林忠澤,張清民,盛釗君,鄧煜然,袁潔麗,林 芳
1.特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,江門 529200;2.廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院,江門 529000;3.五邑大學(xué),江門 529000
皮膚病血毒丸為民國(guó)時(shí)期京城四大名醫(yī)施今墨所創(chuàng),由茜草、黃柏、金銀花、當(dāng)歸、川芎、大黃、連翹、牡丹皮等多味中藥組成,具有清熱解毒、消腫止癢的功效。皮膚病血毒丸在臨床應(yīng)用上可針對(duì)皮膚病的病因,從清熱解毒、消腫止癢、調(diào)節(jié)機(jī)體功能3個(gè)方面入手,通過清除體內(nèi)毒素達(dá)到外病內(nèi)治的目的,因此可用于多種皮膚科疾病的治療,而用于治療痤瘡的療效尤為顯著[1-4]。現(xiàn)行皮膚病血毒丸的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[5]僅有薄層色譜的鑒別實(shí)驗(yàn),缺乏對(duì)其內(nèi)在質(zhì)量的控制手段,目前也只有2篇關(guān)于測(cè)定皮膚病血毒丸中大黃素與大黃酚含量的文獻(xiàn)[6-7]。中藥指紋圖譜是一種綜合地反映中藥多成分特征的質(zhì)量控制模式,可用于比較不同樣品之間的成分相似性,是目前中藥整體質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要手段[8-10]。為能夠評(píng)價(jià)和控制皮膚病血毒丸的質(zhì)量,本研究參考中藥指紋圖譜相關(guān)文獻(xiàn)[11-21],用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)建立皮膚病血毒丸的指紋圖譜,為對(duì)其內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行有效控制提供參考依據(jù)。
Ulti Mate3000型高效液相色譜儀(包括Chromatpgraphy Data System 7.2 色 譜 工 作 站)、Evolution 201紫外可見光分光光度計(jì)均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司;KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ML204T 電子天平(萬分之一,梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。
皮膚病血毒丸14批(特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批 號(hào) 分 別 為35200601、35200602、35200603、35201101、35201201、35210101、35210102、35210201、35210202、35210203、35210301、35210302、35210303、35210304,編號(hào)分別為S1~S14)。
對(duì)照品:沒食子酸(批號(hào)110831-201204)、綠原酸(批號(hào)110753-201817)、阿魏酸(批號(hào)110773-201614)、丹皮酚(批號(hào)110708-201908)、大黃酸(批號(hào)110757-201607)、大黃酚(批號(hào)110796-201621)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-201415)、大葉茜草素(批號(hào)110884-201606)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。
對(duì)照藥材:金銀花(批號(hào)121060-201608)、茜草(批號(hào)121049-201705)、大黃(批號(hào)120984-201202)、川芎(批號(hào)120918-201813)、當(dāng)歸(批號(hào)120927-201617)、連翹(批號(hào)120908-201817)、牡丹皮(批號(hào)121490-201603)、黃柏(批號(hào)121510-201807)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。
乙腈(色譜純,賽默飛世爾科技有限公司);水為超純水;其余試劑均為分析純。
AcclaimTM120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm)。流動(dòng)相:乙腈(A)-1 m L·L-1磷酸溶液(B)。梯度洗脫:0~8.5 min,3%A~8%A;8.5~13 min,8%A~15%A;13~30 min,15%A~26%A;30~31 min,26%A~29%A;31~40 min,29%A~48%A;40~50 min,48%A ~80%A;50~55 min,80%A~95%A;55~60 min,95%A~100%A。流速:1.0 m L·min-1。柱溫:25℃。檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、丹皮酚、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、大葉茜草素對(duì)照品適量,用甲醇配制成每1 m L含沒 食 子 酸41.4 μg、綠 原 酸0.413 mg、阿 魏 酸28.1μg、丹皮酚20.0μg、大黃酸54.2μg、大黃酚55.6μg、大黃素甲醚26.0μg、大葉茜草素0.104 4 mg的各單一對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備 取皮膚病血毒丸適量,除去包衣,研細(xì),取約1 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇25 m L,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率500 W,頻率40 k Hz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得。
2.2.3 對(duì)照藥材溶液的制備 分別取金銀花、茜草、大黃、川芎、當(dāng)歸、連翹、牡丹皮、黃柏對(duì)照藥材適量,分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備成各對(duì)照藥材溶液。
2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10μL,按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。以3號(hào)共有峰(綠原酸)為參照峰(S峰),計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值為0.05%~0.81%,相對(duì)峰面積的RSD 值為0.19%~1.89%,表明儀器的精密度良好。
2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品,按照2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值為0.02%~0.74%,相對(duì)峰面積的RSD 值為0.19%~1.89%,表明儀器的精密度良好且該方法的重復(fù)性良好。
