孟 珊，楊 陽，李睿霄，姬夢婷，張 娜，路 暢，蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，曹果清，李步高

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

脂肪組織傳統(tǒng)上被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)主要的能量儲存器官。隨著分子研究層面的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織也是機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官之一，通過分泌大量的脂肪細(xì)胞因子影響全身新陳代謝。脂肪組織分布在動物機(jī)體內(nèi)的多個部位，如皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪等，其中存在于肌纖維之間和肌纖維束之間的肌內(nèi)脂肪，是決定動物肉品質(zhì)的重要因素之一，影響著肉的口感和風(fēng)味。研究顯示，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞來源于肌肉血管基質(zhì)部分(sromal vascular fraction, SVF)中的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，逐步分化形成成熟的脂肪細(xì)胞。近年來，隨著功能基因組學(xué)研究和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的調(diào)控因子被報道參與脂肪生成的調(diào)控。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的RNA分子，通過影響下游關(guān)鍵因子的表達(dá)在脂肪細(xì)胞生成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。但關(guān)于lncRNA調(diào)控肌內(nèi)脂肪生成的研究還較少，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不夠完善。目前，關(guān)于lncRNA調(diào)控脂肪細(xì)胞生成的研究主要集中于下游的分子機(jī)制，lncRNA本身是如何被調(diào)控?其調(diào)控的分子機(jī)制還尚待研究。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，mA)是一類在真核生物RNA上廣泛存在的表觀遺傳修飾，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA本身存在著mA修飾，mA修飾水平的變化影響著lncRNA 功能的發(fā)揮，從而參與細(xì)胞增殖、纖維化、癌癥等的調(diào)控。2014年，首次發(fā)現(xiàn)了去甲基化酶通過mA修飾的靶mRNA的選擇性剪切，影響脂肪生成。但是mA修飾是否可以通過介導(dǎo)lncRNA的作用參與成脂分化的調(diào)控還需進(jìn)一步揭示。

馬身豬是山西省地方品種，表現(xiàn)出肉質(zhì)優(yōu)良、繁殖力較高、抗逆性強(qiáng)，且背最長肌中肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于大白豬。研究發(fā)現(xiàn)，在馬身豬肌肉組織中，脂肪細(xì)胞生成的關(guān)鍵調(diào)控因子423、和表達(dá)量顯著升高，說明馬身豬的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞生成相較于大白豬顯著增加。因此，本研究通過對肌內(nèi)脂肪含量高的馬身豬和肌內(nèi)脂肪含量較低的大白豬背最長肌組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA測序，從而篩選到一個在馬身豬中特異高表達(dá)的lncRNA-6617。通過生物信息學(xué)軟件分析其生物學(xué)特性，比較分析lncRNA-6617在馬身豬和大白豬肌肉組織間的表達(dá)差異。利用體外分離培養(yǎng)的豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞為模型，干擾lncRNA-6617，探究其對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂分化的影響。為了尋找lncRNA-6617上游作用機(jī)制的調(diào)控方式，檢測馬身豬和大白豬肌肉組織中mA修飾相關(guān)酶的表達(dá)差異，為后續(xù)分子作用機(jī)制的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取飼養(yǎng)在相同條件下的1、90、180日齡健康馬身公豬和大白公豬各3頭，分別屠宰采集其心、肝、脾、肺、背部和腹部皮下脂肪、背最長肌、腰大肌、股二頭肌等組織，在液氮中速凍，隨后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 胎牛血清和Opti-MEM購自美國Gibco公司；胰酶、青鏈霉素、高糖DMEM和胰島素購自美國Sigma公司；Dex、IBMX、4%多聚甲醛和飽和油紅O染液購自北京Solarbio公司；吲哚美辛購自阿拉??；Trizol Reagen和PARISKit購自美國Life Technologies公司；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq II等購自北京全式金；Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司；引物由上海生工合成；siRNA委托上海吉瑪公司設(shè)計并合成。

1.2.2 主要儀器 細(xì)胞成像系統(tǒng)(EVOS FL Auto，Life Technologies，美國)，Nanodrop 2000核酸蛋白測定儀(Thermo，美國)，普通PCR儀(Bio-RAD，美國)，實(shí)時熒光定量PCR儀(Bio-RAD，美國)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取及cDNA文庫的構(gòu)建和測序 按照Trizol說明書方法提取1、90和180日齡馬身豬和大白豬背最長肌組織RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后，進(jìn)行Illumina Hiseq上機(jī)測序。

1.3.2 豬lncRNA-6617的篩選及生物信息學(xué)分析 通過edgeR和cuffdiff軟件對1日齡馬身豬與大白豬背最長肌lncRNA測序結(jié)果分析，選定馬身豬中特異高表達(dá)的lncRNA-6617為目標(biāo)lncRNA。 利用UCSC-Blast和Ensemble-Blast明確lncRNA-6617的基因組定位；通過CPC、CPAT在線網(wǎng)站預(yù)測lncRNA-6617的蛋白編碼能力。

