賀顯晶，蔣 凱，肖佳薇，郭東華

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319)

牛壞死桿菌()屬于梭桿菌屬，是一種革蘭陰性，無鞭毛，不形成芽胞和莢膜的嚴格厭氧菌，其廣泛存在于自然界中。早期發(fā)現(xiàn)牛壞死桿菌是一個以繼發(fā)感染為主的典型“機會主義”病原，是引起牛肝膿腫、腐蹄病和壞死性喉炎的主要病原菌，近年來大量研究顯示在奶牛乳腺炎和子宮內膜炎等疾病發(fā)生過程中牛壞死桿菌也發(fā)揮重要作用。牛壞死桿菌入侵后，主要通過釋放白細胞毒素、溶血素、LPS等對機體造成損傷。當前針對白細胞毒素、溶血素等的靶標蛋白制備的疫苗，雖能在一定程度上抑制牛壞死桿菌的感染，但免疫保護效果與臨床應用仍存在很大的差距。因此，僅針對牛壞死桿菌常規(guī)毒力因子研究其致病機制和防治方案遠遠不夠，有必要對牛壞死桿菌其他功能蛋白進行拓展性研究。

病原菌黏附宿主細胞或組織是病原菌侵襲及致病的先決條件，病原菌利用表面的黏附分子與宿主細胞表面受體相互作用完成其對宿主細胞的黏附。當前有關于牛壞死桿菌黏附的相關研究尚屬空白，因此，從黏附宿主細胞角度探索牛壞死桿菌感染機制是牛壞死桿菌病抗感染研究的新方向。由于牛壞死桿菌不具有菌毛、鞭毛和莢膜等細菌黏附相關結構，經胰酶處理后，壞死桿菌黏附細胞數(shù)量顯著降低。且與牛壞死桿菌同菌屬的具核梭桿菌中，一些外膜蛋白(FomA、FadA和Fap2等)在具核梭桿菌黏附及入侵中發(fā)揮重要作用。因此，作者推測外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)在牛壞死桿菌黏附中發(fā)揮潛在作用。2013年，Sun等首次在牛壞死桿菌H05菌株上鑒定了43K OMP，并發(fā)現(xiàn)其與梭桿菌屬中具核梭桿菌、變異梭桿菌和潰瘍梭桿菌等的OMPs相似，進一步研究發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于牛羊腐蹄病的壞死桿菌臨床分離株中。前期筆者所在課題組初步驗證了牛壞死桿菌43K OMP對BHK-21細胞、牛乳腺上皮細胞和牛子宮內膜細胞具有黏附作用，但針對43K OMP在牛壞死桿菌黏附細胞中的作用未進行深入探討及定量分析。因此，明確43K OMP在牛壞死桿菌黏附中的作用，將為牛壞死桿菌感染機制的理解和抗菌策略提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞及載體 壞死桿菌A25菌株購自美國ATCC公司(，亞種，ATCC 25286)，基因缺失菌A25Δ43K OMP為前期研究中通過同源重組技術制備獲得，保存于黑龍江八一農墾大學獸醫(yī)分子病理學實驗室，鼠乳腺上皮細胞(EpH4-Ev)由吉林大學農學部惠贈，小鼠肝細胞(AML12)購于中國科學院干細胞庫(編號：SCSP-550)，牛壞死桿菌43K OMP多克隆抗體血清、牛壞死桿菌高免血清、牛壞死桿菌43K OMP多抗血清、牛壞死桿菌43K OMP單克隆抗體、兔陰性血清及鼠陰性血清均保存于黑龍江八一農墾大學獸醫(yī)分子病理學實驗室。

