低pH和去除污染物的效果，那么將進一步豐富高pH水體的處理方式，并促進人工濕地在沿海養(yǎng)殖中的應(yīng)用。

填料是人工濕地特別是潛流人工濕地床體的主要介質(zhì)，對濕地的污染物去除效果具有決定性影響[7]。石灰石、沸石等天然材料因具有官能團作用、特異性吸附位點等特殊性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用[8]。風化煤是暴露在地表或位于地表淺層的煤，內(nèi)含大量的再生腐殖酸和羧基、羥基等含活性基團。由于大分子腐殖酸可以通過酸堿中和和交換作用降低土壤pH，因此風化煤被廣泛應(yīng)用于鹽堿地的土壤改良[9]。作為一種喜鹽耐堿的鹽生作物，堿蓬(Suaedasalsa)既能修復含鹽水體，又具有較好的經(jīng)濟價值[10]。

本研究將堿蓬作為凈化植物，結(jié)合風化煤、陶瓷環(huán)和石英砂構(gòu)建組合填料人工濕地，以期在去除氮、磷等污染物的同時，同步降低水體pH，從而為人工濕地在養(yǎng)殖尾水中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 人工濕地的構(gòu)建

人工濕地共設(shè)3組作為重復，由敞口透明的有機玻璃柱構(gòu)建而成(圖1)。采用圓錐體和圓柱體的復合結(jié)構(gòu)，上部為圓柱體容器，直徑40 cm、高100 cm，下部為圓錐體容器，直徑40 cm、高10 cm。圓錐體的最下端開口連接排水管，排水管上依次固定出水閥門和流量計，用以調(diào)控濕地的實際出水流量。在距填料層表面約3 cm的容器側(cè)面增設(shè)一出水管，濕地多余的進水經(jīng)此排出。濕地由下到上依次填充石英砂、陶瓷環(huán)和風化煤。石英砂粒徑8～16 mm，填滿整個圓錐體以及(13.50±1.22)cm高的圓柱體。陶瓷環(huán)為六角狀，由中性石英粉燒制而成，粒徑15～20 mm，實際填充高度(31.67±2.59)cm。風化煤大小不均，粒徑2～6 cm，填充高度(52.50±1.47)cm。在填料表層均勻栽種8株堿蓬，堿蓬根部使用水草泥包裹。水草泥為黑色的圓形顆粒，顆粒大小為2～5 mm。堿蓬均采集于條子泥墾區(qū)未經(jīng)開墾的灘涂濕地(32°50′50″N，120°57′30″ E)。

圖1 濕地系統(tǒng)的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the wetland system

1.2 人工濕地的運行

濕地搭建于江蘇省條子泥墾區(qū)條南片區(qū)的一條排水渠道中(32°44′44″N，120°56′58″ E)，片區(qū)內(nèi)36個12 hm2養(yǎng)殖池塘的尾水均經(jīng)此渠道匯入黃海，水體鹽度為2.7～7.1。自2021年3月11日開始，組合填料濕地共計運行70 d，水力停留時間為4.03 h，水力負荷為2.18 m3/(m2d)。

1.3 檢測項目及方法

1.3.1 水質(zhì)指標

收集濕地的上端進水和下端出水樣本，利用便攜式多參數(shù)水質(zhì)測量儀(Multi 3430，德國WTW公司)測定樣本pH。按照標準方法，測定總氮(TN)、總磷(TP)和高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)[11-12]。

1.3.2 堿蓬的生長指標

在人工濕地運行初始、終末分別留存堿蓬樣本，利用分析天平稱量鮮重，用皮尺測定株高和根長，在烘箱烘干水分后稱量干重并計算含水率。

1.3.3 硝化能力測試

1.3.4 微生物群落分析

同硝化能力測試，濕地運行結(jié)束后，將不同高度的同種填料均勻混合，風化煤分為上、下兩部分以區(qū)分是否有堿蓬根系覆蓋。以超純水作為洗滌劑，超聲波洗滌各類填料后過0.22 μm濾膜。根據(jù)E.Z.N.A.? soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書抽提濾膜上微生物群落的總DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測定DNA質(zhì)量濃度和純度。使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

