王雪梅，翟 哲，陳巧玲，吳艷茹，吳昊天，黃惠嫻，劉志勇，李崇瑞，滿初日嘎，王鳳陽(yáng)，杜 麗，陳 思

(海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海口市動(dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?70228)

海南黑山羊又稱東山羊，是海南省目前唯一的地方優(yōu)良山羊品種，在全省均有分布，主要集中于萬(wàn)寧、瓊中、儋州、澄邁等市縣。在長(zhǎng)期熱帶環(huán)境的自然選擇下，海南黑山羊形成耐高溫高濕、性成熟早、耐粗飼、抗病力強(qiáng)、無(wú)膻味等特點(diǎn)。研究表明，海南黑山羊的抗病力除了受飼養(yǎng)管理和營(yíng)養(yǎng)水平等因素影響外，還受到基因表達(dá)調(diào)控的影響。因此，通過(guò)基因?qū)用嫜芯亢Ｄ虾谏窖虻目共C(jī)制，對(duì)于山羊疾病的預(yù)防和控制具有重要意義。甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin，MBL)作為一種重要的抗感染免疫分子，是目前發(fā)現(xiàn)的少數(shù)能活化補(bǔ)體系統(tǒng)的膠凝素。補(bǔ)體通過(guò)凝集素途徑在病原體或細(xì)胞表面活化，發(fā)揮消滅病原體和調(diào)理吞噬等免疫防御功能。研究表明，動(dòng)物體內(nèi)的1和2基因分別編碼MBL-A和MBL-C蛋白。其中，2基因編碼的甘露聚糖結(jié)合凝集素C(mannose binding lectin C，MBL-C)是存在于動(dòng)物體內(nèi)、由肝組織合成并分泌到血液中的一種血清型膠凝集素，屬于C型(Ca依賴型)凝集素超家族的成員。MBL-C作為一種急性期蛋白，以激活補(bǔ)體效應(yīng)的方式參與動(dòng)物體內(nèi)的體液免疫途徑，在宿主抵抗病原體感染過(guò)程中發(fā)揮重要的天然抗感染免疫功能。2基因能夠通過(guò)補(bǔ)體依賴和非依賴的機(jī)制中和登革熱病毒，進(jìn)而抑制登革熱病毒的感染。此外，多數(shù)研究表明，2基因的多態(tài)性與感染性疾病的易感性有關(guān)。Fraser等的研究發(fā)現(xiàn)，牛的兩種膠原凝集素基因(1和2)的突變與乳腺炎有關(guān)。牦牛2基因3′-UTR區(qū)的A997C/T1295C位點(diǎn)多態(tài)性與牦牛血清巴氏桿菌抗體水平相關(guān)，提示可能參與牦牛巴氏桿菌體液免疫反應(yīng)。水?；虻亩鄳B(tài)性與水牛抵御布氏桿菌感染的能力顯著相關(guān)，其原因可能是基因的變異導(dǎo)致水牛體內(nèi)MBL表達(dá)的不足，影響了水牛正常的免疫功能。

目前，2基因的研究主要集中在其多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)分析，對(duì)于該基因在山羊上的表達(dá)調(diào)控研究相對(duì)較少。因此，本研究選取海南黑山羊2基因啟動(dòng)子序列1 009 bp，構(gòu)建了一系列啟動(dòng)子截短的pGL3-Basic重組質(zhì)粒。在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并利用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失的pGL3-Basic重組質(zhì)粒。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)所構(gòu)建的重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性變化情況，進(jìn)一步確定山羊2基因的最小核心啟動(dòng)子區(qū)域以及對(duì)2基因起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。期望有助于揭示海南黑山羊2基因表達(dá)分子調(diào)控機(jī)制，為探尋其免疫基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本研究采集2頭海南黑山羊(海南初心牧業(yè)有限公司)的肝組織，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)材料

