呂世琪，馬曉菲，李 兵，賈春暉，王艷超，田樹軍，周榮艷，陳曉勇*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定 071000； 2. 河北唯尊養(yǎng)殖有限公司，衡水 053900；3. 饒陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，衡水 053900)

產(chǎn)羔數(shù)是綿羊重要的經(jīng)濟性狀之一，長期以來綿羊繁殖性狀研究主要集在染色體核基因變異及其遺傳效應(yīng)，其中作為綿羊的多胎主效應(yīng)基因研究較為廣泛，母羊多胎性狀遺傳力為0.1～0.3，可以通過選擇表型和基因型從而提高母羊產(chǎn)羔率。但已有研究發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊體內(nèi)不攜帶基因突變的母羊仍可以觀測到較高的胎產(chǎn)羔數(shù)，由此推斷還存在其他的多羔效應(yīng)基因。隨著動物遺傳學和生物技術(shù)的快速發(fā)展，已有研究表明線粒體基因變異影響畜禽經(jīng)濟性狀，如奶牛的產(chǎn)奶性能、繁殖性能、屠宰性能，肉牛的生長和肉品質(zhì)，豬的繁殖性能和肉品質(zhì)。線粒體在能量代謝、凋亡、分化、信號轉(zhuǎn)導等方面起著關(guān)鍵的作用，最近研究發(fā)現(xiàn)線粒體基因單倍型會影響牛的生理代謝性狀、雞和豬的能量代謝。Reicher等研究報道，綿羊線粒體基因變異與繁殖力相關(guān)。Wang等發(fā)現(xiàn)，線粒體基因多態(tài)性與豬的產(chǎn)活仔數(shù)有關(guān)。2020年，Liu等利用轉(zhuǎn)線粒體細胞模型證實了線粒體基因變異影響豬產(chǎn)仔數(shù)。

線粒體基因組具有母系遺傳特性，通過卵細胞將遺傳信息傳給子代，子代線粒體基因組均來自母本。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊線粒體-(T7719G)基因變異與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，該基因變異對以小尾寒羊為母本的雜交后代羊群產(chǎn)羔數(shù)的影響尚未見報道。在我國北方地區(qū)，常以小尾寒羊為母本進行生產(chǎn)實踐的雜交，因此開展以小尾寒羊為母本的二元雜交羊群線粒體-(T7719G)基因變異遺傳分析，將有利于輔助提高產(chǎn)羔數(shù)，為提高羊群選育質(zhì)量提供分子選種手段。此外，已有研究指出季節(jié)和胎次是影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的重要因素。為此，本研究以小尾寒羊為母本的雜交羊群為研究對象，分析線粒體-(T7719G)基因變異對產(chǎn)羔數(shù)的影響，并將其與季節(jié)、胎次作為變量進行了遺傳學分析，旨在探索-(T7719G)變異基因作為分子標記提高胎產(chǎn)羔數(shù)的可行性，為綿羊分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

1.1.1 試驗動物 試驗羊來自河北唯尊養(yǎng)殖有限公司種羊場，選擇以小尾寒羊為母系的健康適齡繁殖母羊173只，共551次產(chǎn)羔記錄。

1.1.2 主要試驗試劑 血液基因組柱式小量提取試劑盒(康為世紀)、2×Taq PCR MasterMix(博邁德)。

1.1.3 引物設(shè)計 根據(jù)綿羊線粒體基因組序列(GenBank：AF010406)設(shè)計覆蓋綿羊線粒體基因組序列的引物：上游引物：5′-CTACGGTCAATGCTCAGAA-3′，下游引物：5′-GTTGTGGTAGAAGTTGTGTT-3′，該引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 血樣采集與DNA提取 通過頸靜脈進行采血，新鮮血液暫存于含有檸檬酸鈉抗凝劑的離心管中，做好羊號標記，迅速運回實驗室進行DNA提取。血液若需長時間保存，應(yīng)放于-80 ℃環(huán)境內(nèi)。使用血液基因組柱式小量提取試劑盒進行DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.2.2 PCR測序檢測變異 PCR擴增反應(yīng)體系(25 μL)：Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddHO 13.2 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。 使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，其中電泳電壓為100 V，電流為100 mA，時間為30 min。利用PCR產(chǎn)物進行測序，分析鑒定基因型。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測序結(jié)果通過DNAMAN軟件對其數(shù)據(jù)進行拼接，運用Oligo 7 Primer Analysis Software將試驗綿羊序列與綿羊線粒體基因組標準序列(GenBank：AF010406)比對分析。使用EXCEL軟件整理母羊的產(chǎn)羔記錄，開展線粒體-(T7719G)基因型頻率及其與胎產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析。采用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件進行分析比較。