1.1.2 主要試劑與儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生物技術有限公司，DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、HEPE、LiCl、LDS、SLS、ITS、地塞米松均購于美國Sigma公司，胰酶等購于Gibco公司，F(xiàn)BS購于Clark公司，Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG、Triton X-100、抗熒光淬滅封片液購于碧云天生物技術有限公司，ExDNA聚合酶等購于寶生物生物工程有限公司，二甲基亞砜、麥氏比濁管購于索萊寶生物科技有限公司，甲砜霉素購于阿拉丁試劑公司；所有引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。全自動厭氧培養(yǎng)箱購于上海躍進醫(yī)療器械有限公司，TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)及鑒定 將牛壞死桿菌A25菌株和基因缺失菌A25Δ43K OMP甘油凍存菌復蘇接種于預還原的苛養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱內進行細菌培養(yǎng)，溫度為37 ℃，氣體條件：85 mL·LN、5 mL·LCO和10 mL·LH，革蘭染色和PCR鑒定后，按照1∶100傳代，傳3～4代后用于細菌黏附試驗，同時基因缺失菌A25Δ43K OMP培養(yǎng)基中添加2 μg·mL的甲砜霉素?；蛉笔Ь鶤25Δ43K OMP為本實驗室前期通過同源重組方法獲得，以A25菌株DNA為模板擴增同源重組片段，將其與甲砜霉素抗性基因連接并克隆入自殺質粒pCVD442獲得打靶質粒。通過電轉化，將打靶質粒轉入β2155，獲得供體菌。將供體菌與受體菌A25菌株接合試驗后通過抗性篩選、PCR技術和基因測序技術對菌落克隆進行篩選和鑒定。本研究中利用引物Porin-outF5/Porin-outR5和Porin-outF3/Porin-outR3(表1)，對基因缺失株5′端和3′端插入片段進行PCR鑒定，采用50 μL PCR擴增體系：DNA模板0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，滅菌純水20.5 μL，DNA聚合酶25 μL， DMSO 3 μL。 PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定。

表1 引物序列設計

1.2.2 重組蛋白和天然蛋白的制備 參照文獻[17,19]等的方法進行牛壞死桿菌天然43K OMP的提取，參照賀顯晶等的方法構建牛壞死桿菌43K OMP原核表達載體，進行牛壞死桿菌43K OMP的表達，其中蛋白的純化和復性委托北京海蓋德科技有限公司完成。

1.2.3 43K OMP對鼠乳腺上皮細胞的黏附試驗 將鼠乳腺上皮細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，調整細胞濃度培養(yǎng)24 h后，PBS漂洗細胞3次，4%多聚甲醛固定細胞1 h，PBST漂洗3次，除去多余的固定液。3 mL·LBSA室溫封閉2 h，PBST充分漂洗3次。試驗組加入重組蛋白和天然蛋白，每孔加入濃度為25 μg·mL，對照組加入BSA，室溫孵育1 h。孵育結束后，PBST充分漂洗3次，去除未黏附的蛋白和培養(yǎng)基，加入43K OMP單克隆抗體(稀釋度為1∶400)4 ℃孵育過夜，預冷的PBST充分漂洗3次， 去除游離抗體；加入Alexa Fluor 488標記的二抗(1∶500 稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBST充分漂洗3次， 抗熒光淬滅劑封片，4 ℃冰箱內避光保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。

1.2.4 天然蛋白競爭試驗 將鼠乳腺上皮細胞或鼠肝細胞消化接種于6孔板中(1×10·mL)，細胞生長到覆蓋率85%～90%后每孔加入天然43K OMP(100 μg·mL)，對照組不加入43K OMP，37 ℃孵育1 h，PBS緩沖液清洗3次，以去除未黏附的OMPs。將對數(shù)生長期的牛壞死桿菌用完全培養(yǎng)基制備濃度為10CFU·mL的菌懸液，分別與兩組細胞37 ℃共孵育1 h。PBS緩沖液清洗3～5次， 以去除未黏附的細菌。收集細胞懸液后接種于FAB固體平板中，厭氧箱內培養(yǎng)24～48 h后計數(shù)。

1.2.5 抗體抑制試驗 將鼠乳腺上皮細胞或鼠肝細胞消化接種于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，PBS緩沖液清洗3次。將處于對數(shù)生長期的牛壞死桿菌菌液離心收集菌體，PBS溶液重懸離心3次，加入完全培養(yǎng)基調節(jié)細菌濃度為10CFU·mL備用。按照1∶200和1∶50的濃度將43K OMP多抗和單抗與上述菌液厭氧37 ℃孵育1 h。同時設置陰性血清組和正常細菌組作為對照組，將菌懸液與細胞共孵育1 h后棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3～5次，以除去未黏附的細菌。用細胞刮刀將細胞刮下后用提前厭氧的BHI培養(yǎng)基重懸，按照倍比稀釋后將細胞懸液涂布于FAB固體平板上，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h 后，對菌落進行計數(shù)。