pGL3-Basic質(zhì)粒、pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒于本實(shí)驗(yàn)室保存，雙熒光素酶基因內(nèi)參pRL-TK載體、Dual-LuciferaseReporter Assay System雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000 Reagent、限制性內(nèi)切酶1、1和1、T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PBS 緩沖液、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Boster美國(guó)公司；2XPCR MasterMix、D2000 DNA maker、1 kb DNA ladder、DEPC水、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；氨芐青霉素(AMP)購(gòu)自索萊寶科技有限公司；293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；NanoPhotometer購(gòu)自德國(guó)Implen公司；DNA 膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小提試劑盒、引物合成購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；測(cè)序由北京六合華大基因公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 進(jìn)化樹(shù)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中檢索并下載20個(gè)物種的2基因序列。用ClustalW(codon)方法對(duì)20條基因CDS區(qū)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MEGA X軟件采用極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。模擬1 000次重復(fù)抽樣中獲得Bootstrap值。

1.3.2 山羊2基因啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索山羊2(NCBI登錄號(hào)：NC_030833.1)基因組DNA信息，并結(jié)合NCBI公布的2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的位置，選取山羊2基因5′UTR上游啟動(dòng)子區(qū)1 009 bp (Chr26：45045136-45046144) 作為研究的序列。使用Promoter 2.0在線軟件對(duì)啟動(dòng)子的序列特征進(jìn)行分析。采用在線軟件JASPAR、AnimalTFDB3.0和Alibaba2對(duì)啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。采用RepeatMasker程序來(lái)預(yù)測(cè)序列的重復(fù)元件。同時(shí)使用MethPrimer軟件對(duì)啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行CpG島預(yù)測(cè)，具體的生物信息學(xué)軟件信息見(jiàn)表1。

表1 生物信息學(xué)分析MBL2啟動(dòng)子區(qū)所用的軟件

1.3.3 山羊2基因啟動(dòng)子截短片段的PCR擴(kuò)增 提取山羊肝組織的基因組DNA，濃度測(cè)定及瓊脂糖凝膠電泳合格后置于-20 ℃?zhèn)溆谩２捎肈NAMAN軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增山羊2基因啟動(dòng)子的7條引物(上游：F1、F2、F3、F4、F5、F6，下游：R)上游引物5′端加1酶切位點(diǎn)，下游引物5′端加1酶切位點(diǎn)，引物具體信息見(jiàn)表2。以山羊肝組織基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為50 μL：基因組DNA模板為200 ng，上下游引物各2 μL，25 μL的2XPPCR MasterMix，ddHO水補(bǔ)齊體系。PCR的擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 kb/2 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸 5 min。將反應(yīng)完成的PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)后利用膠回收試劑盒回收目的條帶。

表2 擴(kuò)增山羊MBL2基因啟動(dòng)子區(qū)的引物信息

1.3.4 山羊2基因啟動(dòng)子報(bào)告重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 使用1酶和1酶在37 ℃分別酶切目的片段和pGL3-Basic空載體2 h，之后用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化酶切反應(yīng)物。將得到的純化產(chǎn)物用T4連接酶16 ℃連接過(guò)夜，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的玻璃平板中培養(yǎng)8～10 h，經(jīng)菌落PCR鑒定出陽(yáng)性單克隆菌落，進(jìn)一步取陽(yáng)性單克隆菌落在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，提取重組質(zhì)粒后經(jīng)限制性內(nèi)切酶1和1酶切和測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的6個(gè)2基因啟動(dòng)子截短重組質(zhì)粒分別命名為pGL3-F1(-945/+64)、pGL3-F2(-741/+64)、pGL3-F3(-629/+64)、pGL3-F4(-483/+64)、pGL3-F5(-304/+64)、pGL3-F6(-45/+64)。將測(cè)序正確的陽(yáng)性單克隆過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)，之后用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，并經(jīng)NanoPhotometer檢測(cè)濃度和純度。