1.3 建立線性回歸模型

線性模型：=++++，其中為產(chǎn)羔數(shù)，為群體均值，為第i個胎次的固定效應(yīng)(i=1，2，3，4，5，6，7)，為第n種-(T7719G) 基因型的固定效應(yīng)(j=1,2)，為第m種產(chǎn)羔季節(jié)的固定效應(yīng)(m=1，2，3，4)，為隨機殘差效應(yīng)。將產(chǎn)羔季節(jié)轉(zhuǎn)換為虛擬變量(虛擬變量1，2，3的值分別為0、0、0時為春季；1、0、0時為夏季；0、1、0時為秋季；0、0、1時為冬季)。

2 結(jié) 果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物

線粒體-(T7719G)基因片段大小為290 bp，電泳結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物條帶清晰，可用于測序。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1～5.樣品1～5的PCR擴增產(chǎn)物M. DNA marker; 1-5. PCR products of sample 1-5圖1 tRNA-Lys(T7719G)基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplification products of tRNA-Lys (T7719G) gene

2.2 PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果如圖2、3所示，線粒體-基因編碼區(qū)7719位點存在T→G變異。

2.3 線粒體tRNA-Lys(T7719G)產(chǎn)羔性能及群體遺傳學分析

-(T7719G)基因多態(tài)性結(jié)果如表1所示，雜交羊群出現(xiàn)G和T兩種等位基因，基因頻率分別為57.80%和42.20%，攜帶G等位基因的母羊平均胎產(chǎn)羔數(shù)較攜帶T等位基因的母羊多0.08只。

圖2 tRNA-Lys基因T7719G變異位點測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of T7719G variation site of tRNA-Lys gene

雜交母羊胎產(chǎn)羔數(shù)分布情況如表2所示，胎產(chǎn)單羔的比例為52.27%，胎產(chǎn)雙羔的比例為36.30%，胎產(chǎn)多羔的比例為11.43%。

2.4 線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及產(chǎn)羔季節(jié)與胎產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析

結(jié)果(表3)表明，胎產(chǎn)羔數(shù)與虛擬變量3、胎次、攜帶G基因數(shù)均有顯著相關(guān)性且具有統(tǒng)計學意義(Significance<0.05)，均呈正相關(guān)(Pearson系數(shù)>0)，胎產(chǎn)羔數(shù)與虛擬變量1和虛擬變量2雖然并沒有顯著相關(guān)性，但由于虛擬變量1、2、3均由季節(jié)變量轉(zhuǎn)化而來，因此將其納入多元線性回歸方程進行分析。相關(guān)分析結(jié)果表明在季節(jié)不變的情況下，胎產(chǎn)羔數(shù)隨胎次及G基因攜帶母羊數(shù)量的增加而增加。

2.5 線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及產(chǎn)羔季節(jié)與胎產(chǎn)羔數(shù)多元線性回歸模型分析

方差分析結(jié)果(表4)表明，檢驗統(tǒng)計量F為3.698，Significance值為0.003，由此可認為線粒體-(T7719G)基因突變、胎次及產(chǎn)羔季節(jié)與胎產(chǎn)羔數(shù)存在顯著差異，模型整體顯著，具有統(tǒng)計學意義。由回歸系數(shù)表(表5)可知，胎產(chǎn)羔數(shù)與胎次、虛擬變量3、攜帶G基因數(shù)之間有顯著線性關(guān)系(Significance < 0.05)，通過容差和VIF值判斷模型不存在嚴重的多重共線性(VIF < 20)。胎產(chǎn)羔數(shù)預(yù)測模型方程為：胎產(chǎn)羔數(shù)=1.201+(-0.009)×虛擬變量1+0.043×虛擬變量2+0.194×虛擬變量3+0.061×胎次+0.123×攜帶G等位基因母羊數(shù)量，回歸方程表明每個-基因突變?yōu)镚等位基因可使群體胎產(chǎn)羔數(shù)增加0.123只。

圖3 tRNA-Lys基因T7719G變異位點測序峰圖Fig.3 Sequencing peak of T7719G variation site of tRNA-Lys gene

表1 線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因型頻率分布及平均胎產(chǎn)羔數(shù)

