代小偉 王嫩寒 陳雙雙 楊新宇 田麗麗 陳紅 張泓泰 李傳友

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)發(fā)布的2020年全球結(jié)核病報(bào)告指出，中國估算結(jié)核病患者數(shù)約為84.2萬例，而實(shí)際登記的患者數(shù)僅為62.4萬例[1]。因此，開發(fā)快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法對于結(jié)核病患者的早發(fā)現(xiàn)、早治療、阻止結(jié)核病的社區(qū)傳播至關(guān)重要。目前，結(jié)核分枝桿菌常規(guī)檢測中，萋-尼抗酸桿菌涂片鏡檢(簡稱“涂片”)速度快、方便、成本低，但陽性率低；分枝桿菌培養(yǎng)(包含羅氏培養(yǎng)和MGIT 960液體培養(yǎng))周期長，無法解決快速診斷的問題；分子診斷方法中的GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)雖應(yīng)用最廣，檢測時(shí)效較令人滿意，但屬于進(jìn)口產(chǎn)品，檢測成本較高。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，利用其進(jìn)行微生物檢測、耐藥預(yù)測及傳播溯源的研究越來越多[2-5]，而二代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)顯示出高敏感度的特性。筆者將利用NGS技術(shù)直接對臨床痰液標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測，并與現(xiàn)有其他相關(guān)檢測方法進(jìn)行比較[6]，為推進(jìn)其直接檢測痰液標(biāo)本的可行性提供有利證據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

參照納入標(biāo)準(zhǔn)選取2021年8—10月北京市疾病預(yù)防控制中心(北京結(jié)核病控制研究與防治所)門診收治的49例疑似肺結(jié)核患者，其中男性31例，女性18例，年齡范圍為16～86歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為46(28，57)歲。每例患者采集5份清晨痰標(biāo)本，共計(jì)245份，分別進(jìn)行涂片、羅氏培養(yǎng)和MGIT 960液體培養(yǎng)、Xpert以及NGS檢測。本研究獲得本單位倫理審查委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號：2021-03)，并取得所有患者知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：存在咳嗽、咳痰、發(fā)熱、消瘦、盜汗等全身結(jié)核癥狀，胸部X線攝片異常，可采集到5 ml/次以上痰液標(biāo)本，并愿意參加研究的疑似患者。

二、儀器和試劑

涂片染色液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；酸性羅氏培養(yǎng)基由河南賽諾特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；MGIT 960全自動結(jié)核分枝桿菌快速液體培養(yǎng)儀及其配套試劑由美國BD公司生產(chǎn)；GeneXpert MTB/RIF核酸檢測儀及試劑由美國Cepheid公司生產(chǎn)；MPB64菌群鑒定試劑盒由杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司提供；PCR-熒光探針法使用Roche LightCycler 480儀，試劑由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；NGS-MTB基因組提取純化試劑盒和NGS-測序文庫構(gòu)建試劑盒均由盛世中方(北京)生物科技有限公司提供；NGS分析結(jié)果由南京滕辰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告。

三、研究方法

1.肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[7]和《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)》[8]，將患者分為確診病例(病原學(xué)檢測陽性)、臨床診斷病例(無病原學(xué)證據(jù)，但具有結(jié)核病臨床體征、影像學(xué)異?；蛎庖邔W(xué)檢查陽性)、非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria，NTM)感染病例和非肺結(jié)核病例。

2.取樣：采集患者5份清晨痰標(biāo)本，每份不少于2 ml，一并送至門診環(huán)保采樣間。實(shí)驗(yàn)室當(dāng)天取樣當(dāng)天檢測。

3.涂片鏡檢：按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[9](以下簡稱“《規(guī)程》”)進(jìn)行抗酸桿菌涂片鏡檢及結(jié)果判讀。同一例患者3份標(biāo)本用于痰涂片檢測，任何一份痰標(biāo)本發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌即判定為涂片陽性。

4.培養(yǎng)：(1)羅氏培養(yǎng)：按照《規(guī)程》，分別從用于痰涂片檢測的3份標(biāo)本中任取2份痰標(biāo)本各0.5 ml，使用4%NaOH以1∶1比例進(jìn)行消化處理，15 min后各取0.1 ml接種到2個(gè)酸性羅氏培養(yǎng)基中。每周觀察1次培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)菌落生長后挑取菌落完成萋-尼染色涂片，發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌則報(bào)告為培養(yǎng)陽性；2個(gè)月未見菌落生長即報(bào)告陰性。(2)MGIT 960液體培養(yǎng)：另取1份痰標(biāo)本0.5 ml加入到50 ml圓底離心管內(nèi)，再加入1～2 ml 2%NaOH和N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC-NaOH)處理液，振蕩消化15 min，加入40 ml無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.8)中和離心(3000×g離心18 min)，棄上清，加入1 ml PBS進(jìn)行重懸沉淀，取0.1 ml接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)管內(nèi)。陰性結(jié)果報(bào)告時(shí)間設(shè)為42 d。取儀器報(bào)陽培養(yǎng)液進(jìn)行涂片鏡檢，確定菌純度，并使用MPB64抗原法和PCR法進(jìn)行初步菌群鑒定。(3)培養(yǎng)質(zhì)量控制：羅氏培養(yǎng)基在冷藏條件下不超過2個(gè)月；每個(gè)月打印液體培養(yǎng)質(zhì)量控制報(bào)告，每批MGIT培養(yǎng)管進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量控制檢測(使用結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌液)。(4)結(jié)果判斷：同一例患者兩種培養(yǎng)方法中任一培養(yǎng)陽性則判定培養(yǎng)結(jié)果為陽性。