1.3.5 細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 將10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中處于指數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，按每孔2.4×10個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔板，置于37 ℃，5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞的融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine2000 Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。為研究山羊2基因啟動(dòng)子不同區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性，按照Lipofectamine2000∶截短重組質(zhì)?！脙?nèi)參質(zhì)粒pRL-TK為0.5 μL∶200 ng∶4 ng的比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，pGL3-Basic質(zhì)粒為陰性對(duì)照，pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)操作，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染6～8 h將無(wú)血清的培養(yǎng)基換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至48 h后裂解細(xì)胞，利用Promega公司的Dual-LuciferaseReporter Assay System雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和奧地利Tecan公司的Spark多功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶(F值)和海腎熒光素酶(R值)。通過(guò)計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的比值(Luc)來(lái)確定山羊2基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域。

1.3.6 山羊2基因核心啟動(dòng)子區(qū)載體的構(gòu)建 利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增山羊2基因核心啟動(dòng)子區(qū)(-304/-45 bp)的上、下游引物(F7、R1，表1)，并在上、下游引物的5′端分別引入1酶和1酶的酶切位點(diǎn)。以重組質(zhì)粒pGL3-F5為模板，核心啟動(dòng)子區(qū)載體的構(gòu)建過(guò)程參照“1.3.3”和“1.3.4”的操作步驟。將測(cè)序正確的陽(yáng)性單克隆命名為pGL3-F7，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性單克隆并使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

1.3.7 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及定點(diǎn)突變載體的構(gòu)建 通過(guò)在線軟件再次對(duì)山羊2基因的核心啟動(dòng)區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，取它們的交集結(jié)果并篩選出評(píng)分較高的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。參照天根生化科技有限公司的點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)對(duì)預(yù)測(cè)的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)缺失引物，引物的具體信息見(jiàn)表3。以構(gòu)建成功的pGL3-F7重組質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)體系同“1.3.3”，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，18個(gè)循環(huán)，68 ℃ 10 min。將1 μL的1酶及2 μL的10×Green Buffer加到PCR產(chǎn)物中，37 ℃孵育2～3 h。取出10 μL的酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否出現(xiàn)目的產(chǎn)物，采用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，菌液PCR及酶切鑒定陽(yáng)性單克隆，經(jīng)測(cè)序正確的陽(yáng)性單克隆過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。構(gòu)建成功的缺失載體命名為pGL3-轉(zhuǎn)錄因子。

表3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的突變引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism8軟件分析數(shù)據(jù)，one-way ANOVA方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MBL2基因在不同物種中的進(jìn)化樹(shù)分析

為了解2基因在不同物種中潛在的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA X軟件對(duì)20個(gè)物種的2基因編碼序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，山羊2基因編碼序列與反芻動(dòng)物(綿羊、牛)具有較近的遺傳距離，與藍(lán)鯨的遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.2 山羊MBL2基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載山羊2基因啟動(dòng)子序列(-945/+64 bp)，利用Promoter 2.0軟件預(yù)測(cè)山羊2基因-446 bp為啟動(dòng)子位置，分值為1.076。用RepeatMasker程序來(lái)預(yù)測(cè)序列的重復(fù)元件，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)重復(fù)元件LINE1(-945/-618 bp)、LINE2 (-477/-369 bp)。采用Methprimer軟件對(duì)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子序列進(jìn)行CpG島分析，未發(fā)現(xiàn)CpG島存在(圖2)。并利用在線軟件對(duì)啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 MBL2基因的進(jìn)化分析Fig.1 Evolutional analysis of MBL2 gene

圖2 山羊MBL2基因啟動(dòng)子甲基化位點(diǎn)分析Fig.2 Methylation site analysis of goat MBL2 gene promoter

潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在序列中用方框標(biāo)明Putative transcription factor binding sites are boxed in the sequence圖3 山羊MBL2基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果圖Fig.3 Predicted results of transcription factor binding sites in goat MBL2 gene promoter region