將所有序列讀數(shù)聚類到操作分類單位(OTU)(相似性閾值為 97%)，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)確定OTU代表性序列的分類分配。為了消除不同測序深度造成的偏差，將所有測序樣本分別稀化到最低序列(36 041條)，后續(xù)分析均使用歸一化的OTU豐度數(shù)據(jù)進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著水平取P<0.05。微生物數(shù)據(jù)在Majorbio I-Sanger云在線平臺上進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工濕地的運行

人工濕地進、出水中的污染物質(zhì)量濃度和去除率如圖2所示。墾區(qū)池塘尾水中的pH、TN、TP和CODMn分別在8.55～9.17、3.58～8.53 mg/L、0.47～1.16 mg/L和17.96～26.63 mg/L的范圍內(nèi)波動。經(jīng)濕地凈化后，出水中的pH、TN、TP和CODMn分別為7.34～8.79、2.75～6.65 mg/L、0.33～0.71 mg/L和16.32～24.16 mg/L。其中，pH、TP和CODMn在進、出水中的差異顯著(P<0.05)。進水的pH下降5.27%～17.83%，平均下降8.78%。出水中pH除有2次達8.56以上外，均小于8.50。首次采樣時，出水中的TN高于進水，即TN去除率表現(xiàn)為負值。其余時間里，濕地的TN去除率維持在15.92%～43.80%范圍,平均值為27.22%。TN去除率隨進水質(zhì)量濃度上下波動，當進水中的TN高于7 mg/L時，出水中的TN并不能保持在5 mg/L以下。濕地的TP去除率在10.37%～47.76%范圍，隨運行時間增加而不斷增長，平均去除率36.26%。在第29天，濕地進水中的TP僅為0.50 mg/L，遠低于其他時段，此時TP的去除率僅為10.37%。經(jīng)濕地凈化后，出水中的TP全部低于1 mg/L，并在多數(shù)情況下低于0.5 mg/L。前2次采樣時，濕地的CODMn去除率不足5%，后逐漸升高并維持在9.16%～25.53%，平均值為13.52%。經(jīng)濕地凈化后，出水中的CODMn維持在15～25 mg/L范圍。

圖2 進出水中的pH、總氮(TN)、總磷(TP)和高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)及去除率的變化Fig.2 Variation of pH,TN,TP,and CODMn and removal rates in influent and effluent

2.2 堿蓬的生長

人工濕地運轉(zhuǎn)結(jié)束后，堿蓬的鮮重、干重、株高、根系長度和含水率均出現(xiàn)了顯著增長(P<0.05)。運轉(zhuǎn)結(jié)束時，堿蓬的平均根系長度為(19.17±7.77)cm，接近風化煤層高度的1/2。

表1 人工濕地運行前后堿蓬的生長指標Tab.1 Growth indicators of Suaeda salsa before and after the artificial wetland operation

2.3 硝化能力測試

圖3 硝化能力測試中和的質(zhì)量濃度變化Fig.3 Changes of in the nitrification capacity test

2.4 細菌群落的α和β多樣性

如表2所示，各樣本文庫覆蓋率(Coverage)均大于0.99，說明測序結(jié)果可以很好地反映樣本的真實情況。選取Ace和Chao指數(shù)估算細菌群落的豐富度，選取Shannon和Simpson指數(shù)估算細菌群落的多樣性。盡管差異不顯著，但Ace、Chao和Simpson指數(shù)均顯示上層風化煤中細菌群落的豐富度和多樣性最高。Shannon指數(shù)顯示上層風化煤和石英砂上細菌群落的多樣性顯著高于陶瓷環(huán)(P<0.05)。