1.3.3 lncRNA-6617的鑒定 根據(jù)測序得到的lncRNA-6617序列信息，用Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，以馬身豬背最長肌組織cDNA為模板，通過RT-PCR對lncRNA進(jìn)行擴(kuò)增，隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，對目的片段進(jìn)行膠回收，連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將篩選出的陽性菌送至華大基因測序。

1.3.4 豬lncRNA-6617的核質(zhì)定位 試驗(yàn)選用未分化的豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA分離，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過qRT-PCR檢測lncRNA-6617在豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量。

1.3.5 豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的成脂分化 馬身豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室前期分離培養(yǎng)和保存，將傳代細(xì)胞接種于6孔板，采用“激素雞尾酒”法誘導(dǎo)成脂。待細(xì)胞完全匯合后，更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+10 μg·mLIns+0.5 mmoL·LIBMX+1 μmoL·LDEX+100 μmoL·LIND)，4 d后更換為維持培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+10 μg·mLIns)，每2 d換1次培養(yǎng)基，直至脂滴融合成大脂滴。

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及油紅O染色 將肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞接種于6孔板，密度達(dá)到60%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前更換為新鮮培養(yǎng)基，siRNA試劑按照Lipofectamine 2000說明書步驟轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個重復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，檢測干擾效率。同時收集轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)分化7 d的細(xì)胞，檢測分化中后期成脂關(guān)鍵基因的表達(dá)。待細(xì)胞脂滴明顯形成后，用預(yù)冷的PBS清洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min，棄去甲醛，60%異丙醇浸洗1 min，棄去異丙醇。待細(xì)胞完全干燥，油紅O染液(飽和油紅O∶蒸餾水=3∶2)染色10 min，PBS洗去多余的油紅O染液，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.7 總RNA的提取與實(shí)時定量PCR 按照Trizol說明書方法提取RNA。按照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，稀釋為20倍。然后以該cDNA作為模板，通過qRT-PCR檢測基因表達(dá)情況，-為內(nèi)參基因，引物序列見表1。反應(yīng)體系為10 μL：SYBR為5 μL，cDNA為4.4 μL，上、下游引物各為0.3 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s， 40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量根據(jù)2法計算。

表1 引物信息

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗(yàn)均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS Statistics 22.0軟件one-way ANOVA和獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，采用Duncan′s法進(jìn)行多重比較，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA-6617的篩選

利用edgeR和cuffdiff軟件分析不同發(fā)育階段馬身豬和大白豬背最長肌組織中差異表達(dá)的lncRNA，結(jié)果顯示，1日齡馬身豬與90日齡馬身豬、1日齡馬身豬與180日齡馬身豬、90日齡馬身豬與180日齡馬身豬相比，分別有88、60、18個差異表達(dá)的lncRNAs (圖1A、1B)，1日齡馬身豬與1日齡大白豬、90日齡馬身豬與90日齡大白豬、180日齡馬身豬與180日齡大白豬相比，分別有87、21、16個差異表達(dá)的lncRNAs(圖1C、1D)。

通過比較分析1日齡馬身豬與大白豬背最長肌差異lncRNA的表達(dá)量，篩選到在馬身豬中特異高表達(dá)的lncRNA-6617(圖2)。

2.2 lncRNA-6617的生物學(xué)鑒定

利用測序得到的lncRNA-6617序列放入UCSC和Ensemble數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)lncRNA-6617位于豬第18號染色體上，由3基因所在DNA鏈的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來，與3基因內(nèi)含子3具有278 bp的堿基互補(bǔ)區(qū)域(圖3A)，提示該lncRNA 為反義型lncRNA。

通過CPAT及CPC在線網(wǎng)站對lncRNA-6617進(jìn)行蛋白編碼能力預(yù)測分析，選擇已報道的非編碼基因1為參考，結(jié)果表明，lncRNA-6617序列不具有編碼蛋白質(zhì)的能力(圖3B)。利用未分化的豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離試驗(yàn)，確定lncRNA-6617 的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，lncRNA-6617主要分布于細(xì)胞核(圖3C)。

MS. 馬身豬；LW. 大白豬。下同MS. Mashen pig; LW. Large White pig. The same as below圖1 馬身豬和大白豬不同階段差異表達(dá)的lncRNA數(shù)量Fig.1 The number of differentially expressed lncRNAs at different stages of MS and LW pigs

圖2 1日齡馬身豬和大白豬差異lncRNA熱圖(A)和火山圖(B)Fig.2 The difference lncRNAs heat map (A) and volcano map (B) of 1-day-old MS and LW pigs

