汪 遜，陸雪強(qiáng)，侯傳勝，陳 剛

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院泌尿外科，上海 201508)

據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，前列腺癌是男性死亡率第2的癌癥[1]，目前很難通過(guò)環(huán)境暴露來(lái)完全解釋其發(fā)生發(fā)展[2]，已確定的危險(xiǎn)因素僅限于高齡、前列腺癌家族史、基因突變(如BRCA1)和疾病(林奇綜合征)[1]。流行病學(xué)研究已證實(shí)，前列腺癌是最具遺傳性和最高可抗藥性的癌癥之一[3-4]。約15%的前列腺癌被診斷為預(yù)后不良高風(fēng)險(xiǎn)疾病[5]。在臨床上，醫(yī)生主要通過(guò)TNM分期、高危因素以及患者基礎(chǔ)情況來(lái)判斷患者的生存期，但這類指標(biāo)并不完全準(zhǔn)確。而早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的困難性往往導(dǎo)致治療不足或過(guò)度治療，因此，尋找預(yù)測(cè)前列腺癌不良預(yù)后的聯(lián)合標(biāo)志物具有重要意義，新的標(biāo)志物與臨床病理學(xué)特征以及影像學(xué)診斷等結(jié)合使用，可有效減少相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。在本研究中，我們分析了癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌的原始基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以識(shí)別參與前列腺癌發(fā)生和進(jìn)展中的關(guān)鍵基因和功能通路；同時(shí)結(jié)合患者的臨床病理資料，深入挖掘這些基因的臨床意義，以期尋找相關(guān)標(biāo)志物，更好地判斷前列腺癌的發(fā)展和預(yù)后，為臨床醫(yī)師診療決策提供一定的指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)中下載了498例前列腺癌組織樣本及52例癌旁正常前列腺組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及對(duì)應(yīng)的臨床病理資料，數(shù)據(jù)下載時(shí)間為2021年4月。

1.2 數(shù)據(jù)處理和識(shí)別差異表達(dá)的基因?qū)CGA數(shù)據(jù)，使用TCGAbiolinks包，進(jìn)行前列腺癌表達(dá)數(shù)據(jù)(Counts/Fpkm)下載和整理，隨后利用 DESeq包, 以|FC| >1 &P<0.05作為識(shí)別差異表達(dá)基因(differential expression genes，DEGs)的閾值，進(jìn)行腫瘤和正常樣本的組間差異分析，得到差異上下調(diào)基因。得到所有差異基因后，輸出所有差異表達(dá)基因的表達(dá)矩陣，并用R語(yǔ)言ggplot程序包繪制火山圖，將表達(dá)上調(diào)基因設(shè)置為紅色，下調(diào)基因基因設(shè)置為綠色。

1.3 差異基因通路富集分析為確定篩選出的DEGs的功能，用R軟件對(duì)其進(jìn)行了基因本體注釋(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。此外，以P<0.05篩選重要通路和功能的臨界值設(shè)置。GO富集分析采用GOseq包對(duì)生物過(guò)程(biological process，bp)、分子功能(molecular function，mf)和細(xì)胞組分(cellular component，cc)富集的GO term上基因分布情況進(jìn)行了分析。KEGG Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在DEGs基因中顯著性富集的Pathway。

1.4 KM分析建立基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型和臨床參數(shù)的預(yù)后分析用R軟件的survival和survimner包，以該基因表達(dá)的中位數(shù)為二分類變量，采用Kaplan-Meier survival estimate(KM生存分析)以估計(jì)篩選出的所有DEGs的生存曲線。以P<0.05作為篩選的臨界值。

1.5 臨床資料分析對(duì)1.4中篩選出的基因，進(jìn)行臨床資料分析。根據(jù)臨床資料的情況，使用R軟件的XML等程序包，對(duì)前列腺癌患者clinical T category(cT)、pathologic T category(pT)、pathologic N category(pN)、clinical M category(cM)的各個(gè)臨床分期分別進(jìn)行了分析。另外，根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)官網(wǎng)(https://www.cancer.org/cancer/prostate-cancer/detection-diagnosis-staging/staging.html)對(duì)前列腺癌最新TNM分期的分類，將患者分為4個(gè)Stage，并用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)這4個(gè)Stage分期分別進(jìn)行了分析。此外，我們還對(duì)篩選出的基因進(jìn)行了腫瘤和正常樣本之間(全部/配對(duì)) boxplot圖驗(yàn)證。

