雷曉紅，高樹麗，岳云霄，史存真

1.平頂山市第一人民醫(yī)院藥學部，平頂山 467000；2.平頂山市第一人民醫(yī)院藥學部藥劑科，平頂山 467000；3.平頂山市第一人民醫(yī)院藥學部臨床藥學室，平頂山 467000；4.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，鄭州 450000

惡性淋巴瘤是指發(fā)生于淋巴結、具有較高異質性的腫瘤，最為常見的是非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）。B 細胞淋巴瘤（B cell lymphoma，BCL）病例約占NHL 總病例數(shù)的80%［1］。目前，針對BCL的治療主要是環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、強的松和抗CD20利妥昔單抗靶向藥物的綜合治療［2］。

黃芩苷（baicalin，C21H18O11）是從唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorigi）的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，具有抗病毒［3］、抗炎［4］、抗過敏［5］、抗氧化［6］、抗腫瘤［7］的作用以及對免疫系統(tǒng)［8］、神經(jīng)系統(tǒng)［9］的保護等作用。

PI3K-Akt-m TOR 信號轉導通路是細胞內(nèi)重要的信號轉導途徑，該信號通路激活可維持細胞存活，是腫瘤細胞抵抗凋亡的重要機制之一［10］。本文探究黃芩苷對淋巴瘤細胞增殖的抑制作用，并基于PI3KAkt-m TOR 信號轉導通路考察其作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

流式細胞儀（美國Becton，Dickinson and Company公司）；TE77XP 型半干轉膜儀系統(tǒng)（美國Hoefer公司）；DYY-1C 型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；Power Pack HV 型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；Cytopro離心涂片機（美國ELITech Group公司）；低溫型高速離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 試藥

十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、三乙醇胺緩沖鹽水溶液（tris buffered saline，Tris）（p H 8.8與p H 6.8）、質量濃度300 mg·L－1聚丙烯酰胺、10×電泳液、ECL 發(fā)光顯影液、50×TAE和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（編號C1062M）均購自碧云天生物技術有限公司；PARP 抗體、LC3抗體均購自Cell Signaling Technology 公司；Hoechst 33258購自碧云天生物技術有限公司；FITC-Annexin V／PI雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；p-PI3K、p-Akt、p-m TOR 抗體（一抗）均購自英國Abcam 公 司；LC3 抗 體（美 國Cell Signaling Technology公司）；標記HRP 的GAPDH 抗體、DC蛋白測定試劑盒和PVDF 膜均購自美國Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶細胞消化液、RIPA 裂解液、PMSF均購自上海碧云天生物技術有限公司；HRP-兔二抗及鼠二抗、Dylight 488-兔二抗均購自美國Earthox Life Sciences公司。

黃芩苷（質量分數(shù)≥98%，貨號A0016），購自成都曼思特生物科技有限公司，用DMSO 配制成質量濃度為80 g·L－1的儲備液，－20℃密閉儲存。

1.3 細胞

人Burkitt淋巴瘤細胞系Raji細胞株購自美國ATCC公司，并由平頂山市第一人民醫(yī)院細胞室傳代培養(yǎng)。Raji細胞在含有體積分數(shù)10%胎牛血清（Hyclone）和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、體積分數(shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測淋巴瘤細胞活力

將處于對數(shù)生長期的淋巴癌Raji細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后分別加入終質量濃度為0、50、100、200、400、800μg·m L－1的黃芩苷處理。將細胞置于37℃、體積分數(shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用CCK-8試劑盒檢測細胞毒性，用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度。抑制率＝［1－（實驗組A值－空白組A值）／（對照組A值－空白組A值）］×100%。

2.2 臺盼藍染色檢測淋巴瘤細胞增殖

將密度約為2.0×105個m L－1、處于對數(shù)生長期的淋巴瘤Raji細胞懸液均勻加入12孔板中，待細胞貼壁后分別加入終質量濃度為0、100、200、400μg·m L－1的黃芩苷進行孵育處理。分別于孵育8、12、24 h 進行臺盼藍染色，用細胞計數(shù)器進行計數(shù)，每組細胞平行計數(shù)5次，取平均數(shù)繪制生長曲線。