為驗(yàn)證序列的存在，以轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列為模板設(shè)計引物，通過RT-PCR擴(kuò)增lncRNA-6617。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出長278 bp的目的條帶(圖3D)，條帶清晰且單一，Sanger測序結(jié)果表明條帶序列比對一致(圖3E)。

A. 基因組位置；B. 蛋白編碼能力預(yù)測：a為CPAT結(jié)果，b為CPC結(jié)果；C. 亞細(xì)胞定位；D. PCR擴(kuò)增；E. 測序結(jié)果與已知序列比對A. Genomic location; B. Protein coding ability prediction: a is the CPAT result, b is the CPC result. C. Subcellular localization; D. PCR amplification; E. Alignment of sequencing results with known sequences圖3 lncRNA-6617的生物學(xué)特性Fig.3 Biological characteristics of lncRNA-6617

2.3 lncRNA-6617的表達(dá)模式分析

為明確lncRNA-6617組織表達(dá)特性，通過qRT-PCR檢測了lncRNA-6617在馬身豬心、肝、脾、肺、背部和腹部皮下脂肪、背最長肌、腰大肌、股二頭肌等9個組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，lncRNA-6617 在各組織中均有表達(dá)(圖4A)，背部皮下脂肪中表達(dá)量最高，其次是腹部皮下脂肪等組織。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，lncRNA-6617的表達(dá)量在肌內(nèi)脂肪含量高的馬身豬肌肉組織中極顯著高于肌內(nèi)脂肪含量較低的大白豬(<0.01，圖4B)。

對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，分別收集誘導(dǎo)0、1、3、5、7 d的細(xì)胞，qRT-PCR檢測和lncRNA-6617在成脂誘導(dǎo)分化中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著成脂分化進(jìn)程的進(jìn)行，lncRNA-6617 表達(dá)量持續(xù)升高，與成脂核心調(diào)控因子的趨勢一致(圖4C、4D)，相較于未分化階段，該lncRNA主要集中在分化中后期表達(dá)。

2.4 干擾lncRNA-6617抑制豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂分化

將siRNA和對照組silnc-NC分別轉(zhuǎn)染至豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞檢測干擾效率。結(jié)果顯示，與silnc-NC組相比，silnc-6617組極顯著降低了lncRNA-6617的表達(dá)(<0.01，圖5A)。干擾lncRNA-6617后，對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化7 d后，分化的成熟脂肪細(xì)胞明顯減少(圖5C)，成脂關(guān)鍵基因、和2的表達(dá)均極顯著下調(diào)(<0.01，圖5B)，表明干擾lncRNA-6617抑制豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化。

2.5 m6A去甲基化酶FTO調(diào)控lncRNA-6617的表達(dá)

為了探究lncRNA-6617上游的調(diào)控機(jī)制，本研究分析了馬身豬和大白豬肌肉組織mA修飾水平的差異，結(jié)果顯示，mA去甲基化酶的表達(dá)水平在馬身豬背最長肌和股二頭肌中極顯著高于大白豬(<0.01)，在馬身豬腰大肌中顯著高于大白豬(<0.05)， 上游調(diào)節(jié)因子217的表達(dá)水平在馬身豬各個肌肉組織中均極顯著高于大白豬(<0.01，圖6)。

基于SRAMP數(shù)據(jù)庫，利用lncRNA-6617序列預(yù)測mA修飾位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在lncRNA-6617上存在mA潛在的修飾位點(diǎn)GGACU/A(圖7A)。在豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中干擾，發(fā)現(xiàn)干擾極顯著降低了lncRNA-6617的表達(dá)(<0.01，圖7B)，說明mA修飾可能介導(dǎo)lncRNA-6617的表達(dá)。

A. 組織表達(dá)譜，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；B. 馬身豬和大白豬肌肉組織間的比較；C、D. 誘導(dǎo)肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中PPARγ和lncRNA-6617的時序表達(dá)，**. P<0.01，*. P<0.05，下同A. Tissue expression profile, different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05); B. Comparison of muscle tissues between Mashen pigs and large White pigs; C， D. Temporal expression during induction of intramuscular preadipocytes differentiation, **. P<0.01, *. P<0.05, the same as below圖4 lncRNA-6617表達(dá)模式Fig.4 lncRNA-6617 expression patterns

3 討 論

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的RNA分子，通常不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后修飾等生物學(xué)事件中參與蛋白編碼基因調(diào)控。隨著高通量測序的發(fā)展，一系列調(diào)控脂肪細(xì)胞生成的lncRNA 相繼被鑒定，其發(fā)揮作用的機(jī)制也不斷被揭示。lncRNA通過多種作用方式影響關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和等調(diào)控脂肪細(xì)胞生成。最近研究也發(fā)現(xiàn)，lncIMF4和IMFlnc1參與調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的生成。但是，目前在豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞生成的研究中，更多側(cè)重于測序數(shù)據(jù)的分析，對于lncRNA的調(diào)控成脂分化功能研究尚不深入。