1.2.6 43K OMP基因缺失對壞死桿菌黏附力的影響 細胞消化接種于6孔板中，待細胞生長成良好的單層細胞且達到一定密度后，將培養(yǎng)好的牛壞死桿菌A25菌株和基因缺失株A25Δ43K OMP按照相同比例接種于BHI液體培養(yǎng)基內，37 ℃厭氧培養(yǎng)18～28 h，將處于對數(shù)生長期的菌液用提前厭氧處理的PBS溶液洗滌3～4次，完全培養(yǎng)基重懸后用麥氏比濁管調整細菌濃度為10CFU·mL備用。分別取2 mL加入到細胞培養(yǎng)板內，37 ℃厭氧培養(yǎng)1 h，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，洗去未黏附的細菌。用細胞刮刀將細胞刮下后用厭氧的BHI培養(yǎng)基重懸倍比稀釋后涂布于FAB固體平板上，基因缺失菌在FAB固體平板中添加2 μg·mL的甲砜霉素，厭氧培養(yǎng)24～48 h進行菌落計數(shù)。

2 結 果

2.1 牛壞死桿菌43K OMP對鼠乳腺上皮細胞的黏附

將鼠乳腺上皮細胞與天然蛋白和重組蛋白共孵育后，經免疫熒光顯色后發(fā)現(xiàn)天然蛋白組和重組蛋白組的細胞膜處激發(fā)綠色熒光，而對照組無熒光出現(xiàn)(圖1)，表明天然和重組的43K OMP均能黏附于上皮細胞細胞膜表面。

圖1 牛壞死桿菌43K OMP與鼠乳腺上皮細胞的黏附(標尺=50.1 μm)Fig.1 The adherence of the 43K OMP of F. necrophorum to mouse mammary epithelial cells(bar=50.1 μm)

2.2 天然蛋白對牛壞死桿菌黏附的影響

當細胞與天然43K OMP預孵育1 h后，外膜蛋白組和對照組黏附鼠乳腺上皮細胞的牛壞死桿菌數(shù)量分別為2.3×10和2.79×10CFU·mL； 而外膜蛋白組和對照組黏附鼠肝細胞的牛壞死桿菌數(shù)量分別為1.75×10和2.48×10CFU·mL。由此，筆者發(fā)現(xiàn)當細胞與天然43K OMP預孵育1 h后，與空白對照組相比，黏附于鼠乳腺上皮細胞和鼠肝細胞的牛壞死桿菌菌量顯著降低(<0.05)(見圖2)。結果表明：天然43K OMP蛋白能競爭牛壞死桿菌對鼠乳腺上皮細胞和鼠肝細胞的黏附。

2.3 抗體對牛壞死桿菌黏附的影響

當牛壞死桿菌與43K OMP多抗共孵育后，鼠乳腺上皮細胞抗體組、陰性血清對照組和細菌對照組細胞上黏附的牛壞死桿菌數(shù)量分別為1.50×10、2.29×10和2.35×10CFU·mL(圖3A)；鼠肝細胞抗體組、陰性血清對照組和細菌對照組細胞上黏附的牛壞死桿菌數(shù)量分別為1.47×10、2.79×10和2.82×10CFU·mL(圖3B)。而當牛壞死桿菌與43K OMP單抗共孵育后，鼠乳腺上皮細胞抗體組、陰性血清對照組和細菌對照組細胞上黏附的牛壞死桿菌數(shù)量分別為1.63×10、2.50×10和2.55×10CFU·mL(圖3C)；鼠肝細胞抗體組、陰性血清對照組和細菌對照組細胞上黏附的牛壞死桿菌數(shù)量分別為1.97×10、2.53×10和2.67×10CFU·mL(圖3D)。因此，牛壞死桿菌與43K OMP多抗或單抗共孵育后能顯著降低黏附于鼠乳腺上皮細胞和鼠肝細胞上的牛壞死桿菌數(shù)量(<0.000 1)。以上結果顯示，43K OMP抗體能顯著降低黏附于細胞上的牛壞死桿菌數(shù)量。