2.3 山羊MBL2基因啟動(dòng)子區(qū)截短載體的構(gòu)建

利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)的引物(F1/R、F2/R、F3/R、F4/R、F5/R、F6/R)對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行逐段PCR截短，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)得到6個(gè)不同的逐段截短的單一條帶啟動(dòng)子片段(圖4A)，與預(yù)期的結(jié)果一致。構(gòu)建的重組載體經(jīng)1和1雙酶切鑒定，結(jié)果(圖4B)發(fā)現(xiàn)各個(gè)重組質(zhì)粒酶切后均出現(xiàn)了兩條帶，一條為目的片段1 009、803、693、547、368、109 bp，另一條為4 818 bp的pGL3-Basic片段。將經(jīng)酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送北京六合華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Marker.D2000 DNA marker；A. F1～F6為系列截短的片段；B. F1～F6為重組質(zhì)粒pGL3-F1至pGL3-F6經(jīng)Kpn1和Sac1雙酶切的結(jié)果Marker. D2000 DNA marker; A. F1-F6 is a series of truncated segments; B. F1-F6 was the result of recombined plasmid pGL3-F1 to pGL3-F6 digested with Kpn1 and Sac1 double enzymes圖4 系列截短的MBL2基因啟動(dòng)子序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和重組質(zhì)粒雙酶切的電泳圖Fig.4 The electrophoresis image of PCR amplification products of series truncated promoter sequence of MBL2 gene and double digestion of recombined plasmid

2.4 山羊MBL2基因最小活性區(qū)域的確定

使用Lipofectamine2000將構(gòu)建的6個(gè)雙熒光素報(bào)告載體pGL3-F1～pGL3-F6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子系列截短的雙熒光素酶載體的活性(圖5)。結(jié)果所示，隨著啟動(dòng)子片段的逐段截短，啟動(dòng)子的熒光活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明在啟動(dòng)子區(qū)(-945/-629 bp)中存在著抑制啟動(dòng)子熒光活性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)截短到山羊2基因啟動(dòng)子區(qū)-304/-45 bp之間時(shí)，熒光活性的比值變化最大，啟動(dòng)子的活性降到較低。這一結(jié)果說(shuō)明山羊2基因5′UTR上游啟動(dòng)子區(qū)1 009 bp(-945/+64 bp)具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能，且在啟動(dòng)子區(qū)(-304/-45 bp)為山羊2基因近端的核心啟動(dòng)子區(qū)。

*. P<0.05,**. P<0.01，下同*. P<0.05,**. P<0.01, the same as follow圖5 MBL2啟動(dòng)子截短體pGL3-F1到pGL3-F6的熒光活性檢測(cè)Fig.5 The MBL2 promoter activities of pGL3-F1 to pGL3-F6

2.5 山羊MBL2基因的核心啟動(dòng)子區(qū)的載體構(gòu)建

以構(gòu)建成功的pGL3-F5(-304/+64 bp)重組載體為模板，PCR擴(kuò)增出2基因核心啟動(dòng)區(qū)的片段(圖6A)，構(gòu)建重組載體。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳(圖6B)鑒定出兩條帶，分別為4 818 bp 的pGL3-Basic質(zhì)粒以及259 bp的目的片段。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN比對(duì)與預(yù)期片段一致，說(shuō)明重組載體pGL3-F7構(gòu)建成功。

Marker.D2000 DNA marker；A. 1～2:MBL2基因核心啟動(dòng)子區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；B. MBL2基因核心啟動(dòng)子區(qū)域的重組質(zhì)粒經(jīng)Sac1和Kpn1雙酶切圖Marker. D2000 DNA marker; A. Electrophoresis image of PCR amplification products in the core promoter region of MBL2 gene; B. The recombinant plasmid in the core promoter region of MBL2 gene was digested by Sac1 and Kpn1 enzymes圖6 MBL2基因核心啟動(dòng)子區(qū)域的PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.6 Electrophoresis image of PCR amplification and double digestion of recombinant plasmid in the MBL2 gene core promoter region