由于lncRNA具有明顯的時空表達(dá)特異性，使得研究肌內(nèi)脂肪細(xì)胞生成需要進(jìn)一步篩選鑒定特異表達(dá)的lncRNA。此前有研究者分別對絨山羊和肉用山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞成脂分化前后的細(xì)胞進(jìn)行高通量測序，篩選與肌內(nèi)沉積相關(guān)的功能候選基因。李嬡等利用RNA-Seq技術(shù)對大白豬和萊蕪豬肌內(nèi)脂肪中circRNA進(jìn)行鑒定，以篩選出調(diào)控豬脂肪沉積的circRNA，證明高通量測序是篩選功能基因的重要手段。本研究利用本課題組對肌內(nèi)脂肪含量高的馬身豬和肌內(nèi)脂肪含量較低的大白豬背最長肌組織lncRNA測序結(jié)果，篩選到在馬身豬中特異高表達(dá)的lncRNA-6617。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析和功能鑒定，發(fā)現(xiàn)lncRNA-6617在馬身豬肌肉組織中顯著高表達(dá)，說明lncRNA-6617可能是影響肌內(nèi)脂肪沉積差異的一個關(guān)鍵因子。同時發(fā)現(xiàn)lncRNA-6617在豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂分化早期表達(dá)量逐漸上升，干擾lncRNA-6617后，顯著抑制肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的生成，說明lncRNA-6617是調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞生成的關(guān)鍵因子。lncRNA-6617功能的發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)一步在理論上完善肌內(nèi)脂肪細(xì)胞生成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為解析肌內(nèi)脂肪組織發(fā)育機(jī)制和遺傳選育篩選靶標(biāo)的確立提供理論依據(jù)。

作為遺傳信息的傳遞載體，RNA上的修飾對其功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。前期已有研究對金華豬、長白豬及長金豬的脂肪組織與mRNA mA修飾水平進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)mA修飾酶在肉脂型金華豬脂肪組織中表達(dá)量最高。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)脂肪含量高的金華豬背最長肌中mA修飾水平顯著低于含量較低的長白豬。本研究中，的表達(dá)在肌內(nèi)脂肪含量高的馬身豬肌肉組織中顯著高于肌內(nèi)脂肪含量較低的大白豬，且與lncRNA-6617的組織表達(dá)模式一致，提示馬身豬和大白豬肌內(nèi)脂肪含量的差異可能與mA修飾相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，過表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶3顯著抑制了脂肪細(xì)胞的生成。mA修飾作為RNA表觀修飾方式之一，同樣影響著lncRNA功能的發(fā)揮。于是本研究在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中干擾，發(fā)現(xiàn)lncRNA-6617 的表達(dá)顯著下調(diào)，說明mA修飾的去甲基化酶可能介導(dǎo)lncRNA-6617功能的發(fā)揮，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

A. 干擾效率；B. 干擾lncRNA-6617后分化7 d成脂相關(guān)基因的表達(dá)變化；C. 油紅O染色(100×)A. Interference efficiency; B. The expression changes of adipogenesis-related genes after interfering with lncRNA-6617 on day 7 of diferentiation; C. Oil Red O staining (100×)圖5 干擾lncRNA-6617抑制豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂分化Fig.5 Interfering with lncRNA-6617 inhibits adipogenic differentiation of pig intramuscular preadipocytes

圖6 馬身豬和大白豬肌肉組織中m6A修飾相關(guān)酶的表達(dá)Fig.6 The expression of m6A modification related enzymes in muscle tissues of MS and LW pigs

A. lncRNA-6617上m6A修飾位點(diǎn)預(yù)測；B. FTO干擾效率以及干擾FTO后lncRNA-6617的表達(dá)變化A. Prediction of m6A modification site on lncRNA-6617; B. The expression changes of FTO and lncRNA-6617 after interfering with FTO圖7 FTO可能調(diào)控lncRNA-6617的表達(dá)Fig.7 FTO may regulate the expression of lncRNA-6617

4 結(jié) 論

本研究鑒定了在馬身豬肌肉組織中特異高表達(dá)的lncRNA-6617；干擾lncRNA-6617后，顯著抑制豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化；lncRNA-6617的表達(dá)也可能受到上游mA去甲基化酶的調(diào)控；這些結(jié)果說明，mA修飾可能介導(dǎo)lncRNA-6617參與肌內(nèi)脂肪細(xì)胞生成的調(diào)控，為后續(xù)深入研究豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生成的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。