靳 青，張相倫，魏 晨，劉桂芬，劉曉牧，張冬梅，譚秀文*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100；2.鄒城市畜牧業(yè)發(fā)展中心，濟寧 273500)

胚胎早期死亡及流產(chǎn)給奶牛繁殖率和產(chǎn)奶量帶來嚴(yán)重影響，造成極大的經(jīng)濟損失。關(guān)于奶牛的早期胚胎死亡很早就有報道，Ulberg等發(fā)現(xiàn)，輸精后60～90 d約有40%胚胎死亡。Sreenan和Diskin對25年文獻(xiàn)中奶牛胚胎死亡進(jìn)行分期評估，發(fā)現(xiàn)受精卵估測為90%，平均產(chǎn)犢率為55%，表明胚胎死亡率為35%；從受精到妊娠第8天胚胎損失很少，胚胎死亡明顯增加是發(fā)生在授精后的第8～16天之間(27%～31%)。進(jìn)入21世紀(jì)后，盡管在奶牛養(yǎng)殖中采用更科學(xué)的方法和手段，但大量文獻(xiàn)證實妊娠損失仍主要發(fā)生在輸精后8～17 d，尤其在高密度集約化養(yǎng)殖場中，這種情況更加明顯。這一時期正好處于早期胚胎向子宮內(nèi)膜附植之前或附植過程中，即囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體子宮內(nèi)膜細(xì)胞之間逐步建立組織和生理上聯(lián)系的過程。以往研究表明，子宮內(nèi)膜的生理狀態(tài)對妊娠的建立和維持至關(guān)重要。因此，有必要探討奶牛養(yǎng)殖中影響子宮內(nèi)膜生理狀態(tài)的可能機制。

奶牛養(yǎng)殖中應(yīng)激的發(fā)生幾乎不可避免，各種應(yīng)激狀況都會造成大量氧自由基(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Hoelker等和Hailemariam等發(fā)現(xiàn)，患子宮內(nèi)膜炎的奶牛其子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng)的信號通路與凋亡基因網(wǎng)絡(luò)、生物功能等方面交互在一起。Piras等利用脂多糖(LPS)處理奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞72 h后進(jìn)行差異蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LPS組28個蛋白表達(dá)上調(diào)，10個蛋白表達(dá)下調(diào)，這38個差異表達(dá)蛋白與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激密切相關(guān)，其中部分差異表達(dá)蛋白參與胚胎附植過程中激活的通路。然而迄今為止，氧化應(yīng)激如何調(diào)控奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡并未見報道，因此有必要進(jìn)行深入研究。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，死亡受體Fas在細(xì)胞凋亡信號通路中起關(guān)鍵性作用。Fas又稱APO-1或CD95，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，胞質(zhì)區(qū)含有一段由80個氨基酸殘基構(gòu)成的、6個反向平行的α-螺旋形成的高度保守序列，稱為死亡區(qū)(DD)，該區(qū)域?qū)τ诘蛲鲂盘柕膫鲗?dǎo)具有重要作用。配體是FasL又稱CD95L，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，可被金屬蛋白酶裂解形成可溶性形式。Fas通過與三聚化的FasL結(jié)合而被激活，激活的Fas可通過其DD結(jié)合并聚集銜接蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致FADD(Fas-associated death-domain)構(gòu)象改變，此時的FADD可通過其自身的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與具備同源結(jié)構(gòu)的Caspase 8，形成由FasL、Fas、FADD、Caspase 8組成的死亡誘導(dǎo)復(fù)合物(death inducing signaling complex，DISC)，該復(fù)合物具有裂解并激活凋亡蛋白酶Caspase 3的能力，引發(fā)細(xì)胞凋亡過程的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

因此，本研究利用HO構(gòu)建奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，在此基礎(chǔ)上，探討氧化應(yīng)激通過Fas/FasL信號通路影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的可能作用機制，旨在為解決生產(chǎn)中奶牛早期胚胎流產(chǎn)難題提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%Trypsin-EDTA購自Gibco公司；胎牛血清FBS、三抗混合液購自Biological Industries公司；血清白蛋白BSA、HO購自Sigma公司；Annexin V凋亡試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)試劑盒、總谷胱甘肽含量(GSX)試劑盒、氧化型谷胱甘肽(GSSG)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購自碧云天生物公司；引物購自濟南鉑尚生物公司；FasL酶標(biāo)試劑盒購自Scientific公司；TRIzon Reagent購自康為世紀(jì)公司；Hiscript ⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)、Cham QTM SYBR Color qPCR MasterMix購自南京諾唯贊公司。

