魏雪敏， 陳秋旋， 陳玉釗， 張一霖， 吳美建， 張珂珂， 魏偉△

·論著·

敲低通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路減輕阿爾茨海默病相關(guān)病變*

魏雪敏1， 陳秋旋1， 陳玉釗1， 張一霖1， 吳美建1，2， 張珂珂1， 魏偉1△

（1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理科研實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510260）

探討敲低代謝型谷氨酸受體5（metabotropic gultamate receptor 5，）對(duì)6月齡5xFAD小鼠β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein， Aβ）病變、突觸結(jié)構(gòu)和神經(jīng)炎癥的影響及其潛在機(jī)制。選取2、6和12月齡的野生型（wild-type， WT）和5xFAD小鼠，用Western blot檢測(cè)不同階段小鼠海馬組織中mGluR5蛋白的表達(dá)情況。取6月齡的WT、5xFAD、mGluR5和5xFAD/mGluR5小鼠腦組織，免疫熒光染色檢測(cè)Aβ斑塊的聚集，Western blot檢測(cè)海馬組織中淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein， APP）和p-APP蛋白水平，海馬組織透射電子顯微鏡觀察突觸的超微結(jié)構(gòu)，Western blot檢測(cè)海馬組織中突觸蛋白、炎癥因子和mGluR5下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。（1）隨著月齡的增加，5xFAD小鼠海馬組織中mGluR5的表達(dá)顯著增加（<0.01）；（2）敲低減少了5xFAD小鼠海馬區(qū)Aβ斑塊，降低了APP和p-APP蛋白水平（<0.05）；（3）敲低減輕了5xFAD小鼠海馬的突觸結(jié)構(gòu)損傷，5xFAD/mGluR5小鼠突觸前標(biāo)志物突觸小泡蛋白（synaptophysin， SYP）和突觸后標(biāo)志物突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95， PSD95）表達(dá)顯著高于5xFAD小鼠（<0.05），而樹(shù)突標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）和神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclear antigen， NeuN）表達(dá)無(wú)顯著差異；（4）敲低可降低5xFAD小鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放；（5）5xFAD小鼠敲低可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，還通過(guò)抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthetase kinase-3β， GSK-3β）/κB抑制因子激酶（inhibitor of κB kinase， IKK）/核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）炎癥信號(hào)通路減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)。敲低可以減輕6月齡5xFAD小鼠的Aβ病變、突觸結(jié)構(gòu)損傷和神經(jīng)炎癥，其機(jī)制可能與PI3K/AKT及其下游GSK-3β/IKK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

阿爾茨海默?。淮x型谷氨酸受體5；β-淀粉樣蛋白；神經(jīng)炎癥；突觸

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）是最常見(jiàn)的癡呆形式，是一種慢性進(jìn)行性發(fā)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為記憶損失，認(rèn)知障礙，行為能力減退并伴有各種情緒改變等癥狀［1］。2021年世界阿爾茨海默病協(xié)會(huì)報(bào)告顯示，全球超過(guò)8 000萬(wàn)人患癡呆癥，預(yù)計(jì)到了2050年，患癡呆癥人數(shù)將達(dá)到1.52億。目前，中國(guó)是全球AD患者人數(shù)最多的地區(qū)，是全球增長(zhǎng)速度最快的地區(qū)之一。AD已成為嚴(yán)重威脅老齡人的常見(jiàn)疾病，這給親屬和社會(huì)都帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein， Aβ）聚集形成的老年斑和細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles， NFTs）［2-3］，以及伴隨的突觸功能障礙和膠質(zhì)細(xì)胞增生［4］，構(gòu)成了AD的神經(jīng)病理學(xué)特征。

谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性和神經(jīng)元發(fā)育。谷氨酸受體有兩種類型：離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體。離子型谷氨酸受體主要包括NMDA受體和AMPA受體，針對(duì)離子型谷氨酸受體在AD的病理生理過(guò)程中的機(jī)制已有大量的研究。其中，NMDA受體拮抗劑“美金剛”已作為AD的治療用藥，但該藥物也存在一些不足，長(zhǎng)期使用會(huì)引起記憶喪失、鎮(zhèn)靜、共濟(jì)失調(diào)并且損害興奮性突觸傳遞［5］。而代謝型谷氨酸受體在AD發(fā)病過(guò)程中的作用仍需進(jìn)一步研究。