2.6 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的缺失載體的構(gòu)建及熒光活性

使用在線軟件JASPAR和AnimalTFDB3.0對(duì)山羊2基因核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2核心啟動(dòng)子區(qū)存在RELA、MZF1、NF-κB2等3個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，與前期預(yù)測(cè)的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果一致(圖7)。以構(gòu)建成功的pGL3-F7為模板，PCR擴(kuò)增出3個(gè)不同的啟動(dòng)子缺失載體pGL3-RELA、pGL3-NF-κB2、pGL3-MZF1(圖8A)，構(gòu)建的缺失載體經(jīng)1和1雙酶切(圖8B)和測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期片段一致。將3個(gè)構(gòu)建成功的缺失載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，48 h后檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光值(F)和海腎熒光值(R)，計(jì)算F/R相對(duì)比值。結(jié)果顯示(圖9)，缺失MZF1的結(jié)合位點(diǎn)后，其熒光活性相對(duì)于對(duì)照組(pGL3-F7載體)上升，說(shuō)明了轉(zhuǎn)錄因子MZF1可能對(duì)山羊2基因的轉(zhuǎn)錄起到負(fù)調(diào)控的作用或者是不起作用。缺失RELA和NF-κB2結(jié)合位點(diǎn)后，pGL3-RELA和pGL3-NF-κB2的熒光活性相對(duì)于對(duì)照組有極顯著下降(<0.01)，說(shuō)明了轉(zhuǎn)錄因子RELA和NF-κB2可能對(duì)山羊2基因的轉(zhuǎn)錄活性有正調(diào)控作用。進(jìn)一步比較pGL3-RELA和pGL3-NF-κB2之間的熒光活性，發(fā)現(xiàn)pGL3-RELA較pGL3-NF-κB2的熒光活性有著顯著的下降(<0.05)。

潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在序列中用方框標(biāo)明Putative transcription factor binding sites are boxed in the sequence圖7 山羊MBL2基因核心啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of transcription factor binding sites in the core promoter region of goat MBL2 gene

A. Marker:1 kb DNA Ladder；1～4: MBL2核心啟動(dòng)子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子(RELA、NF-κB2、MZF1)結(jié)合位點(diǎn)缺失的PCR擴(kuò)增圖；B. Marker:D2000 DNA marker；1～5：MBL2核心啟動(dòng)子區(qū)域重組質(zhì)粒pGL3-F7、結(jié)合位點(diǎn)缺失載體pGL3-MZF1、pGL3-NF-κB2、pGL3-RELA和pGL3-Basic空載體的雙酶切圖A. Marker: 1 kb DNA Ladder; 1-4: PCR amplification diagram of MBL2 core promoter region, transcription factor(RELA,NF-κB2,MZF1) binding site deletion. B. Marker:D2000 DNA marker; MBL2 core promoter region recombinant plasmid pGL3-F7, binding site deletion vector pGL3-MZF1,pGL3-NF-κB2,pGL3-RELA and pGL3-Basic empty vector dual enzyme digestion diagram圖8 MBL2核心啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失載體的PCR擴(kuò)增和雙酶切電泳圖Fig.8 PCR amplification and double digestion electrophoresis images of vectors with deletion of transcription factor binding sites in the MBL2 core promoter region

潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的缺失在序列中用黑色橫線標(biāo)明The deletion of potential transcription factor binding sites are indicated by black horizontal line in the sequence圖9 定點(diǎn)缺失關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的熒光活性測(cè)定Fig.9 Fluorescence activity determination of site-deletions of key transcription factors