1.1.2 主要儀器 倒置相差顯微鏡(Nikon)、流氏細(xì)胞儀(BD)、高速冷凍離心機(Eppendorf)、酶標(biāo)儀(伯騰)、CO細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、熒光定量PCR儀(Roche)、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)和處理 奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞系(BEND)購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，取自美國拉勒米懷俄明州發(fā)情第14天的荷斯坦奶牛子宮內(nèi)膜。按照常規(guī)方法將復(fù)蘇的細(xì)胞放入完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%三抗的DMEM/F12培養(yǎng)液)中，置于38.5 ℃、100%濕度、5% CO的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁至80%～90%時用0.25%胰酶(含0.05% EDTA)消化，加入完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×10個·mL。根據(jù)不同試驗?zāi)康模謩e接種到6孔培養(yǎng)板或T25培養(yǎng)瓶中，置于38 ℃、5% CO、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁80%～90%時，分別用100、200、300 μmol·LHO處理6 h，對照組為未添加HO組。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測 用PBS漂洗細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化3～5 min，待細(xì)胞脫落下來后加入含10% FBS的培養(yǎng)液終止消化， 300×、5 min離心，棄掉上清液；加入5 μmol·LDCF-DA輕輕吹打混勻，置于38 ℃、5% CO、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min；用PBS離心洗滌兩次，流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.2.3 SOD和CAT活性檢測 用PBS漂洗細(xì)胞后，消化、離心收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液超聲波作用5 min, 4 ℃、12 000×離心10 min收集上清液；按照SOD和CAT試劑盒說明書要求進(jìn)行活性檢測；采用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定平行樣品蛋白濃度；樣品酶活即為樣品總的酶活性與蛋白濃度的比值，以“單位·mgprotein”表示。

1.2.4 GSH和GSSG檢測 用PBS漂洗細(xì)胞后，消化、離心收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液超聲波作用5 min, 4 ℃、12 000×離心10 min收集上清液；按照GSX和GSSG說明書要求，分別檢測GSX和GSSG含量；采用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定平行樣品蛋白濃度；樣品中GSH含量為GSX與GSSG的差值；樣品GSX、GSSG、GSH濃度即為每個指標(biāo)總含量與蛋白濃度比值。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測 用PBS漂洗細(xì)胞后，消化、離心收集細(xì)胞，加入70%冷乙醇4 ℃固定30 min；離心收集細(xì)胞并用冷PBS于300×、5 min離心洗滌兩次；棄掉上清液收集細(xì)胞沉淀，于含PI、Triton X-100和RNaseA的PBS液中4 ℃孵育1 h；流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 待測細(xì)胞培養(yǎng)板用PBS液洗兩次，加入胰酶37 ℃消化5 min，待大部分細(xì)胞脫落時加入含10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹打，收集細(xì)胞懸液到1.5 mL離心管中，300×離心5 min， 去掉上清液，加入195 μL緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC并輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，再加入10 μL PI染液輕輕混勻，室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.2.7 FasL含量檢測 參考張辰等的方法，在酶標(biāo)板孔中分別加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，然后每孔加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37 ℃避光孵育60 min，洗板5次；每孔加入100 μL生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板5次；加入100 μL顯色底物，37 ℃避光孵育15 min；最后加入100 μL終止液，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，經(jīng)空白校準(zhǔn)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算每個樣品的蛋白濃度。

1.2.8 熒光定量RT-PCR 1)引物設(shè)計：利用Primer 5.0軟件設(shè)計PCR引物(表1)。2)Real-time PCR：利用試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，并通過A260∶A280比值和瓊脂糖電泳檢測RNA純度和完整性。采用試劑盒進(jìn)行cDNA合成，-20 ℃保存?zhèn)溆?。Real-time PCR采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddHO 6 μL；擴增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性10 s，60 ℃ 30 s，反應(yīng)40個循環(huán)；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。設(shè)置內(nèi)參-表達(dá)量作為參照，采用2法計算mRNA的相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列參數(shù)