代謝型谷氨酸受體（metabotropic gultamate receptors， mGluRs）可被分成3個(gè)亞組，包括Ⅰ組（mGluR1和mGluR5）、Ⅱ組（mGluR2和mGluR3）和Ⅲ組（mGluR4、6、7和8）。在這8個(gè)mGluRs中，mGluR5在腦皮質(zhì)和海馬中高度表達(dá)［6］，提示其在AD等認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病中具有重要作用。研究表明，mGluR5可以作為Aβ/細(xì)胞朊病毒蛋白（cellular prion protein， PrPc）復(fù)合物的細(xì)胞外支架，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的過(guò)度釋放和神經(jīng)毒性［7］。在AD模型小鼠中，mGluR5藥物抑制可防止記憶喪失，減少Aβ相關(guān)神經(jīng)病理發(fā)生［8］。綜上，提示mGluR5在AD發(fā)病機(jī)制中是一個(gè)不可忽視的因素，但仍缺少證據(jù)闡明mGluR5與AD病理變化的關(guān)系。本研究主要觀察mGluR5在AD模型不同階段的表達(dá)變化，并通過(guò)敲低探討其對(duì)AD模型小鼠Aβ病理、突觸結(jié)構(gòu)和神經(jīng)炎癥的作用，為AD的治療提供參考資料。

材料和方法

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5xFAD小鼠是攜帶5個(gè)家族性基因突變的轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠。這一品系的小鼠具有高淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein， APP）表達(dá)，并伴有Aβ的加速聚集。SPF級(jí)C57BL/6背景的5xFAD小鼠，由深圳市疾病控制與研究中心饋贈(zèng)；SPF級(jí)B6.129-tm1Rod/J小鼠，是C57BL/6背景的基因敲低小鼠，其缺乏（以下簡(jiǎn)稱mGluR5小鼠），購(gòu)自Jackson Laboratory，許可證號(hào)為：AA1119000057；SPF級(jí)C57BL/6小鼠作為野生型（wild-type， WT）對(duì)照小鼠，購(gòu)自福貝斯（北京）生物科技有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010；5xFAD小鼠與B6.129-tm1Rod/J小鼠雜交，通過(guò)基因鑒定獲得5xFAD/mGluR5小鼠。動(dòng)物飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水進(jìn)食，室溫為（22±2） ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，光照/黑暗周期為12 h（8：00～20：00）。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

2　主要儀器及試劑

主要儀器：透射電子顯微鏡（HITACHI）；智能倒置熒光顯微鏡（Leica）。主要試劑：鼠尾直接PCR試劑盒（Bimake）；DAPI（Thermo Scientific）；Alexa Flour 647熒光Ⅱ抗和Alexa Fluor 488熒光Ⅱ抗（Millipore）；抗APP、p-APP、突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95， PSD95）、突觸小泡蛋白（synaptophysin， SYP）、微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）、神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclear antigen， NeuN）、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）、離子鈣結(jié)合接頭分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1， IBA-1）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）、PI3K P110、PI3K P85、AKT、p-AKT、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthetase kinase-3β， GSK-3β）、p-GSK-3β、κB抑制因子激酶（inhibitor of κB kinase， IKK）、p-IKK、核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB） P65、p-P65及GAPDH抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗（鼎國(guó)生物科技有限公司）。

3　實(shí)驗(yàn)分組

為了研究不同階段小鼠海馬組織中mGluR5蛋白的表達(dá)情況，將動(dòng)物分為6組：2月齡［體重（20±2.5） g］、6月齡［體重（28±2.5） g］和12月齡［體重（30±2.5） g］雄性WT或5xFAD小鼠，每組3只。動(dòng)物分組遵循對(duì)照和隨機(jī)的原則。

為了研究敲低對(duì)6月齡5xFAD小鼠的影響，將動(dòng)物隨機(jī)分為4組：WT、mGluR5、5xFAD和5xFAD/mGluR5，每組9只，體重（28±2.5） g，分別用于免疫熒光檢測(cè)、透射電子顯微鏡制片及觀察和Western blot實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物分組遵循對(duì)照和隨機(jī)的原則。

4　實(shí)驗(yàn)方法

4.1基因鑒定（1）消化組織：剪小鼠鼠尾3 mm，剪碎組織，加入配好的消化液50 μL，55 ℃水浴消化30 min，消化完成后再95 ℃水浴5 min滅活蛋白酶，4 ℃離心10 min，取上清于-20 ℃保存。（2）PCR擴(kuò)增：配制PCR 50 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)36次。（3）瓊脂糖凝膠電泳：提前配制好瓊脂糖凝膠，PCR完成后，取出樣品，每個(gè)孔10 μL點(diǎn)樣，280 V恒壓電泳，20 min。（4）用凝膠成像儀或紫外成像儀觀察結(jié)果。