3 討 論

C型(Ca依賴型)凝集素基因超家族成員在脊椎動(dòng)物的天然免疫中發(fā)揮著調(diào)理吞噬和抵御外界病原體入侵的作用。2基因作為C型鈣依賴凝集素基因超家族成員之一，在宿主抵御病原體感染的第一道防線中扮演著重要角色。2基因編碼的MBL-C蛋白作為人和動(dòng)物先天性免疫凝集素途徑中的重要組分，能夠在個(gè)體發(fā)育的早期發(fā)揮直接抵御病原體感染的作用。MBL-C普遍存在于人和動(dòng)物的血液中，2基因中的短核苷酸變異(SNVs)與多種感染性疾病的易感性相關(guān)。研究表明，人類2基因1號(hào)外顯子的突變與麻風(fēng)桿菌的易感性有關(guān)。趙中利對(duì)奶牛2基因研究發(fā)現(xiàn)，2基因的多態(tài)性與金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎存在著顯著相關(guān)，其可能的機(jī)理是奶牛2基因突變導(dǎo)致血清中MBL-C水平下降，影響奶牛的免疫功能。2基因作為先天性免疫應(yīng)答機(jī)制的重要組分，是調(diào)控畜禽對(duì)病原體抗性或易感的關(guān)鍵基因。因此，2基因的表達(dá)調(diào)控研究對(duì)探索山羊在抵抗細(xì)菌性感染的機(jī)理中有著重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究利用啟動(dòng)子定位軟件對(duì)2基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 009 bp(-945/+64)的序列上存在MZF1、FOXC2、RELA等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，提示該序列可能屬于啟動(dòng)子區(qū)域。CpG島作為位于真核生物轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近富含GC的序列，具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率的作用。在本研究中，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)山羊2基因啟動(dòng)子序列1 009 bp進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該序列GC含量不高(42.7%)，無(wú)真核生物啟動(dòng)子經(jīng)典CpG島。對(duì)重復(fù)元件預(yù)測(cè)，分析表明該序列存在兩個(gè)重復(fù)元件LINE1(-945/-618 bp)和LINE2 (-477/-369 bp)。通常認(rèn)為重復(fù)元件是由于反轉(zhuǎn)錄元件的插入形成的序列，是生物進(jìn)化過(guò)程中的一種保護(hù)機(jī)制。重復(fù)元件能保護(hù)基因的外顯子、啟動(dòng)子部位免受突變而引起的功能喪失，但其具體的作用機(jī)制還需深入研究。

通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子序列5′端側(cè)翼區(qū)進(jìn)行逐段缺失，聯(lián)合雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)山羊2基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子最小活性區(qū)域介于-304至-45 bp，與奶牛2基因啟動(dòng)子的最小活性區(qū)域介于-85至+52 bp略有差別。進(jìn)一步運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)缺失RELA或NF-κB2的結(jié)合位點(diǎn)，山羊2基因的轉(zhuǎn)錄活性較對(duì)照組極顯著下降，且pGL3-RELA較pGL3-NF-κB2的熒光活性顯著下降。該結(jié)果表明，雖然RELA和NF-κB2的結(jié)合位點(diǎn)僅有3個(gè)堿基的差異，但它們?cè)谡{(diào)控山羊2基因的轉(zhuǎn)錄能力上卻存在顯著差異。究其原因可能是RELA與山羊2基因啟動(dòng)子序列結(jié)合比NF-κB2更穩(wěn)定。研究表明，NF-κB2能與人類免疫缺陷病毒(HIV)的啟動(dòng)子序列穩(wěn)定結(jié)合可能是由RELA對(duì)該序列有比較低的親和力決定。研究報(bào)道，NF-κB2對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的親和力比NF-κB1弱得多，但當(dāng)RELA協(xié)同作用時(shí)，NF-κB2較NF-κB1能更有效地與基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合，進(jìn)而激活基因的定向轉(zhuǎn)錄。綜上所述，盡管NF-κB各亞基在DNA結(jié)合上存在相似性，但它們?cè)诩せ罨蜣D(zhuǎn)錄的能力上卻存在顯著差異。

NF-κB是一類多效性的轉(zhuǎn)錄因子，能識(shí)別并結(jié)合多種靶基因啟動(dòng)子部位上特定的序列，從而啟動(dòng)靶基因的表達(dá)。RELA和NF-κB2均屬于NF-κB家族重要的成員，都具有一個(gè)N端Rel同源結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)其與DNA結(jié)合以及二聚體化。RELA無(wú)前體，其C端有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，具有直接作用于轉(zhuǎn)錄元件促進(jìn)激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。NF-κB2含有前體p100，缺乏轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，沒(méi)有獨(dú)立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能，其同源二聚體可以抑制基因的轉(zhuǎn)錄。因此，NF-κB亞基之間通常是以二聚體的形式存在。研究表明，RELA與NF-κB2組成的異源二聚體存在協(xié)同作用，能共同激活基因的轉(zhuǎn)錄，但是沒(méi)有說(shuō)明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是結(jié)合在基因的同一位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，RELA和NF-κB2有可能以結(jié)合在山羊2基因啟動(dòng)子部位的同一個(gè)位點(diǎn)的方式，從而發(fā)揮了協(xié)同促進(jìn)山羊2基因轉(zhuǎn)錄的作用。