1.6 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)以① 年齡≥60歲、② T3～T4、③ N1、④ M1、⑤ Gleason評(píng)分≥8、⑥ 復(fù)發(fā)作為預(yù)后不良高風(fēng)險(xiǎn)因素，以① 年齡<60歲、② T1～T2、③ N0、④ M0、⑤ Gleason評(píng)分<8、⑥ 未復(fù)發(fā)作為低風(fēng)險(xiǎn)因素。分別按照年齡、TNM分期、Gleason評(píng)分和復(fù)發(fā)情況，將前列腺癌患者分成6組不同的高低風(fēng)險(xiǎn)組。DESeq2差異分析尋找篩選出1.4中篩選出的基因的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs識(shí)別和富集分析為了獲得TCGA數(shù)據(jù)集差異表達(dá)的基因，采用DESeq2包根據(jù)|FC| >1和P<0.05的閾值篩選差異表達(dá)基因。共篩選出360個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因334個(gè)，下調(diào)基因26個(gè)，火山圖顯示了來(lái)自上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因的數(shù)量(圖1A)。我們通過(guò)GO和KEGG通路富集分析，分析了差異基因所參與的生物學(xué)功能。根據(jù)KEGG 通路富集分析，DEGs主要參與神經(jīng)活性配體受體相互作用相關(guān)通路(圖1B)。GO分析結(jié)果顯示DEGs顯著富集在肌肉系統(tǒng)(bp，圖1C)、肌動(dòng)蛋白(mf，圖1D)和肌纖維(cc，圖1E)，三者的綜合匯總情況見圖1F。

2.2 KM預(yù)后分析我們對(duì)篩選出的360個(gè)DEGs均進(jìn)行了KM生存分析，以該基因表達(dá)的中位數(shù)為二分類變量，P<0.05作為篩選的臨界值，最終篩選出了12個(gè)與OS顯著相關(guān)的基因，分別是PATE1、TGM4、TPSB2、PRLR、UGT2B17、BCAN、KLHL40、MEI4、CACNG7、CRYGD、OR52E8、OLIG2(圖2)。

2.3 TNM分期根據(jù)臨床資料，對(duì)篩選出的12個(gè)基因與前列腺癌患者cT、pT、pN和cM的相關(guān)性分別進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示PRLR、BCAN、TPSB2與cT分期相關(guān)(P<0.05，圖3A～圖3C)，TPSB2、CRYGD、UGT2B17與pT分期相關(guān)(P<0.05，圖3D～F)，BCAN、CRYGD與pN分期相關(guān)(P<0.05，圖3G～H)，OLIG2與cM分期相關(guān)(P<0.05，圖3I)。

A：PRLR基因與臨床T分期；B：BCAN基因與臨床T分期；C：TPSB2基因與臨床T分期；D：TPSB2基因與病理T分期；E：CRYGD基因與病理T分期；F：UGT217基因與病理T分期；G：BCAN基因與病理N分期；H：CRYGD基因與病理N分期；I：OLIG2基因與臨床M分期。圖3 各基因與TNM分期的相關(guān)性分析

此外，我們還對(duì)前列腺癌患者的臨床病理資料進(jìn)行了整理，將患者分為4個(gè)Stage，并用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)這4個(gè)Stage分期分別進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，TPSB2、UGT2B17、BCAN、CRYGD與Stage分期相關(guān)(P<0.05，圖4)。

A：UGT2B17；B：BCAN；C：CRYGD；D：TPSB2。圖4 各基因與Stage分期的相關(guān)性分析

2.4 前列腺癌高低風(fēng)險(xiǎn)組相關(guān)性分析分別按照年齡、TNM分期、Gleason評(píng)分和復(fù)發(fā)情況，將前列腺癌患者分成6組不同的預(yù)后高低風(fēng)險(xiǎn)組。DESeq2差異分析尋找篩選出的12個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，KLHL40在年齡大于等于60組和T3～T4組中表達(dá)更多，UGT2B17和OR52E8在年齡小于60組和T1～T2組中表達(dá)更多(P<0.05，圖5A～B)。KLHL40在N1組中表達(dá)更多，PATE1和OR52E8在N0組中表達(dá)更多(P<0.05，圖5C)。KLHL40在Gleason評(píng)分≥8組中表達(dá)更多，PATE1在Gleason評(píng)分<8組中表達(dá)更多(P<0.05，圖5E)。KLHL40、PATE1、TGM4、OR52E8在未復(fù)發(fā)組表達(dá)更多(P<0.05，圖5F)。