2.3 Annexin V-FITC／PI檢測細胞凋亡

將密度約為1.5×106個·m L－1、處于對數(shù)生長期的淋巴瘤Raji細胞懸液均勻加入6 孔板，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育至細胞貼壁，用不同質量濃度的黃芩苷處理。孵育24 h后，收集上清液及用不含EDTA的胰酶消化的細胞以1 000 r·min－1離心5 min（離心半徑為7.5 cm），棄去上清液。用預冷的PBS輕輕重懸細胞洗滌，并轉移至已滅菌的1.5 m L 試管中，以12 000 r·min－1離心15 min（離心半徑為6 cm）。再次用預冷的PBS輕輕重懸細胞進行洗滌，每管樣品加入300μL 已稀釋好的1×binding buffer，輕輕重懸。每管樣品加入3μL Annexin V-FITC 進行標記，輕輕混勻后，室溫避光孵育15 min；之后加入3μL PI染色，于冰浴中輕輕吹打均勻，5 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況并計算凋亡率。

2.4 DAPI染色法檢測細胞凋亡

用細胞離心涂片機將經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理的Raji細胞接種于載玻片上，并用質量濃度為40 g·L－1的多聚甲醛進行固定。在含質量濃度為2 g·L－1的Triton X-100的PBS中透化后，在質量濃度為30 g·L－1BSA 的PBS中室溫封閉，用PBS漂洗3次，每次5 min，進行DAPI染色，并用蓋玻片封片。在熒光顯微鏡下觀察DAPI染色后細胞的凋亡形態(tài)并拍照。

2.5 免疫熒光實驗

用細胞離心涂片機將經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理的Raji細胞接種在載玻片上，并用質量濃度為40 g·L－1的多聚甲醛固定。在含質量濃度為2 g·L－1的Triton X-100的PBS中透化后，在質量濃度為30 g·L－1BSA 的PBS中室溫封閉，用PBS漂洗3次，每次5 min，加入LC3一抗，4℃過夜。再用PBS漂洗3次，每次5 min，Dylight 488-兔二抗室溫避光孵育1.5 h。于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞自噬體的形成情況并拍照。

2.6 Western blot檢測Raji細胞蛋白的表達

提取經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理的Raji細胞的蛋白質樣品，并計算各樣品中蛋白的含量，用SDSSPAGE凝膠電泳分離蛋白質，用半干轉膜儀進行轉膜。用質量濃度為50 g·L－1的脫脂牛奶在低速搖床上封閉1 h，用PBS洗膜3次，每次10 min。用一抗進行封閉，一抗的比例分別為p-PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、p-m TOR（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶1 500）

和LC3-Ⅱ（1∶1 500），置于4℃孵育過夜。次日用PBST 在搖床上洗膜3次，每次10 min。加入與一抗種屬相對應的HRP標記的二抗，在低速搖床上室溫孵育1 h。用PBST 洗膜3次，方法同上。加入ECL發(fā)光、顯色，以GAPDH 作為內(nèi)參，用Image Pro Plus軟件分析蛋白條帶。

2.7 統(tǒng)計學方法

用Graphpad Prism7.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 CCK-8與臺盼藍染色實驗結果

用不同質量濃度的黃芩苷處理Raji細胞后24 h，各組之間進行細胞抑制率比較，結果見圖1A。與質量濃度0μg·m L－1比較，經(jīng)質量濃度50、100、200、400、800μg·m L－1黃芩苷處理的細胞抑制率顯著升高。將各組數(shù)據(jù)進一步兩兩比較，結果顯示，各組間的差異均有統(tǒng)計學意義。

臺盼藍染色結果見圖1B。用不同質量濃度的黃芩苷處理24 h后統(tǒng)計各組活細胞數(shù)，與經(jīng)質量濃度為0μg·m L－1的黃芩苷處理的細胞比較，經(jīng)質量濃度為50、100、200、400、800μg·m L－1的黃芩苷處理的細胞抑制率顯著升高。進一步進行數(shù)據(jù)之間的兩兩比較，結果顯示，各組間的差異均有統(tǒng)計學意義。

圖1 黃芩苷對Raji細胞增殖的影響Fig.1 Inhibitory effects of baicalin on Raji cells

通過分析以上數(shù)據(jù)可知，用黃芩苷處理Raji細胞24 h后，IC50值為379.67μg·m L－1，黃芩苷在質量濃度為100～400μg·m L－1時就能顯著抑制Raji細胞的增殖。因此，后續(xù)實驗選取質量濃度梯度為0、100、200、400μg·m L－1的黃芩苷，來探究其對細胞凋亡和自噬過程的作用機制。

