牛乃琪，劉 倩，侯欣華，劉 欣，王立剛，趙福平，高紅梅，石麗君，王立賢，張龍超

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

在脊椎動物進(jìn)化中，豬是為數(shù)不多存在脊椎數(shù)變異的動物之一。北京黑豬是20世紀(jì)60年代由巴克夏、大白以及中國地方豬種雜交形成的一個地方豬種，其脊椎數(shù)(胸椎和腰椎的總和)存在從20～23節(jié) 的表型變異。脊椎數(shù)是高遺傳力(0.6～0.62)的經(jīng)濟(jì)性狀，它的增加對于動物的體尺、胴體長、胴體重和生產(chǎn)性能有顯著的正向影響。在豬中胸腰椎數(shù)的變異極大，頸椎和薦椎數(shù)基本固定，頸椎數(shù)一直固定在7節(jié)，薦椎數(shù)固定在4節(jié)，尾椎數(shù)雖有較大差異但與胴體長無關(guān)。研究表明，每增加一根脊椎胴體長將增加80 mm。Wada等將影響豬脊椎數(shù)的QTL定位在1號染色體上(SSC1)；隨后，Sato等構(gòu)建了梅山母豬×杜洛克公豬的F2資源群體，將影響胸腰椎總數(shù)的QTL定位于SSC1和SSC7上。通過進(jìn)一步的深入研究，在SSC1上發(fā)現(xiàn)了核受體亞家族6A組成員1(6A1)，在SSC7上發(fā)現(xiàn)了椎骨發(fā)育相關(guān)基因()和潛在轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2(2)。

6A1是一個在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用的基因，在早期小鼠胚胎和后期發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)。在體節(jié)發(fā)生過程中，突變的胚胎會形成13體節(jié)而代替原來的25體節(jié)。6A1是一個利用多種輔抑制因子復(fù)合物來抑制和沉默基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄抑制因子，錯義變異發(fā)生在鉸鏈結(jié)構(gòu)域，這是6A1與核受體輔阻遏子1 (NCoR1)和核受體相關(guān)蛋白80 (RAP80)相互作用的必要條件。

2亦稱10，是基因家族中獨(dú)一無二的一簇，它們在脊椎動物軸向骨骼進(jìn)化中發(fā)揮著核心作用。被認(rèn)為是影響脊椎數(shù)強(qiáng)有力的候選基因。隨后試驗(yàn)證明，是一種新型的位于細(xì)胞核中的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在全基因組范圍內(nèi)與DNA結(jié)合，并調(diào)節(jié)一組含有結(jié)合基序的基因轉(zhuǎn)錄。2是包含LTBPs 1-4和fibrillins 1、2和3的LTBP-fibrillin的基因家族中的一部分，LTBP家族是一組細(xì)胞外多結(jié)構(gòu)域蛋白，具有多種獨(dú)特的生物學(xué)特性。所有的4種 LTBP異構(gòu)體都與fibrillin微纖維相關(guān)，LTBP-1、2和4的C端都與fibrillin-1 N端相似的區(qū)域相互作用。2是家族唯一一個不與TGFβ結(jié)合而可以獨(dú)立存儲和激活的成員。

雖然上述4個基因已被認(rèn)為是影響脊椎數(shù)及胴體性狀的候選基因，但在北京黑豬中的多態(tài)性及與性狀的關(guān)聯(lián)分析尚未見報道。本研究旨在對4個基因的所有外顯子區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、突變位點(diǎn)檢測及開展基因型與脊椎數(shù)及胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，以期探索調(diào)控性狀變異的候選基因功能位點(diǎn)，為下一步闡釋性狀變異的遺傳機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織樣品的采集及表型數(shù)據(jù)的測定和記錄

收集(210±7)日齡的410頭北京黑豬組織樣并記錄脊椎數(shù)和胴體性狀。動物均飼養(yǎng)在北京黑六牧業(yè)科技有限公司。

1.2 DNA提取

使用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)進(jìn)行組織樣品的DNA提取，使用超微量分光光度計(IMPLEN)進(jìn)行DNA濃度、核酸與蛋白及酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長比值(260 nm/280 nm)、核酸與碳水化合物最高吸收峰的吸收波長比值(260 nm/230 nm)的檢測，并用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測評估，將質(zhì)量合格的DNA樣品放入-20 ℃的冰箱中存放。