1.2.9 Western blot 參考張辰等的方法，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗兩次，加入蛋白裂解液反復(fù)吹打，收集裂解液4 ℃高速離心吸取上清液；將所有樣品的總蛋白濃度調(diào)節(jié)至1 mg·mL；向樣品離心管中加入緩沖液，混勻后置于水中煮沸5 min，使蛋白質(zhì)變性；制備5%濃縮膠和12%分離膠，將蛋白樣品加入點樣孔中，濃縮膠和分離膠電泳電壓分別為90 和120 V；70V電壓下轉(zhuǎn)膜30 min；將PVDF膜取出置于含3%BSA的TBST中室溫封閉1 h；取出將PVDF膜置于一抗中4 ℃過夜，TBST洗膜；將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液室溫孵育2 h，TBST洗膜；取出PVDF膜，加入化學(xué)發(fā)光液室溫避光孵育2 min，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行灰度分析，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.2.10基因RNAi 設(shè)計干擾Fas基因的shRNA序列(GAT CCG GAA CGA GTA CAC AGA CAA GAT TCA AGA GAT CTT GTC TGT GTA CTC GTT CCT TTT TTA)，并使用亂碼序列作為陰性對照。將子宮內(nèi)膜細(xì)胞以1×10個·mL接種于6孔培養(yǎng)板，置于38 ℃、5% CO、飽和適度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12～16 h，直至貼壁約30%～40%；加入shRNA-Fas-慢病毒(Lv-shFas)或 shRNA-control-慢病毒(Lv-shCon)感染24 h；棄掉含病毒的培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h；200 μmol·LHO處理細(xì)胞6 h， 收集細(xì)胞用于細(xì)胞凋亡和蛋白檢測。試驗分為4組，分別為：HO和慢病毒未處理組(A組)、HO處理慢病毒未處理組(B組)、HO和Lv-shCon慢病毒處理組(C組)、HO和Lv-shFas慢病毒處理組(D組)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗都重復(fù)3次以上。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件的ANOVA模塊進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)先經(jīng)LSD轉(zhuǎn)換后進(jìn)行單因素方差分析，<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度H2O2對子宮內(nèi)膜細(xì)胞氧化損傷的影響

不同濃度HO處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞6 h，利用流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀分別進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS水平、抗氧化酶SOD和CAT活性以及非酶性抗氧化物質(zhì)GSH/GSSG比值檢測。結(jié)果(圖1)表明， 100 和200 μmol·LHO處理組中ROS熒光探針強度都顯著高于對照組(<0.05)，然而當(dāng)HO處理濃度達(dá)到300 μmol·L時，流式細(xì)胞儀檢測到大量細(xì)胞碎片，說明已有部分細(xì)胞出現(xiàn)碎裂。SOD、CAT酶活性以及GSH/GSSG比值都以HO濃度依賴性降低。上述結(jié)果表明，200 μmol·LHO處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞6 h構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。

A. ROS陽性細(xì)胞比例；B. SOD酶活性；C. CAT酶活性；D. GSH水平；E. GSSG水平；F. GSH/GSSG比值A(chǔ). Percentage of ROS positive cells；B. SOD activity；C. CAT activity；D. Levels of GSH；E. Levels of GSSG；F. Ratio of GSH/GSSG圖1 不同濃度H2O2對子宮內(nèi)膜細(xì)胞氧化損傷的影響Fig.1 Effects of different concentrations of H2O2 on oxidative damage of endometrial cells

2.2 氧化應(yīng)激對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長周期和凋亡的影響

選擇200 μmol·LHO處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞6 h，分別進(jìn)行生長周期和凋亡檢測。結(jié)果(圖2)表明，與對照組相比，200 μmol·LHO處理組顯著提高細(xì)胞凋亡比例(<0.05)和降低細(xì)胞處于S期比例(<0.05)。

A．細(xì)胞周期中S期比例；B. 細(xì)胞凋亡比例A. Percentage of S phase in cell cycle distribution；B. Percentage of cell apoptosis圖2 氧化應(yīng)激對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長周期和凋亡的影響Fig.2 Effects of oxidative stress on cell cycle and apoptosis of endometrial cells

2.3 氧化應(yīng)激對Fas/FasL凋亡通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

選擇200 μmol·LHO處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞6 h，利用qRT-PCR和Western Blot分別檢測Fas/FasL凋亡通路關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果(圖3)表明，與對照組相比，200 μmol·LHO處理組顯著提高、8、3基因的mRNA表達(dá)水平(<0.05)；培養(yǎng)液中FasL濃度以及Fas、Caspase 8、Caspase 3基因的蛋白表達(dá)水平也都顯著升高(<0.05)。