2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件下于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值為0.04%~0.52%,相對(duì)峰面積的RSD 值為0.30%~2.86%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.4.1 指紋圖譜的建立 取14批皮膚病血毒丸,按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見圖1。將色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A 版)”軟件進(jìn)行分析,對(duì)各指紋圖譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配和多點(diǎn)校正,擬合得到皮膚病血毒丸的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D譜,結(jié)果見圖2。
圖1 14批(S1~S14)皮膚病血毒丸的指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 14 batches(S1~S14)of Pifubing Xuedu Pills
圖2 皮膚病血毒丸的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of Pifubing Xuedu Pills
對(duì)樣品進(jìn)行相似度分析,14批樣品的相似度在0.987~0.999范圍內(nèi),結(jié)果見表1。同時(shí)確定20個(gè)共有峰,其中3號(hào)峰(綠原酸)峰形對(duì)稱、分離度好、峰面積大,因此選其作為參照峰(S峰),以計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果見表2、表3。
表1 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.1 Results of similarity evaluation
表2 共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks
表3 共有峰相對(duì)峰面積Tab.3 Relative peak area of common peaks
2.4.2 共有峰的指認(rèn)和藥材歸屬 分別吸取皮膚病血毒丸供試品溶液、各對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,結(jié)果見圖3、圖4。
圖3 皮膚病血毒丸與對(duì)照藥材溶液的HPLC圖Fig.3 HPLC fingerprints of Pifubing Xuedu Pills and their control medicinal herbs solution
圖4 皮膚病血毒丸與對(duì)照品溶液的HPLC圖Fig.4 HPLC fingerprints of Pifubing Xuedu Pills and their reference substances solution
根據(jù)圖譜各峰保留時(shí)間的比對(duì)分析,對(duì)供試品溶液中的相應(yīng)色譜峰進(jìn)行歸屬指認(rèn),其中1號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為綠原酸、6號(hào)峰為阿魏酸、15號(hào)峰為牡丹酚、17號(hào)峰為大黃素、18號(hào)峰為大黃酚、19號(hào)峰為大黃素甲醚、20號(hào)峰為大葉茜草素;5、6、16號(hào)峰歸屬連翹,3、6、9、10號(hào)峰歸屬川芎,1、8、15號(hào)峰歸屬牡丹皮,1、3、17、18、19號(hào)峰歸屬大黃,4號(hào)峰歸屬黃柏,20號(hào)峰歸屬茜草,6、10號(hào)峰歸屬當(dāng)歸,3、9、10號(hào)峰歸屬金銀花。
本研究考察了乙腈-1 m L·L-1磷酸溶液、乙腈-1 m L·L-1冰醋酸溶液和乙腈-0.5 m L·L-1三氟乙酸溶液等流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙腈-1 m L·L-1磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),色譜峰基線平穩(wěn)、峰形較好,故選擇乙腈-1 m L·L-1磷酸溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)。在選定的流動(dòng)相系統(tǒng)條件下,對(duì)254、280、330 nm 等波長(zhǎng)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)在280 nm 處吸收最強(qiáng),在該檢測(cè)波長(zhǎng)處,皮膚病血毒丸供試品溶液的色譜峰基線平穩(wěn),信息響應(yīng)度強(qiáng),數(shù)量較多,分離效果好,確定280 nm 為指紋圖譜的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。
本實(shí)驗(yàn)考察了以體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇和甲醇為提取溶劑,分別采用超聲和加熱回流方法提取,并考察了不同提取時(shí)間(超聲提取15、30、45 min,回流提取30、45、60 min)對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示,將體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取溶劑、超聲提取30 min獲得的色譜峰峰形較好而且響應(yīng)值較好,故最終選擇以體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取溶劑、超聲30 min作為供試品制備方法。
皮膚病血毒丸制備工藝為組方中藥飲片粉碎至細(xì)粉泛丸而成,組方中的茜草、黃柏、金銀花、當(dāng)歸、川芎、大黃、連翹、牡丹皮是發(fā)揮清熱解毒、消腫止癢、活血通絡(luò)、瀉火通便藥效的主要成分,能蕩滌臟腑熱邪、發(fā)汗去邪、通便排毒、調(diào)整機(jī)體功能,達(dá)到恢復(fù)皮膚健康的目的,因此選用這8味藥材作為研究皮膚病血毒丸的主要對(duì)象。本研究建立皮膚病血毒丸HPLC 指紋圖譜,標(biāo)定20個(gè)共有峰,并進(jìn)行共有峰的歸屬,指認(rèn)8種主要特征成分,用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A 版)”對(duì)14批皮膚病血毒丸的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià),相似度在0.987~0.999范圍內(nèi),相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值在0.04~0.62范圍內(nèi),表明不同批次的皮膚病血毒丸化學(xué)成分大致相同,其生產(chǎn)質(zhì)量較為穩(wěn)定。
綜上所述,該方法操作簡(jiǎn)單快捷,穩(wěn)定性好,能夠較好地反映皮膚病血毒丸的化學(xué)成分,用該方法評(píng)價(jià)皮膚病血毒丸的質(zhì)量,可以彌補(bǔ)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足和完善相關(guān)評(píng)價(jià)系統(tǒng),為有效評(píng)價(jià)和控制皮膚病血毒丸的質(zhì)量提供參考。