1.3 引物設(shè)計及合成

利用Primer Premier 5.0對6A1(NM_001097499.1)、2(XM_021100021.1)、(NM_001195113.1)及2(XM_021099520.1)基因共設(shè)計53對引物，由于引物較多，本研究將找出突變位點(diǎn)的引物列于表1，設(shè)計好的引物均有北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

采用25 μL的反應(yīng)體系(Code：P505-d1，Vazyme)：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，0.5 μL 聚合酶，0.5 μL dNTP，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，8.5 μL 無菌水，1 μL 模板。PCR程序如下(ABI，Singapore)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s， 57～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。對410頭北京黑豬使用96孔板采用以上程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物通過1.5%凝膠進(jìn)行切膠回收單一條帶，在北京六合華大基因科技有限公司平臺進(jìn)行雙向的Sanger測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

對PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物測序后使用DNAStar中的SeqMan進(jìn)行基因分型，使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行基因型頻率和等位基因頻率的統(tǒng)計。使用SAS 9.2進(jìn)行表型與基因型的關(guān)聯(lián)分析，采用Duncan′s多重檢驗(yàn)評估不同基因型之間差異的顯著性(<0.05)，數(shù)據(jù)使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，<0.05判定為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 北京黑豬表型數(shù)據(jù)的描述

410頭北京黑豬個體的表型值(脊椎數(shù)和胴體性狀)，脊椎數(shù)的均值達(dá)21節(jié)，變異系數(shù)為2.76%；胴體長的均值達(dá)97.99 cm，變異系數(shù)為4.84%；胴體直長的均值達(dá)89.88 cm，變異系數(shù)為4.53%；胴體斜長的均值達(dá)76.12 cm，變異系數(shù)為4.35%；胴體重的均值達(dá)64.32 kg，變異系數(shù)為11.72%(表2)。

表2 脊椎數(shù)和胴體性狀的表型值統(tǒng)計

2.2 NR6A1、VSX2、VRTN和LTBP2基因突變位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率

通過對4個基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后共發(fā)現(xiàn)15個突變(表3和表4)分別在CDS和3′UTR區(qū)，其中1個 為2基因的同義突變，5個為基因的3′UTR突變和9個為2基因的3′UTR突變。這15個SNPs的基因型頻率變化范圍為4%～78%，其等位基因頻率變化范圍15%～85%。

表3 北京黑豬中VSX2和VRTN突變位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計

表4 北京黑豬中LTBP2突變位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計

2.3 NR6A1、VSX2、VRTN和LTBP2的15個SNPs的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

6A1、2、和2基因通過PCR擴(kuò)增篩選得到的15個SNPs位點(diǎn)(2上1個同義突變；上5個3′UTR；2上9個3′UTR)的基因型與北京黑豬的脊椎數(shù)、胴體長、胴體直長、胴體斜長及胴體重的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表5和6。2上1個同義突變c.536 G>A與脊椎數(shù)顯著相關(guān)，與與胴體長、胴體直長、胴體斜長及胴體重?zé)o顯著相關(guān)；上c.2598 A>G、c.2607 G>T與脊椎數(shù)、胴體長、胴體直長和胴體斜長關(guān)聯(lián)顯著，與胴體重關(guān)聯(lián)不顯著，c.2715 C>T與脊椎數(shù)、胴體長、胴體直長、胴體斜長和胴體重關(guān)聯(lián)不顯著，c.3087 G>C只與胴體斜長關(guān)聯(lián)顯著，與脊椎數(shù)、胴體長、胴體直長和胴體重關(guān)聯(lián)不顯著，c.3094 A>G與脊椎數(shù)和胴體斜長關(guān)聯(lián)顯著，與胴體長，胴體直長和胴體重關(guān)聯(lián)不顯著；2上6個(c.7158 A>G、c.6869 C>T、c.6319 G>C、c.6246 G>T、c.6170 A>G、c.6079 G>T)與脊椎數(shù)差異顯著相關(guān)，但與胴體長、胴體直長、胴體斜長及胴體重關(guān)聯(lián)均不顯著。

表5 VSX2和VRTN基因6個SNPs與脊椎數(shù)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