2.4 Fas干擾對細(xì)胞凋亡及Fas/FasL通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步驗證Fas/FasL通路參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，利用慢病毒對Fas基因進(jìn)行RNA干擾，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞Fas干擾后再經(jīng)HO處理6 h，細(xì)胞凋亡率顯著低于HO處理組，培養(yǎng)液中FasL 濃度以及Fas、Caspase 8、Caspase 3蛋白表達(dá)水平也顯著降低。以上結(jié)果說明，F(xiàn)as/FasL凋亡通路參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，異常高的氧化應(yīng)激會在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的氧化中間體(如ROS)，這些中間體是高活性自由基，其是否蓄積取決于氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡。如果細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡被破壞，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生氧化，造成細(xì)胞死亡。SOD和CAT是針對超氧自由基抗氧化防御的關(guān)鍵酶，它們在與氧化應(yīng)激抗性相關(guān)的疾病中活性降低。GSH是一種非酶促抗氧化細(xì)胞因子，在ROS清除和活性物質(zhì)淬滅中起重要作用。本研究選擇200 μmol·LHO作為氧化劑處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞6 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)大量ROS蓄積，SOD和CAT活性顯著降低，以及GSH的抗氧化系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞。說明子宮內(nèi)膜細(xì)胞在此處理條件下受到氧化損傷，造成氧化應(yīng)激。這與Toka?等、Mathachan等、Zhao等報道一致。然而，Harris和Denicola報道，當(dāng)化學(xué)、物理或生物因素引起細(xì)胞應(yīng)激的狀態(tài)下，ROS水平升高超出正常范圍，激活SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等抗氧化酶的表達(dá)和活性，清除過量的ROS，恢復(fù)細(xì)胞的ROS穩(wěn)態(tài)。由此推測，這可能由于當(dāng)細(xì)胞所受的應(yīng)激強度較小或時間較短，抗氧化系統(tǒng)足以抵抗ROS的負(fù)面影響；而當(dāng)細(xì)胞長期處于高濃度HO刺激時，抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致SOD和CAT的活性都降低。

圖3 Fas/FasL凋亡通路關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平Fig.3 Levels of mRNA and protein expression of key genes in Fas/FasL apoptosis pathway

A. H2O2和慢病毒未處理組；B. H2O2處理、慢病毒未處理組；C. H2O2和Lv-shCon慢病毒處理組；D. H2O2和Lv-shFas慢病毒處理組A. Neither treated with H2O2 or lentiviruse；B. H2O2 treated and lentiviruse untreated；C. Infected with Lv-shCon prior to treatment with H2O2；D. Infected with Lv-shFas prior to treatment with H2O2圖4 Fas基因RNAi對細(xì)胞凋亡及Fas/FasL凋亡通路關(guān)鍵基因的影響Fig.4 Effects of RNAi of Fas gene on apoptosis and protein expression of key genes in Fas/FasL apoptosis pathway

研究表明，氧化應(yīng)激通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重影響機體組織或器官的功能。ROS在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用，可以很容易地攻擊生物分子，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。本研究表明，200 μmol·LHO處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞6 h， 凋亡細(xì)胞比例顯著升高。以前研究表明，生理或病理性凋亡刺激對細(xì)胞周期進(jìn)程有影響。因此，本研究有必要對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HO處理降低子宮內(nèi)膜細(xì)胞S期比例，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。由此我們推斷：氧化應(yīng)激可能通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as/FasL信號通路是細(xì)胞和組織中非常重要的凋亡途徑。Fas在正常哺乳動物胸腺、心、肝、肺、睪丸和其他組織，而FasL存在于大網(wǎng)膜、睪丸、胎盤和其他器官中。Fas是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)最重要的上游信號分子，F(xiàn)asL可以作為膜分子或作為哺乳動物細(xì)胞表面的可溶性分子存在。Fas與FasL結(jié)合并伴隨著FADD的募集，引發(fā)下游的Caspase 8激活，隨后形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物 (DISC)進(jìn)而激活Caspase 3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。已有研究證明，在人卵巢顆粒細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、小鼠腸上皮細(xì)胞中，氧化應(yīng)激通過Fas/FasL通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激提高奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞Fas、FasL的mRNA和蛋白表達(dá)水平，說明Fas/FasL信號通路被激活；隨后Caspase 8表達(dá)水平升高，這是Fas介導(dǎo)的Caspase依賴性細(xì)胞凋亡途徑的重要組成部分，然后募集到下游Caspase 3并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。基因表達(dá)抑制后，在一定程度上降低HO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比例以及Fas/FasL通路凋亡相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)一步說明Fas/FasL信號通路參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激通過激活Fas/FasL信號通路促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，這為解釋氧化應(yīng)激對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的不利影響提供了新的見解。