4.2冰凍切片小鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，固定在手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)胸腔暴露心臟，心臟灌注常溫的生理鹽水，觀察灌流液的顏色從深紅逐漸變淺直至無(wú)色透明時(shí)灌注完成；剪開(kāi)小鼠腦部皮膚及硬腦膜暴露出腦組織，取出全腦組織放入4%多聚甲醛溶液中浸泡固定48 h，再分別用梯度10%、20%和30%的蔗糖溶液脫水各24 h；取出脫水完成的腦組織吸干水分，用OCT包埋，冰凍切片機(jī)提前預(yù)冷置至-20 ℃，矢狀切面，切片厚度為20 μm，從海馬組織出現(xiàn)開(kāi)始連續(xù)切片，至第8張開(kāi)始連續(xù)切片20張，貼片保存。

4.3免疫熒光取具有相同部位的組織切片，室溫復(fù)溫30 min，加入1% TritonX-100溶液室溫破膜30 min，PBS洗3次，3% BSA室溫封閉1 h，PBS洗3次，加入相應(yīng)Ⅰ抗均勻覆蓋腦片，4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，PBS洗3次，加入Ⅱ抗室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，加入DAPI染核5 min，PBS洗3次，滴加防淬滅劑，封片保存，顯微鏡下觀察。

4.4透射電鏡制片及觀察（1）取材固定：取新鮮小鼠海馬組織，迅速浸沒(méi)在電鏡固定液中，4 ℃固定3 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min。（2）后固定：在1%鋨酸室溫固定2 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min。（3）脫水：組織依次放入50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇、100%丙酮、100%丙酮溶液中進(jìn)行脫水，每次15 min。（5）浸透：將組織置于丙酮∶包埋劑=1∶1，室溫3 h；丙酮∶包埋劑=1∶2，室溫滲透過(guò)夜；純包埋劑，室溫7 h；將純包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后于37 ℃烤箱中過(guò)夜。（6）聚合：將組織置于60 ℃烤箱中聚合48 h。（7）切片：用超薄切片機(jī)切成60～80 nm超薄切片。（8）染色：鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和乙醇溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min），切片室溫干燥過(guò)夜。（9）透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

4.5Western blot實(shí)驗(yàn)取小鼠海馬組織，加入500 μL裂解液充分裂解組織，將樣品放入組織勻漿機(jī)中研磨5次，每次120 s，每次間隔10 s，頻率60 Hz；4 ℃離心10 min，取上清液，使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃ 10 min后于-20 ℃保存，或直接用于Western blot實(shí)驗(yàn)；樣品經(jīng)8%、10%或12%的SDS-PAGE分離，NC膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃環(huán)境下Ⅰ抗孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，使用相應(yīng)的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ圖像分析軟件測(cè)量條帶灰度值。

5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。使用軟件GraphPad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及圖表繪制。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)的正態(tài)性。兩組之間比較采用檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey多重比較檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　5xFAD小鼠mGluR5的表達(dá)隨著年齡的增加而增加

不同月齡小鼠海馬組織中mGluR5的表達(dá)如圖1A所示。隨著月齡的增加，mGluR5的表達(dá)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。在6月齡和12月齡時(shí)，5xFAD小鼠mGluR5的表達(dá)相較于同齡WT小鼠顯著升高（<0.01）。敲低后其蛋白的表達(dá)如圖1B所示。相較于WT小鼠，mGluR5小鼠mGluR5的表達(dá)顯著降低（<0.01）；較于5xFAD小鼠，5xFAD/mGluR5小鼠mGluR5的表達(dá)同樣顯著降低（<0.01）。

Figure 1.　The expression of mGluR5 in different stages of 5xFAD mice. A： the expression of mGluR5 in the hippocampus of 2-， 6- and 12-month-old 5xFAD and WT mice； B： the expression of mGluR5 in the hippocampus of 6-month-old WT，mGluR5+/-， 5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs WT group；##P<0.01 vs 5xFAD group.