A. 天然43K OMP對牛壞死桿菌黏附鼠乳腺上皮細胞的影響；B. 天然43K OMP對牛壞死桿菌黏附鼠肝細胞的影響。**.P<0.01； ***.P<0.001A. The effect of F. necrophorum binding to MMECs by preincubated with native 43K OMP protein; B. The effect of F. necrophorum binding to AML12 cells by preincubated with native 43K OMP protein. **.P<0.01; ***.P<0.001圖2 天然43K OMP對牛壞死桿菌黏附細胞的影響Fig.2 The effect of F. necrophorum binding to cells by preincubated with the native 43K OMP protein

2.4 43K OMP基因缺失對牛壞死桿菌黏附力的影響

利用引物Porin-outF5/ Porin-outR5和Porin-outF3/ Porin-outR3分別對菌株進行PCR擴增，電泳結果如圖4。結果顯示，基因缺失株A25Δ43K OMP分別擴增出大小為1 159和808 bp的條帶，而牛壞死桿菌A25菌株未擴增出特異性條帶，此結果與預期相符，表明所選的菌株為43K OMP基因缺失菌和親本菌A25菌株。

為更好地衡量43K OMP基因的缺失對牛壞死桿菌黏附宿主細胞能力的影響，本試驗選用鼠乳腺上皮細胞和鼠肝細胞作為細胞模型。結果顯示：缺失株A25Δ43K OMP和A25菌黏附于鼠乳腺上皮細胞和鼠肝細胞的菌落數(shù)分別為5.69×10和0.32×10CFU·mL，3.23×10和0.31×10CFU·mL，細菌黏附分別降低了94.4%和90.4%(圖5)。同親本株相比，A25Δ43K OMP黏附宿主細胞能力極顯著下降(<0.000 1)，由此可知43K OMP基因的缺失導致壞死桿菌黏附細胞的能力大大降低。

3 討 論

近年來，牛壞死桿菌病給我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展造成了嚴重的經濟損失，由牛壞死桿菌感染引起的牛肝膿腫、腐蹄病、壞死性喉炎、乳腺炎和子宮內膜炎等疾病，嚴重制約了我國規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在肝膿腫、腐蹄病、乳腺炎等疾病中，牛壞死桿菌對瘤胃血管內皮細胞、蹄部損傷的皮膚組織細胞、乳腺上皮細胞和子宮內膜細胞的黏附是引起感染的重要步驟，而有關牛壞死桿菌黏附機制的研究尚未闡明。前期研究發(fā)現(xiàn)，牛壞死桿菌43K OMP能黏附牛乳腺上皮細胞、子宮內膜細胞和BHK-21細胞，且與牛壞死桿菌同菌屬的具核梭桿菌外膜蛋白FomA和FadA，在生物膜形成、細菌黏附及介導免疫中發(fā)揮重要作用。但43K OMP在牛壞死桿菌黏附中究竟扮演什么角色，發(fā)揮怎樣的作用目前尚未可知。因此，明確43K OMP在牛壞死桿菌黏附宿主細胞中的作用，為研究牛壞死桿菌黏附相關蛋白和闡明牛壞死桿菌的致病機制具有重要意義。

本研究以鼠乳腺上皮細胞和鼠肝細胞為細胞模型，免疫熒光試驗結果顯示，天然蛋白和重組蛋白能黏附于鼠乳腺上皮細胞表面，且細胞與天然蛋白預孵育或牛壞死桿菌與抗體預孵育后，細胞上黏附的牛壞死桿菌的數(shù)量降低。其中，天然蛋白競爭結合鼠肝細胞抗體組、陰性血清對照組和細菌對照組細胞上黏附的牛壞死桿菌數(shù)量分別為1.47×10、2.79×10和2.82×10CFU·mL(圖3B)。而當牛壞死桿菌與43K OMP單抗共孵育后，鼠乳腺上皮細胞抗體組、陰性血清對照組和細菌對照組細胞上黏附的牛壞死桿菌數(shù)量分別為1.63×10、2.50×10和2.55×10CFU·mL(圖3C)；鼠肝細胞抗體組、陰性血清對照組和細菌對照組細胞上黏附的牛壞死桿菌數(shù)量分別為1.97×10、2.53×10和2.67×10CFU·mL(圖3D)。因此，牛壞死桿菌與43K OMP多抗或單抗共孵育后能顯著降低黏附于鼠乳腺上皮細胞和鼠肝細胞上的牛壞死桿菌數(shù)量(<0.000 1)。以上結果顯示，43K OMP抗體能顯著降低黏附于細胞上的牛壞死桿菌數(shù)量。