3.2 Annexin V-FITC／PI雙染法實驗結果

Annexin V／FITC-PI雙染法流式細胞術檢測結果見圖2。不同質量濃度黃芩苷作用于Raji細胞24 h后，隨著黃芩苷質量濃度的升高，Raji細胞的凋亡率逐漸上升。與用質量濃度為0μg·m L－1黃芩苷處理的細胞比較，用質量濃度為100、200、400μg·m L－1黃芩苷處理的細胞凋亡率顯著上升。對數(shù)據(jù)進行進一步的兩兩比較，結果顯示，各組間的差異均有統(tǒng)計學意義。

圖2 不同質量濃度黃芩苷對Raji細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of baicalin on the apoptosis of Raji cells with different mass concentration of baicalin

3.3 DAPI染色檢測結果

經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理后Raji細胞的細胞核發(fā)生形態(tài)變化，結果見圖3。經(jīng)質量濃度為0μg·m L－1黃芩苷處理的細胞，細胞核結構完整，呈均勻的卵圓形，無細胞核皺縮的現(xiàn)象；隨黃芩苷質量濃度的升高（黃芩苷質量濃度為100、200、400μg·m L－1），細胞核發(fā)生變形、皺縮，甚至破裂的現(xiàn)象，說明黃芩苷能夠誘導Raji細胞發(fā)生凋亡。

圖3 不同質量濃度黃芩苷處理后Raji細胞核形態(tài)的變化Fig.3 Morphological changes of Raji cell nucleus after treatment with different mass concentration of baicalin

3.4 免疫熒光實驗結果

為了檢測Raji細胞凋亡過程中是否形成自噬體，用免疫熒光實驗檢測內(nèi)源LC3，結果顯示，經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理的細胞，自噬體的分布呈現(xiàn)顯著差異。經(jīng)質量濃度為0μg·m L－1黃芩苷處理的細胞，呈現(xiàn)相對均勻的彌漫性熒光，經(jīng)100、200、400μg·m L－1黃芩苷處理的Raji細胞呈現(xiàn)斑點狀熒光，結果見圖4，表明LC3在自噬體中發(fā)生了再分配。

圖4 不同質量濃度黃芩苷處理后Raji細胞內(nèi)自噬體的分布情況Fig.4 Distribution of autophagosomes in Raji cells after treatment with different mass concentration of baicalin

3.5 Western blot檢測相關蛋白的表達

為了檢測黃芩苷誘導的細胞凋亡情況，實驗檢測了經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理后Raji細胞PI3K、Akt和m TOR 的表達水平，及其相關磷酸化蛋白p-PI3K、p-Akt和p-m TOR 的表達水平，結果見圖5。與經(jīng)質量濃度為0μg·m L－1黃芩苷處理的細胞比較，經(jīng)質量濃度100、200、400μg·m L－1黃芩苷處理的細胞PI3K、Akt和m TOR 的蛋白表達水平無差異，p-PI3K、p-Akt和p-m TOR 的表達量顯著升高，p62蛋白的表達量顯著降低。

圖5 不同質量濃度黃芩苷對Raji細胞相關蛋白表達量的影響Fig.5 Effect of baicalin on the expression of related proteins in Raji cells with different mass concentration of baicalin

為了檢測自噬在黃芩苷誘導細胞凋亡中的作用，實驗檢測了經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理后的Raji細胞中自噬相關因子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62蛋白的表達水平，結果見圖6。與經(jīng)質量濃度0μg·m L－1黃芩苷處理的細胞比較，經(jīng)質量濃度100、200、400μg·m L－1黃芩苷處理的細胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達水平顯著升高，p62蛋白的表達量顯著降低。

圖6 不同質量濃度黃芩苷對Raji細胞自噬相關蛋白表達的影響Fig.6 Effects of baicalin on protein expression in Raji cells related to autophagy with different mass concentration of baicalin

4 討論

天然中藥是近現(xiàn)代治療腫瘤的寶貴資源，經(jīng)其提取的化合物的抗腫瘤作用也被越來越多的發(fā)現(xiàn)［11］。黃芩苷是具有顯著活性的黃酮類化合物，目前已證明其對某些腫瘤具有治療作用［12］，然而其在淋巴瘤治療中的作用尚未見報道。