A：年齡；B：T；C：N；D：M；E：Gleason評(píng)分；F：復(fù)發(fā)。紅色為表達(dá)上調(diào)基因，綠色為下調(diào)基因。圖5 各基因與高低危險(xiǎn)組的相關(guān)性分析

2.5 樣本配對(duì)驗(yàn)證我們對(duì)篩選出的12個(gè)基因的表達(dá)量用Wilcox test分別進(jìn)行了正常和腫瘤樣本之間(全部/配對(duì)) boxplot圖驗(yàn)證(圖6)。PATE1、MEI4、CRYGD在正常和腫瘤樣本全部和配對(duì)boxplot圖中P值<0.05。

A、B、C：分別代表CRYGD、MEI4、PATE1基因在腫瘤和正常組織(全部)表達(dá)的boxplot圖；D、E、F：分別代表CRYGD、MEI4、PATE1基因在腫瘤和正常組織(配對(duì))表達(dá)的boxplot圖。圖6 正常組均和腫瘤樣本(全部/配對(duì))表達(dá)的boxplot圖

3 討 論

發(fā)現(xiàn)可靠度高且能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)前列腺癌患者預(yù)后的分子生物標(biāo)志物迫在眉睫。有效的預(yù)后生物標(biāo)志物可提供在沒(méi)有治療的情況下特定患者臨床預(yù)后的重要信息，并彌補(bǔ)現(xiàn)有TNM 分期和高危因素等信息指導(dǎo)臨床醫(yī)生決策的不足，對(duì)于治療方案的選擇也是有非常大的參考價(jià)值。而各種生物信息學(xué)分析技術(shù)如單細(xì)胞測(cè)序[8]、蛋白組學(xué)[9]等已廣泛用于識(shí)別與前列腺癌相關(guān)的潛在分子標(biāo)記物。與之前的研究相比，我們?cè)谧R(shí)別差異表達(dá)的基因后，通過(guò)KM生存分析篩選了與預(yù)后相關(guān)的基因，并結(jié)合患者的臨床病理資料對(duì)篩選出的基因與TNM分期和高危因素相關(guān)的臨床意義進(jìn)行了深度挖掘。最后還用Wilcox test分別進(jìn)行了正常和腫瘤樣本之間(全部/配對(duì)) boxplot圖驗(yàn)證。

在篩選出的12個(gè)基因中，TPSB2、UGT2B17、BCAN、CRYGD與TNM Stage分期相關(guān)。而在高危因素的分析中，KLHL40、UGT2B17和OR52E8與年齡和原位腫瘤大小相關(guān)。KLHL40、PATE1和OR52E8與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。KLHL40、PATE1與Gleson評(píng)分相關(guān)。KLHL40、PATE1、TGM4、OR52E8與是否復(fù)發(fā)相關(guān)。最后，PATE1、MEI4、CRYGD在腫瘤和正常樣本全部和配對(duì)boxplot圖中均通過(guò)了驗(yàn)證。該部分研究結(jié)果已有部分被逐步證實(shí)，如UGT2B17在子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)[10]，而且該基因的多態(tài)性與前列腺癌易感性有關(guān)，其序列的突變會(huì)增加罹患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[11]。

本研究中仍存在一些局限性：首先，這些生物標(biāo)志物的大部分研究都是在歐美人群中進(jìn)行的[12-14]，對(duì)于中國(guó)人群來(lái)說(shuō)，這些標(biāo)志物是否產(chǎn)生相似的影響，對(duì)于預(yù)后的判斷和評(píng)估作用目前尚無(wú)法判斷，有待進(jìn)一步研究。其次，我們無(wú)法評(píng)估從公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的數(shù)據(jù)的可靠性和真實(shí)性。這12個(gè)基因的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性還需要大規(guī)模的獨(dú)立研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，由于臨床資料的限制和缺失，患者還有大量臨床參數(shù)未進(jìn)行收集和分析，這可能會(huì)導(dǎo)致一些重要的生物學(xué)信息被忽略。

總而言之，本研究發(fā)現(xiàn)了由12個(gè)前列腺癌的預(yù)后基因標(biāo)志物，該組標(biāo)志物可以作為前列腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，并且這一組標(biāo)志物可作為前列腺癌藥物合成的潛在新靶點(diǎn)。此外，根據(jù)不同基因標(biāo)志物及其對(duì)應(yīng)的臨床參數(shù)，我們可進(jìn)一步預(yù)測(cè)患者的不同維度的臨床結(jié)局，為前列腺癌患者的臨床治療決策提供有效的建議。