豬的脊椎數(shù)是一個重要的影響豬體型性狀的高遺傳力經(jīng)濟(jì)性狀。對豬的脊椎數(shù)經(jīng)過長期的研究，將QTL定位在了SSC1和SSC7上。研究表明，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析得到，SSC1上的6A1被認(rèn)為是影響脊椎數(shù)和體長性狀的候選基因，并發(fā)現(xiàn)6A1(c.748C>T)發(fā)生堿基替換，導(dǎo)致了192密碼子脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?。等位基因T在所研究的西方商業(yè)種豬中(杜洛克，大白和長白豬)似乎都是固定的，而在中國本地豬種和野豬中表現(xiàn)出更高的CC基因型頻率。不僅如此，6A1基因的多態(tài)性對豬的體尺的增減及家豬和野豬的區(qū)分有重要影響。已有研究表明，6A1基因的滲入對于河南本土豬的體型大小和飼料轉(zhuǎn)化率有顯著影響。本研究通過對6A1基因的全部外顯子區(qū)在北京黑豬群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)均是固定的TT基因型，也未發(fā)現(xiàn)其他與脊椎數(shù)和胴體性狀顯著相關(guān)的突變。

在SSC7上，2(也稱10)由于可以阻止肋骨的形成，因此對脊椎動物脊柱腰椎區(qū)的形成至關(guān)重要?；谒闹匾裕瑢ζ溥M(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)了一個同義突變(c.536 G>A)，這一突變對脊椎數(shù)有著顯著影響?；蛭挥赟SC7上，是影響豬多個性狀的候選基因，如脊椎數(shù)變異、繁殖性狀等，且在脊椎形成過程中是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。先前報道了變體與中國和西方豬種的胸椎數(shù)(肋骨數(shù))顯著相關(guān)，在研究中將作為獲得豬高脊椎數(shù)和長度相關(guān)性狀的有效選擇標(biāo)記，是影響幾個西方豬種肉品質(zhì)可能的基因標(biāo)記。基于以上研究，Yang等利用中國地方豬種二花臉以及白杜洛克與二花臉構(gòu)建的F2群體和兩個西方品種證明了突變的因果突變很可能是從中國豬種滲入歐洲豬種的。本研究在基因中發(fā)現(xiàn)5個 3′UTR突變，3個(c.2598 A>G、c.2607 G>T、c.3094 A>G)與脊椎數(shù)顯著相關(guān)的SNPs；2個(c.2598 A>G、c.2607 G>T)與胴體長及胴體直長顯著相關(guān)的SNPs；4個(c.2598 A>G、c.2607 G>T、c.3087 G>C、c.3094 A>G)與胴體斜長顯著相關(guān)的SNPs。

表6 LTBP2基因9個SNPs與脊椎數(shù)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

隨著研究的不斷深入，在大白與民豬構(gòu)建的F2資源群體中通過GWAS及單倍型的分析將SSC7上的區(qū)間縮小至951 kb，并將影響豬脊椎數(shù)的主效候選基因定位在此區(qū)間的2上。之后對長白豬與韓國本地豬的F2代群體進(jìn)行了GWAS及單倍型的連鎖與連鎖不平衡分析，將關(guān)鍵區(qū)域定位在包括2在內(nèi)的533.9 kb區(qū)域，更加驗(yàn)證了2基因可作為影響豬脊椎數(shù)的候選基因。本研究在北京黑豬中共發(fā)現(xiàn)了9個3′UTR突變，其中c.7158 A>G、c.6869 C>T、c.6319 G>C、c.6246 G>T、c.6170 A>G、c.6079 G>T與脊椎數(shù)差異顯著相關(guān)，但是與胴體性狀關(guān)聯(lián)不顯著。

4 結(jié) 論

本研究通過使用410頭北京黑豬對6A1、2、和2等4個基因進(jìn)行多態(tài)性探索及與脊椎數(shù)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)15個 SNPs，其中2、和2上10個SNPs與脊椎數(shù)顯著相關(guān)；僅上4個SNPs與胴體性狀顯著相關(guān)，為探索調(diào)控性狀變異的候選基因功能位點(diǎn)和闡釋性狀變異的遺傳機(jī)理奠定基礎(chǔ)。