5.Xpert檢測：取用于痰涂片檢測的3份標(biāo)本中的另1份痰標(biāo)本1 ml，加入2 ml標(biāo)本處理液，振蕩混勻，消化15 min后，吸取2 ml液化標(biāo)本于反應(yīng)盒內(nèi)，置入檢測儀內(nèi)自動檢測，反應(yīng)結(jié)束后可直接觀察測試結(jié)果。所有檢測步驟和質(zhì)量控制均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)室每年參加國家疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的結(jié)核分枝桿菌分子檢測室間質(zhì)評，考核結(jié)果均合格。

6.MPB64菌群鑒定：對培養(yǎng)陽性的菌落或菌液進(jìn)行菌群鑒定。取0.2 ml生理鹽水于1.5 ml離心管內(nèi)，加入1～2個(gè)羅氏培養(yǎng)陽性菌落渦旋混勻或陽性液體培養(yǎng)物，取0.1 ml混勻菌液滴入檢測板加樣孔內(nèi)，15 min后觀察結(jié)果。當(dāng)檢測線(T)和質(zhì)控線(C)均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，表明培養(yǎng)物為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)，判斷為陽性；當(dāng)檢測線(T)處無條帶，只有質(zhì)控線(C)處出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，表明培養(yǎng)物為NTM復(fù)合群，判斷為陰性；如果質(zhì)控線(C)處無條帶出現(xiàn)，需重新檢測。

7.PCR檢測：對MPB64法檢測陰性培養(yǎng)物進(jìn)行PCR熒光探針法檢查。吸取20 μl培養(yǎng)液入80 μl 核酸提取液，充分渦旋后放入核酸提取儀，最大轉(zhuǎn)速振蕩5 min，95 ℃水浴5 min，10 000×g離心3 min；取上清2 μl入擴(kuò)增反應(yīng)液，上機(jī)。樣本擴(kuò)增區(qū)線為S型，F(xiàn)AM通道陰性，HEX通道Ct值<40判定為NTM陽性。

8.NGS技術(shù)：(1)痰標(biāo)本DNA提取：取最后1份痰標(biāo)本1 ml，加入等體積或2倍體積的前NALC-NaOH處理液室溫下振蕩液化15 min。用PBS中和，3000×g離心18 min。離心后去上清，沉淀物用2 ml的PBS重懸，80 ℃水浴20 min。按照NGS-MTB基因組提取純化試劑盒說明書進(jìn)行痰菌基因組提取。按照痰液NGS-MTB檢測文庫構(gòu)建試劑盒說明書對痰液中可能存在的結(jié)核分枝桿菌基因組進(jìn)行rpoB基因文庫制備。制備后的文庫送至南京滕辰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，使用Illumina NextSeq 500進(jìn)行上機(jī)測序，以H37Rv為參考基因組進(jìn)行序列分析。由于研究所用的rpoB基因在鑒定NTM上還有一定的局限性，需要再增加其他基因才能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的NTM鑒定，故此次靶向NGS測序未關(guān)注NTM方面的鑒定。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以“例(百分率，%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)(樣本量小于40時(shí)，采用Fisher精確概率法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以臨床最終診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)涂片、培養(yǎng)、Xpert和NGS測序技術(shù)等方法的檢測效能，并對各種方法與臨床最終診斷的一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)。Kappa值在0.00～0.20為極低一致性、0.21～0.40為一般一致性、0.41～0.60為中度一致性、0.61～0.80為高度一致性、0.81～1.00為幾乎完全一致。

結(jié) 果

一、4種方法檢測結(jié)果

NGS檢測49例疑似肺結(jié)核患者的陽性率[69.4%(34/49)]明顯高于涂片、培養(yǎng)和Xpert[分別為44.9%(22/49)、51.0%(25/49)和49.0%(24/49)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.614、17.018、20.753，P值均=0.000)。具體見表1。