A. 多抗對牛壞死桿菌黏附鼠乳腺上皮細胞的影響；B. 多抗對牛壞死桿菌黏附鼠肝細胞的影響；C. 單抗對牛壞死桿菌黏附鼠乳腺上皮細胞的影響；D. 單抗對牛壞死桿菌黏附鼠肝細胞的影響； ****. P<0.000 1A. The effect of F. necrophorum binding to MMECs by treatment with polyclonal antibody against the recombinant 43K OMP; B.The effect of F. necrophorum binding to AML12 cells by treatment with polyclonal antibody against the recombinant 43K OMP; C. The effect of F. necrophorum binding to MMECs by treatment with monoclonal antibody against the recombinant 43K OMP; D. The effect of F. necrophorum binding to AML12 cells by treatment with monoclonal antibody against the recombinant 43K OMP. ****. P<0.000 1圖3 抗體對牛壞死桿菌黏附細胞的影響Fig.3 The effect of F.necrophorum binding to hosts cells by treatment with antibody

M. DNA相對分子質量標準2000；1、4、5、8. 43K OMP基因缺失株A25Δ43K OMP；2、6. 陰性對照；3、7. 牛壞死桿菌A25菌株M. DNA marker 2000；1, 4, 5, 8. A25Δ43K OMP strain；2, 6. Control；3,7. F. necrophorum A25 strains圖4 43K OMP基因缺失株的PCR鑒定結果Fig.4 The PCR amplification results of the 43K OMP gene deletion strains

A. 牛壞死桿菌A25和基因缺失株A25Δ43K OMP黏附MMECs結果；B. 牛壞死桿菌A25和基因缺失株A25Δ43K OMP黏附AML12細胞結果。****. P<0.000 1A. The attachment of F. necrophorum A25 and A25Δ43K OMP strain to MMECs; B. The attachment of F. necrophorum A25 and A25Δ43K OMP strain to AML12 cells. ****. P<0.000 1圖5 牛壞死桿菌A25和基因缺失株A25Δ43K OMP黏附結果Fig.5 The attachment of F. necrophorum A25 and A25Δ43K OMP strain to host cells

細菌黏附宿主細胞是入侵機體和感染致病的先決條件，其中特異性黏附借助特異性識別分子(細菌黏附素、配體)與靶細胞相應的受體結合，在細菌黏附宿主細胞中發(fā)揮重要作用?；仡櫯乃罈U菌黏附機制相關研究，早期認為牛壞死桿菌與瘤胃上皮細胞的黏附與血凝素有關。隨著OMPs在革蘭陰性細菌黏附中的作用逐漸被揭示，研究顯示介導壞死桿菌黏附的黏附素可能是OMPs，且分子量為17、24、40和74 ku的OMPs可能與壞死桿菌黏附有關。而與牛壞死桿菌同桿菌屬的具核梭桿菌其主要外膜蛋白FomA作為一種重要的黏附蛋白，在細菌黏附、生物膜形成及直腸癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。43K OMP是Sun等首次在牛壞死桿菌鑒定的OMPs，且與FomA相似性達到70.22%，其黏附功能可能與之相似，這也解釋了43K OMP在介導牛壞死桿菌黏附中的重要作用。但針對于牛壞死桿菌43K OMP的其他功能性研究及牛壞死桿菌黏附機制的研究尚未明確，這些問題的闡明將為牛壞死桿菌病的綜合防治提供新思路。

4 結 論

以鼠乳腺上皮細胞和鼠肝細胞為細胞模型，證明43K OMP在牛壞死桿菌黏附細胞中發(fā)揮重要作用。親本株A25株43K OMP基因缺失后對鼠乳腺上皮細胞和肝細胞的黏附率分別下降了94.4%和90.4%，但并未完全喪失其對細胞的黏附力，可見43K OMP在牛壞死桿菌黏附細胞中發(fā)揮關鍵作用，但43K OMP如何發(fā)揮黏附作用的相關機制，有待于進一步探究。