RELA作為一個(gè)真核生物轉(zhuǎn)錄因子，能參與信號(hào)分子和調(diào)節(jié)許多炎癥基因的表達(dá)。RELA是REL家族中研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子成員之一，該轉(zhuǎn)錄因子廣泛地調(diào)節(jié)真核生物基因的表達(dá)并參與到多種生物過(guò)程，如炎癥、腫瘤形成、病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡和增殖等過(guò)程，并與許多炎性相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制有密切的聯(lián)系。研究表明，向肝組織缺失基因的小鼠和正常小鼠的腹腔中注射肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌，缺失RELA小鼠較正常小鼠的免疫力降低，對(duì)病原體的易感性增強(qiáng)，容易使其誘發(fā)肺炎、敗血癥或激活NKT細(xì)胞，說(shuō)明RELA對(duì)小鼠肝感染致病菌期間產(chǎn)生的對(duì)肝具有保護(hù)作用的急性期反應(yīng)至關(guān)重要。在綿羊感染肺炎支原體的過(guò)程中，RELA的轉(zhuǎn)錄水平和磷酸化水平顯著提高，使綿羊體內(nèi)的肺炎支原體數(shù)量增加，說(shuō)明RELA在綿羊肺炎支原體致病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道合胞病毒通過(guò)捕獲RELA到細(xì)胞質(zhì)包涵體中，阻斷被感染細(xì)胞內(nèi)先天免疫信號(hào)的激活，使病毒在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，從而引起牛的呼吸道急性疾病。

NF-κB2是參與NF-κB非經(jīng)典途徑的主要轉(zhuǎn)錄因子，是多種靶基因的關(guān)鍵調(diào)控因子，在炎癥組織中表達(dá)量很高。研究表明NF-κB2通路可影響T細(xì)胞、B細(xì)胞的分化及NK細(xì)胞的功能，該基因的遺傳突變與人的免疫缺陷病相關(guān)。通過(guò)RNAi技術(shù)沉默NF-κB2的表達(dá)，使人類巨細(xì)胞病毒蛋白US31的表達(dá)量降低，并抑制了NF-κB2在單核巨噬細(xì)胞中的激活，這在一定程度上有助于全身性紅斑狼瘡病的治療。

本研究中缺失了轉(zhuǎn)錄因子RELA、NF-κB2的結(jié)合位點(diǎn)，山羊2基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，說(shuō)明RELA和NF-κB2可能在對(duì)調(diào)控山羊2基因的轉(zhuǎn)錄上發(fā)揮了正調(diào)控的作用。2基因作為C型鈣依賴凝集素基因超家族成員之一，其編碼的MBL-C蛋白通過(guò)凝集素途徑激活補(bǔ)體，發(fā)揮調(diào)理吞噬、清除病原體的作用，其免疫防御功能的實(shí)現(xiàn)受到轉(zhuǎn)錄因子RELA、NF-κB2的調(diào)控。因此推測(cè)，轉(zhuǎn)錄因子RELA、NF-κB2可能通過(guò)調(diào)控海南黑山羊2基因在血漿中的表達(dá)水平，增強(qiáng)海南黑山羊?qū)Σ≡w的抵抗力。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)體外試驗(yàn)確定了山羊2基因核心啟動(dòng)子位于-304至-45 bp區(qū)域。結(jié)合在線軟件預(yù)測(cè)、借助定點(diǎn)突變技術(shù)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)初步鑒定NF-κB家族的成員RELA和NF-κB2對(duì)山羊2基因的轉(zhuǎn)錄活性可能有正調(diào)控作用，且RELA和NF-κB2有可能發(fā)揮了促進(jìn)山羊2基因轉(zhuǎn)錄的協(xié)同作用。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究2基因在調(diào)控山羊抗病功能中提供了理論依據(jù)。