表2 不同填料上細菌群落的α多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha diversity index of bacterial communities on different fillers

使用主坐標分析(PCoA)在OUT水平展示細菌群落的β多樣性(圖4)。

圖4 不同填料上細菌群落組成的 主坐標分析 (PCoA)Fig.4 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacterialcommunity composition on different fillers

不同填料上的細菌群落樣本各自聚集，上、下層風化煤間的距離接近。ANOSIM相似性分析表明，不同填料上的細菌群落組成存在顯著差異(P<0.05)。

2.5 細菌群落的組成和差異

為了減少群落的復雜性和冗余性，將相對豐度低于1%的群落都歸為稀有種，并為“Others”。不同填料上細菌群落在門水平的組成如圖5所示，共有15類菌門的相對豐度超過1%。其中，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、綠彎菌門(Chloroflexi)和藍細菌門(Cyanobacteria)在濕地中的平均相對豐度超過10%。變形菌門的豐度最高，在所有填料上的相對豐度均超過20%。石英砂上擬桿菌門和陶瓷環(huán)上綠彎菌門的相對豐度也達20%以上，厚壁菌門(Firmicutes)在下層風化煤上的豐度達10%以上。方差分析表明，在上述菌門中，僅有擬桿菌門在不同填料上的相對豐度存在顯著差異(P<0.05)，其在石英砂上顯著富集(圖6)。

圖5 不同填料上細菌群落門水平上的組成Fig.5 Bacteria community structures on different fillers at the phylum level

圖6 不同填料上優(yōu)勢菌門間的豐度差異Fig.6 Differences in the abundance of dominant phyla on different fillers

圖7顯示了濕地中相對豐度大于1%的菌屬。有3類菌屬的平均相對豐度大于3%，分別為藍菌屬(Cyanobium_PCC-6307)(6.84%)、norank_f_ _A4b(5.30%)和芽孢桿菌屬(Bacillus)(3.20%)。除此之外，norank_f_ _Microscillaceae和unclassified_f_ _Chloroflexaceae在上層風化煤中的相對豐度達3.82%和3.52%，下層風化煤中短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)的豐度達4.55%。方差分析表明，上述菌屬中，僅有norank_f_ _Microscillaceae在不同填料上的相對豐度存在顯著差異(P<0.05)，其在上層風化煤中顯著富集(圖8)。

圖7 不同填料上細菌群落屬水平上的組成Fig.7 Bacteria community structures on different fillers at the genus level

圖8 不同填料上優(yōu)勢菌屬間的豐度差異Fig.8 Differences in the abundance of dominant genus on different fillers

3 討論

3.1 濕地的運行效果

江蘇省《池塘養(yǎng)殖尾水排放標準》中將養(yǎng)殖尾水受納水域分為海水、淡水兩種，標準級別定為一級和二級兩類[4]。其中，海水受納水域的限定指標不包含CODMn，用淡水受納水域的限定值代替。參照標準，條子泥墾區(qū)尾水中pH、TN、TP和CODMn分別超出二級排放標準5、3、3和4次。除TP有2次滿足外，其他指標均不滿足一級排放標準。經(jīng)組合濕地凈化后，僅TN存在2次超標現(xiàn)象，pH、TP和CODMn全部滿足二級排放標準。其中，pH除2次高于8.50外，均滿足一級排放標準。因此，組合填料濕地對于墾區(qū)養(yǎng)殖尾水，尤其是對水體pH的調(diào)控具有實際意義。