2　敲低mGluR5減少5xFAD小鼠Aβ的聚集

敲低對(duì)5xFAD小鼠Aβ病變影響的結(jié)果如圖2A所示。WT和mGluR5小鼠海馬區(qū)均無(wú)Aβ的表達(dá)，但在5xFAD小鼠海馬區(qū)檢測(cè)到有大量Aβ斑塊聚集，而5xFAD/mGluR5小鼠海馬區(qū)Aβ斑塊面積相較于5xFAD小鼠顯著縮?。?0.01）。小鼠海馬組織中APP的表達(dá)和磷酸化修飾情況如圖2B所示。與5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠APP和p-APP（Thr688）的蛋白水平顯著降低（<0.05）。

Figure 2.　Knockdown of mGluR5 reduced Aβ aggregation in the hippocampus of 6-month-old 5xFAD mice. A： Aβ plaques （4G8， red） decreased in the hippocampus of 6-month-old 5xFAD/mGluR5+/- mice compared with 5xFAD mice （scale bar=250 μm）； B： the protein levels of APP and p-APP （Thr688） in the hippocampus of 6-month-old WT，mGluR5+/-， 5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs 5xFAD group.

3　敲低mGluR5改善5xFAD小鼠的突觸結(jié)構(gòu)

電子顯微鏡觀察小鼠海馬的突觸結(jié)構(gòu)如圖3A所示。WT小鼠突觸基本結(jié)構(gòu)清晰，突觸小泡豐富，前膜、后膜清晰，突觸間隙寬度適中；mGluR5小鼠突觸基本結(jié)構(gòu)略模糊，突觸小泡數(shù)量一般，前膜、后膜大部分略模糊，突觸間隙寬度適中；而5xFAD小鼠突觸基本結(jié)構(gòu)模糊，突觸小泡不豐富，前膜、后膜模糊不清，突觸間隙不可見(jiàn)；5xFAD/mGluR5小鼠的突觸結(jié)構(gòu)和突觸間隙均有一定程度的改善，其突觸基本結(jié)構(gòu)清晰，突觸小泡豐富，前膜、后膜大部分清晰，突觸間隙寬度適中。如圖3B所示，與WT小鼠相比，5xFAD小鼠中突觸前標(biāo)志物SYP和突觸后標(biāo)志物PSD95的表達(dá)均顯著降低（<0.01）；與5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠SYP和PSD95的表達(dá)均顯著升高（<0.05）。神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN和樹(shù)突標(biāo)志物MAP2的表達(dá)在各組小鼠之間均無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3B。

Figure 3.　Knockdown of mGluR5 attenuated damage to synaptic structure in 6-month-old 5xFAD mice. A： high-magnification electron micrographs showed that the synaptic structure and the synaptic gap in 5xFAD/mGluR5+/- mice were recovered （PD： postsynaptic membrane； SC： synaptic cleft； M： mitochondria； PM： presynaptic membrane； SV： synaptic vesicles； SJ： synaptic corpuscles； scale bar=500 nm）； B： the expression of PSD95， SYP， MAP2 and NeuN in the hippocampus of 6-month-old WT，mGluR5+/-， 5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs 5xFAD group.

4　敲低mGluR5減輕5xFAD小鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)

星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IBA-1及炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)如圖4A所示。與WT小鼠相比，5xFAD小鼠的GFAP、IBA-1、TNF-α和IL-1β的表達(dá)均顯著升高（<0.01）；然而相較于5xFAD小鼠，5xFAD/mGluR5小鼠的GFAP、IBA-1、TNF-α和IL-1β表達(dá)均顯著降低（<0.05）。小鼠腦組織中GFAP的形態(tài)變化如圖4B所示。相較于WT小鼠，5xFAD小鼠GFAP的熒光面積顯著升高（<0.01）；與5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠GFAP表達(dá)降低（<0.05）。

Figure 4.　Knockdown of mGluR5 reduced neuroinflammation in 6-month-old 5xFAD mice. A： the expression of GFAP， IBA-1， TNF-α and IL-1β in 6-month-old WT，mGluR5+/-， 5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice； B： GFAP （red） immunofluorescence in the hippocampus of 6-month-old mice （scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3. **P<0.05 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs 5xFAD group.