本研究揭示了黃芩苷通過調控PI3K-Aktm TOR 通路，誘導淋巴瘤Raji細胞凋亡和自噬體的發(fā)生，進一步促進細胞凋亡及自噬的過程。

細胞凋亡和細胞自噬是細胞中2種主要的程序性死亡，在某些條件的作用下，二者能夠共同作用，誘導細胞凋亡［13］。誘導細胞凋亡和自噬的發(fā)生一直是治療血液性惡性腫瘤的重要策略。用CCK-8法和臺盼藍染色法對經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理的Raji細胞進行染色，結果表明，黃芩苷對淋巴瘤Raji細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且在質量濃度為100～400μg·m L－1時抑制作用明顯，故選取質量濃度梯度為0、100、200、400μg·m L－1進行后續(xù)研究。Annexin V-FITC／PI雙染法流式細胞術實驗結果顯示，黃芩苷能夠有效誘導Raji細胞的凋亡。細胞凋亡過程涉及一系列基因的激活、表達以及調控等，并伴隨凋亡小體的生成和細胞核的皺縮等表現(xiàn)。DAPI染色結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芩苷處理24 h的Raji細胞，其細胞核發(fā)生明顯的變形和皺縮。為探究Raji細胞凋亡過程中是否發(fā)生自噬，進行了內(nèi)源LC3免疫熒光檢測。自噬死亡，即Ⅱ型程序性細胞死亡，通常以自噬體的出現(xiàn)為典型特征。無自噬發(fā)生時，LC3 融合蛋白彌散在細胞質中；自噬發(fā)生時，LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出許多明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，因此可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低［14］。結果顯示，隨著黃芩苷質量濃度逐漸增大，顯微鏡下Raji細胞狀態(tài)由彌漫性熒光轉變?yōu)榘唿c狀熒光，表明黃芩苷能夠有效誘導Raji細胞發(fā)生自噬。

為探究黃芩苷抑制Raji細胞增殖及誘導其凋亡的機制，用Western blot檢測相關通路蛋白的表達情況。PI3K-Akt-m TOR 作為腫瘤細胞內(nèi)重要的信號轉導通路之一，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關系密切，在多種惡性腫瘤中都可以檢測到PI3K-Akt-m TOR 信號通路的轉導異常，表明該通路在腫瘤治療中扮演重要的角色［15］。PI3K 作為信號轉導分子，能夠激活人體細胞膜上的磷脂酰肌醇，參與調節(jié)多種細胞功能。PI3K 磷酸化的最佳靶點是Akt，磷酸化的PI3K 即p-PI3K 將信號傳遞給Akt后，激活Akt，使Akt磷酸化為p-Akt。一方面p-Akt可以通過其他途徑抑制細胞凋亡，另一方面其可直接激活m TOR，使后者的活性增加，進而導致其發(fā)生磷酸化最終對細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用［16］。Western blot結果顯示，黃芩苷處理24 h后，Raji細胞內(nèi)PI3K、p-PI3K 和Akt蛋白的表達水平無明顯變 化，p-Akt、m TOR 和p-m TOR 蛋白的表達水平顯著降低，表明黃芩苷能夠抑制PI3KAkt-m TOR 通路的信號轉導，降低其對于凋亡的抑制作用，進而達到誘導細胞凋亡的作用。

為進一步探究自噬在由黃芩苷誘導的細胞凋亡中的作用，實驗檢測了經(jīng)不同質量濃度黃芩苷處理后的Raji細胞中自噬相關因子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62蛋白的表達水平。LC3 是一種自噬體標志蛋白，其存在2 種可相互轉化的形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。細胞質內(nèi)可溶形式為LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ經(jīng)剪切和修飾，轉變?yōu)槲挥诎麅?nèi)自噬體膜上的膜結合形式的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ隨自噬體膜的增多而增多。因此，可通過Western blot檢測LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達水平，進而判斷細胞的自噬活性［17］。p62 是一種泛素結合蛋白，它能與LC3直接作用，參與自噬過程并被降解。p62蛋白的水平與自噬的活性成反比，在自噬被抑制時，p62蛋白的表達水平升高，因此，p62蛋白的表達水平可反映自噬活性的強弱［18］。Western blot結果顯示，黃芩苷能夠顯著提高LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達水平，顯著降低p62的表達水平，表明黃芩苷能夠通過提高LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達水平，抑制p62的表達，從而提高自噬的活性，減弱溶酶體的降解作用，進而誘導Raji細胞自噬的發(fā)生。

綜上所述，黃芩苷能夠誘導Raji淋巴癌細胞凋亡和自噬的發(fā)生，其可能通過下調PI3K-Akt-m TOR 信號轉導通路相關蛋白的表達水平發(fā)揮作用。