組合填料濕地對于TN、TP和CODMn的去除率分別為15.92%～43.80%、10.37%～47.76%和2.56%～25.53%，平均去除率為27.22%、36.26%和13.52%，TN在進、出水中的差異不顯著。楊新萍等[13]在野外以蘆葦?shù)[石床構(gòu)建的水平潛流濕地，對于微污染河道水體TN和CODMn的去除率分別為6.10%～37.83%和12.66%～37.03%，凈化效果與本研究近似。然而，秦怡[14]通過將不同填料和植物進行組合，發(fā)現(xiàn)潛流濕地對于河水中TN、TP和CODMn的平均去除率高達52.99%、67.98%和44.51%。隗嵐琳等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件下30 d內(nèi)組合填料垂直潛流濕地對污水處理廠尾水中TN和TP的平均去除率仍可達38.5%和26.8%。比較而言，本研究中組合填料濕地的去除率較低，可能與多種因素有關(guān)。一方面，作為核心填料，風化煤的粒徑遠超過陶粒、礫石等常見填料(3～15 mm)[16]。粒徑大小是影響濕地凈化效果的指標之一，因為相同體積的小粒徑填料具有更大的比表面積，能夠提供更多的物理和化學反應(yīng)位點[17]。另一方面，濕地的污染物去除率與進水濃度相關(guān)[18]。同比于城市生活污水和工業(yè)廢水，養(yǎng)殖尾水中的污染物含量更低，處理難度更大[6]。與此同時，組合填料濕地搭建于野外，容易受到天氣、溫度等環(huán)境因素變化的影響。

3.2 堿蓬的生長和填料的性能

3.3 細菌群落結(jié)構(gòu)

門水平上，將相對豐度高于10%的菌門作為優(yōu)勢菌[22]，則變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和藍細菌門為濕地中的優(yōu)勢菌門。變形菌門的豐度最高，其含有豐富的反硝化菌屬，對于系統(tǒng)中TN的去除起主要作用[23]。擬桿菌門中的大多細菌對有機物具有降解作用，是人工濕地中常見的菌群[24]。相對于陶瓷環(huán)和風化煤，石英砂更有利于擬桿菌門的富集。屬水平上，將相對豐度高于3%的菌屬作為優(yōu)勢菌，則濕地中的優(yōu)勢菌屬包括藍菌屬、norank_f_ _A4b和芽孢桿菌屬。藍菌屬為藍細菌中的一類，其在藍藻水華中常作為優(yōu)勢類別出現(xiàn)[25]。然而，藍菌屬在人工濕地中并不常具有較高豐度[26-27]。在組合濕地運轉(zhuǎn)時，河道水體藍菌屬的富集可能直接影響了濕地中藍菌屬的豐度。norank_f_ _A4b和芽孢桿菌屬在脫氨系統(tǒng)中經(jīng)常出現(xiàn)，可參與大分子有機物的降解和反硝化過程[28-29]，它們在濕地中的富集有利于水中氮和有機質(zhì)的去除。已有研究發(fā)現(xiàn)，Microscillaceae科的細菌在好氧膜生物反應(yīng)器中占據(jù)主導地位，并與有機污染物的變化呈正相關(guān)[30]。盡管無法確定準確的分類信息，但norank_f_ _Microscillaceae的富集可能會直接提高上層風化煤的凈水能力。

4 結(jié)論

在70 d的運行中，以堿蓬、風化煤、陶瓷環(huán)和石英砂新建的組合填料垂直潛流濕地系統(tǒng)表現(xiàn)出長期穩(wěn)定的降pH效果。受粒徑大小、進水濃度等因素的影響，濕地對于條子泥墾區(qū)池塘養(yǎng)殖尾水的TN、TP和CODMn的平均去除率較低，分別為27.22%、36.26%和13.52%。養(yǎng)殖尾水經(jīng)凈化后基本滿足江蘇省池塘養(yǎng)殖尾水排放二級標準，pH基本滿足一級標準。這表明組合填料濕地對于養(yǎng)殖尾水，尤其是對水體pH的調(diào)控具有實際意義。運行結(jié)束后，濕地中不同填料的去TAN效果和微生物群落結(jié)構(gòu)不同。風化煤作為濕地填料具有應(yīng)用價值，但需要確定合適的粒徑大小。

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