5　敲低mGluR5激活5xFAD小鼠PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制炎癥通路

mGluR5下游相關(guān)信號(hào)通路PI3K/AKT的表達(dá)和修飾如圖5A所示。與5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠中PI3K調(diào)節(jié)亞基P85和AKT的磷酸化水平均顯著升高（<0.01），然而PI3K催化亞基P110的表達(dá)無(wú)顯著差異。GSK-3β、IKK和NF-κB P65的表達(dá)和修飾如圖5B所示。與5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠p-GSK-3β （Tyr216）的蛋白水平顯著降低（<0.01）；與5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠p-IKK和p-P65的蛋白水平均顯著降低（<0.01）。

Figure 5.　Knockdown of mGluR5 activated PI3K/AKT signaling pathway and inhibited inflammatory in 5xFAD mice. A： the protein levels of P110， P85， PI3K， p-AKT and AKT in the hippocampus of 6-month-old WT，mGluR5+/-，5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice； B： the protein levels of p-GSK3β， GSK3β， p-IKK， IKK， p-P65 and P65 in 6-month-old WT，mGluR5+/-，5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs WT group；##P<0.01 vs 5xFAD group.

討論

谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在記憶，突觸可塑性和神經(jīng)元發(fā)育中起重要作用。NMDA受體拮抗劑“美金剛”已被用于中度至重度AD的治療，但是一些副作用無(wú)法避免。mGluR5在大腦海馬高表達(dá)，同時(shí)可以通過(guò)朊病毒蛋白與Aβ結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)FYN激酶以損害突觸功能。有研究通過(guò)正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)檢測(cè)到在5xFAD小鼠中mGluR5表達(dá)增加［9］，我們的實(shí)驗(yàn)觀察到mGluR5隨著5xFAD小鼠月齡的增加而呈現(xiàn)Aβ的聚集增加，在6月齡后表達(dá)顯著高于同齡野生對(duì)照小鼠，因此本研究選取6月齡小鼠展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。有研究報(bào)道，的遺傳缺失可以改善APP/PS1ΔE9模型小鼠的認(rèn)知功能并降低Aβ斑塊和Aβ寡聚體濃度［10］。但我們觀察到，完全敲除會(huì)引起小鼠重度抑郁并過(guò)早死亡。因此，本研究在5xFAD模型小鼠中敲低，研究其對(duì)AD相關(guān)病理是否有影響。

APP是由100多個(gè)氨基酸組成的蛋白，存在于生物體的多種組織中。Aβ是由APP經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶異常水解產(chǎn)生的，而APP在Thr668位點(diǎn)的磷酸化會(huì)加速這種生成［11］。Aβ的產(chǎn)生增加和聚集引起的神經(jīng)毒性作用會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能障礙［12-13］。本研究觀察到，6月齡5xFAD/mGluR5小鼠海馬區(qū)APP磷酸化減少，Aβ斑塊顯著改善。APP的磷酸化修飾受GSK3β的調(diào)節(jié)，同時(shí)GSK3β的激活會(huì)導(dǎo)致β-分泌酶蛋白水平增加，磷酸化的APP被β-分泌酶錯(cuò)誤切割產(chǎn)生過(guò)量Aβ［14］。本研究中5xFAD小鼠敲低mGluR5后GSK3β的活性抑制是Aβ斑塊減少的可能機(jī)制。

AD患者腦內(nèi)比神經(jīng)元損傷更嚴(yán)重的是突觸損傷和缺失，這是AD患者認(rèn)知功能下降的一個(gè)病理特征［15］。電鏡觀察結(jié)果顯示5xFAD小鼠的突觸結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷，而在敲低后突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)有很大的改善。同時(shí)，5xFAD小鼠敲低后其突觸蛋白SYP和PSD95的表達(dá)增高，而神經(jīng)元和樹(shù)突本身并未被影響。

PI3K/AKT信號(hào)通路是一條與增殖，分化和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，可以響應(yīng)包括胰島素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等各種刺激，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［16-17］。在AD腦中，Aβ的產(chǎn)生和聚集降低PI3K/AKT信號(hào)的磷酸化和活性［18］。本研究檢測(cè)到5xFAD/mGluR5小鼠中該條通路被有效逆轉(zhuǎn)，這可能是改善神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是包括AD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的一部分［19-20］。神經(jīng)炎癥的主要參與者是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞［21］，當(dāng)它們激活后，這些細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，從而維持和增強(qiáng)炎癥狀況。異常的膠質(zhì)細(xì)胞增生會(huì)激活NF-κB，從而產(chǎn)生更多的神經(jīng)炎癥因子導(dǎo)致神經(jīng)退行性變和認(rèn)知功能障礙［22］。本研究顯示，5xFAD/mGluR5小鼠海馬組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著低于5xFAD小鼠，同時(shí)GFAP和IBA-1的表達(dá)也顯著低于5xFAD小鼠。免疫熒光檢測(cè)也觀察到5xFAD/mGluR5小鼠相較于5xFAD小鼠，海馬區(qū)GFAP的形態(tài)有所改善。這些結(jié)果表明，敲低5xFAD小鼠可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡；IKK是NF-κB信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子，其受AKT的調(diào)控并可以激活NF-κB信號(hào)［23］。研究表明，GSK-3β可以通過(guò)IKK參與NF-κB信號(hào)通路［24］，同時(shí)GSK-3β也是PI3K/AKT信號(hào)通路的下游組分，研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路激活后，抑制GSK3β，產(chǎn)生抗炎反應(yīng)，而GSK3β在Tyr216位點(diǎn)的磷酸化增加，其活性狀態(tài)促進(jìn)NF-κB的活化，導(dǎo)致炎癥因子的產(chǎn)生［25］。本研究觀察到敲低后，6月齡5xFAD小鼠PI3K/AKT信號(hào)通路激活導(dǎo)致GSK-3β抑制，Try216位點(diǎn)磷酸化減少，抑制其下游的IKK/NF-κB炎癥信號(hào)通路，減少TNF-α和IL-1β等炎癥因子的釋放，產(chǎn)生抗炎反應(yīng)減少神經(jīng)炎癥。