表2 母羊胎產(chǎn)羔數(shù)分布情況

3 討 論

本研究結(jié)果表明，-(T7719G)基因在小尾寒羊母羊雜交群體中存在兩種等位基因分別為G和T，等位基因頻率為57.80%和42.20%，說明在小尾寒羊母羊群體中G等位基因變異較為普遍，攜帶G等位基因個體平均產(chǎn)羔數(shù)比攜帶T等位基因的個體多0.08只。季節(jié)、胎次是影響綿羊胎產(chǎn)羔數(shù)的重要因素，因此，本研究將上述兩個因素與-(T7719G)基因變異進行了相關(guān)分析，結(jié)果表明，產(chǎn)羔季節(jié)、胎次、基因型對母羊胎產(chǎn)羔數(shù)都具有顯著的影響。這就提示在生產(chǎn)實踐中，盡量在短日照季節(jié)集中配種，在羊群管理中盡量提高經(jīng)產(chǎn)母羊的比例。Wang等發(fā)現(xiàn)了13個線粒體tRNA變異，變異個體的繁殖性能顯著比野生型個體產(chǎn)活仔數(shù)多0.989只，這一結(jié)果與本研究結(jié)果類似，同時表明線粒體tRNA基因與繁殖性能的相關(guān)性，這一結(jié)果與Wang等的報道一致。多元線性回歸分析表明，G等位基因可使胎產(chǎn)羔數(shù)增加0.123只。因此，可以通過提高攜帶G等位基因的母羊個體數(shù)量來提高后代產(chǎn)羔數(shù)。提高產(chǎn)羔率是提高繁殖效率的重要方式，常見育種方式對于低遺傳力的產(chǎn)羔性狀選種效果非常有限，使用分子標記輔助選種可縮短世代間隔提高選育效率。

表3 線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及產(chǎn)羔季節(jié)與胎產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)分析

表4 線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及產(chǎn)羔季節(jié)與胎產(chǎn)羔數(shù)的方差分析模型

表5 線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及產(chǎn)羔季節(jié)與胎產(chǎn)羔數(shù)多元線性回歸系數(shù)

線粒體在保證排卵和胚胎發(fā)育方面具有重要作用。早期胚胎中主要由線粒體通過糖酵解為受精卵提供能量，之后則轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄?。線粒體在卵母細胞發(fā)育成熟過程中的分布變化和線粒體基因組拷貝數(shù)的變化以及產(chǎn)生ATP能力的大小都會影響卵母細胞的發(fā)育情況。線粒體基因組通過非孟德爾遺傳形式影響線粒體功能，作為動物細胞器內(nèi)的唯一遺傳物質(zhì)，只編碼與氧化呼吸鏈相關(guān)的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)運體，具有分子結(jié)構(gòu)簡單、無組織特異性、母系遺傳、拷貝數(shù)高、進化速率快等特點。因其獨特的性質(zhì)，線粒體基因組成為研究進化的重要分子生物學工具。在生殖過程中，線粒體基因組遵循母系遺傳方式，只通過卵細胞將其中的遺傳信息傳給下一代，使得子代中線粒體基因組序列和母親的一致。牟天伊等研究發(fā)現(xiàn)，線粒體基因組拷貝數(shù)與卵母細胞質(zhì)量、胚胎發(fā)育情況有關(guān)，結(jié)果表明線粒體基因組變異會引起線粒體結(jié)構(gòu)、功能的改變，同時也與卵母細胞受精有關(guān)。研究報道，線粒體變異會與生理狀態(tài)有關(guān)，會影響蛋白質(zhì)合成的效率，進而影響表型性狀。線粒體-(T7719G)基因變異通過生殖細胞影響產(chǎn)羔數(shù)的生理機制有待從細胞水平上深入研究。

4 結(jié) 論

-(T7719G)基因在以小尾寒羊為母本的雜交羊群中存在G、T兩種等位基因，等位基因頻率分別為57.80%和42.20%，攜帶G等位基因的母羊平均胎產(chǎn)羔數(shù)較攜帶T等位基因的母羊多0.08只。在季節(jié)因素不變的情況下，產(chǎn)羔數(shù)隨胎次以及攜帶G等位基因母羊個體數(shù)量的增加而增加。建立了胎產(chǎn)羔數(shù)預(yù)測模型方程：胎產(chǎn)羔數(shù)=1.201+(-0.009)×虛擬變量1+0.043×虛擬變量2+0.194×虛擬變量3+0.061×胎次+0.123×攜帶G基因母羊數(shù)量，羊群中增加一個攜帶G等位基因的個體，胎產(chǎn)羔數(shù)增加0.123只。本研究進一步證實-(T7719G)可作為分子標記進行輔助選種，提高以小尾寒羊為母本的羊群產(chǎn)羔數(shù)。