綜上所述，敲低5xFAD小鼠可顯著減輕其在6月齡時(shí)的Aβ病變、突觸結(jié)構(gòu)損傷及神經(jīng)炎癥，這可能是通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路和抑制GSK-3β/IKK/NF-κB信號(hào)通路分別參與發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用和抗炎反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

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knockdown attenuates Alzheimer disease-related pathology by activating PI3K/AKT signaling pathway

WEI Xue-min1， CHEN Qiu-xuan1， CHEN Yu-zhao1， ZHANG Yi-lin1， WU Mei-jian1，2， ZHANG Ke-ke1， WEI Wei1△

（1，，，，，510632，；2，，，510260，）

To explore the effects of metabotropic glutamate receptor 5 （） knockdown on amyloid β-protein （Aβ） pathology， synaptic structure and neuroinflammation in 6-month-old 5xFAD mice and its underlying mechanism.Wild-type （WT） and 5xFAD mice aged 2， 6 and 12 months were selected to detect the expression of mGluR5 protein in the hippocampus by Western blot. Six-month-old WT， 5xFAD，mGluR5and 5xFAD/mGluR5mice were selected to explore the role of mGluR5 in Alzheimer disease-related pathology. The expression and aggregation of Aβ plaques were detected by immunofluorescence. The protein levels of amyloid precursor protein （APP） and p-APP in hippocampus were detected by Western blot. The ultrastructure of the synapse was observed by transmission electron microscopy. The expression levels of synaptic proteins， inflammatory factors and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/AKT signaling pathway-related proteins in hippocampus were detected by Western blot.（1） The expression of mGluR5 in the hippocampus of 5xFAD mice increased with age （<0.01）. （2） Knockdown ofreduced Aβ plaques （<0.01）， and decreased the protein levels of APP and p-APP in the hippocampus of 5xFAD mice（<0.05）.（3） Knockdown ofattenuated synaptic structural damage in the hippocampus of 5xFAD mice. The expression levels of presynaptic marker synaptophysin （SYP） and postsynaptic marker postsynaptic density protein 95 （PSD95） in 5xFAD/mGluR5mice were significantly higher than those in 5xFAD mice （<0.05）， while the expression of dendritic marker microtubule-associated protein 2 （MAP2） and neuron marker neuronal nuclear antigen （NeuN） had no statistically significant difference. （4） Knockdown ofreduced neuroinflammation in 5xFAD mice. （5） Knockdown ofin 5xFAD mice exerted neuroprotective effect by activating PI3K/AKT signaling pathway， and reduced neuroinflammation by inhibiting glycogen synthetase kinase-3β （GSK-3β）/inhibitor of κB kinase （IKK）/nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway.Knockdown ofattenuated Aβ pathology， synaptic damage and neuroinflammation in 6-month-old 5xFAD mice， and its mechanism may be related to PI3K/AKT and its downstream GSK-3β/IKK/NF-κB signaling pathways.

Alzheimer disease； Metabotropic glutamate receptor 5； Amyloid β-protein； Neuroinflammation； Synapse

R749.1+6； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.001

1000-4718（2022）06-0961-09

2022-02-28

2022-05-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81100944）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 2018A030313565）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No. 201904010040）

Tel： 020-85526259； E-mail： rocky1240@163.com

（責(zé)任編輯：李淑媛，余小慧）