表1 NGS技術(shù)與其他3種方法檢測結(jié)果比較

二、4種方法在不同類型患者中的檢測情況

最終確診肺結(jié)核患者40例(81.6%)，非肺結(jié)核患者9例(18.4%)。4種方法檢測病原學(xué)陽性確診肺結(jié)核患者的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.261)；檢測病原學(xué)陰性肺結(jié)核患者的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。18例涂片陰性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)法和Xpert檢測陽性者均為3例，NGS技術(shù)檢測陽性者為10例，NGS技術(shù)檢測陽性率[55.6%(10/18)]均明顯高于培養(yǎng)和Xpert[均為16.7%(3/18)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為χ2=8.704，P=0.013)。

非肺結(jié)核患者中，NTM感染者為經(jīng)MGIT 960液體培養(yǎng)陽性后再經(jīng)MPB64抗原檢測及PCR初步菌群鑒定確診；其他8例非肺結(jié)核患者結(jié)核病常規(guī)檢查均為陰性，僅2例經(jīng)NGS技術(shù)檢測陽性(標(biāo)本序列數(shù)都在100以上)，該2例患者有長期咳嗽咳痰癥狀，按照非肺結(jié)核進(jìn)行治療后，癥狀無明顯好轉(zhuǎn)，其中1例復(fù)查CT顯示未治愈，因此考慮結(jié)核感染可能。具體見表2。

表2 49例臨床疑似肺結(jié)核患者在4種方法中的檢出情況

三、4種方法的檢測效能

以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，各種檢測方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及一致性情況見表3。其中，NGS技術(shù)的檢測敏感度最高，培養(yǎng)和Xpert次之，涂片法最低。但涂片法和Xpert檢測的特異度最高，而培養(yǎng)法特異度稍低，有1例經(jīng)菌種鑒定為NTM；NGS技術(shù)的特異度最低，有2例陽性者為非肺結(jié)核。4種方法中，NGS技術(shù)的檢測結(jié)果與臨床診斷的一致率最高，一致性中等。

表3 4種方法檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的診斷效能

討 論

《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[7]中明確了結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢測方法有涂片、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)及核酸檢測。培養(yǎng)方法雖作為結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)但不能滿足臨床快速診斷的需求，核酸檢測的代表是WHO強(qiáng)烈推薦的GeneXpert MTB/RIF試劑盒，以操作簡便、時(shí)效短、高敏感度和高特異度而受到推崇[10-12]。雖然4種病原學(xué)檢測方法聯(lián)合應(yīng)用可極大地提高結(jié)核病診斷效率[6]，但作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，陽性檢出率仍難以進(jìn)一步提高，亟需開發(fā)新的快速高效準(zhǔn)確的結(jié)核病診斷方法。

NGS技術(shù)又稱高通量測序技術(shù)，是基于核酸序列的邊合成邊測序，可對多樣本、多位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行測序且具有較高覆蓋率，已被應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的耐藥預(yù)測、微進(jìn)化與傳播、譜系及亞種鑒定等研究[13-16]。盡管宏基因組NGS技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于結(jié)核病患者不同臨床樣本的檢測中[17-18]，但受制于既往昂貴的檢測費(fèi)用，該技術(shù)并沒有得到臨床廣泛應(yīng)用；加之現(xiàn)有研究多是基于臨床分離菌株或少數(shù)基于痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌耐藥性的分析[19-20]，使得基于臨床痰標(biāo)本的診斷效能數(shù)據(jù)不足。為此，我們基于rpoB基因設(shè)計(jì)了單重PCR與NGS聯(lián)合應(yīng)用檢測臨床痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)，為其在結(jié)核病診斷上的價(jià)值提供了依據(jù)。

本研究對49例疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本使用不同方法(涂片法、培養(yǎng)法、Xpert法和NGS技術(shù))進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)NGS技術(shù)的檢測陽性率明顯高于其他3種方法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但幾種檢測方法對肺結(jié)核病原學(xué)陽性患者的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。值得注意的是，在檢測病原學(xué)陰性或涂陰肺結(jié)核患者時(shí)，NGS技術(shù)的檢測陽性率分別達(dá)到了46.7%和55.6%，顯示出明顯的技術(shù)優(yōu)勢，提示當(dāng)可疑肺結(jié)核患者出現(xiàn)1種或多種病原學(xué)檢測結(jié)果為陰性時(shí)，應(yīng)及時(shí)對痰標(biāo)本進(jìn)行NGS檢測，盡量前移診斷關(guān)口，為及早發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者提供病原學(xué)依據(jù)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，以臨床最終診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，NGS技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌檢測的敏感度、一致率、Kappa值等均明顯高于其他檢測方法，提示NGS技術(shù)較其他傳統(tǒng)檢測方法，與臨床診斷有較好的符合性，具備較高的診斷效能。

需要說明的是，在4種檢測方法中，涂片和Xpert檢測的特異度均達(dá)到了9/9，培養(yǎng)法次之(8/9)，檢出1例非結(jié)核分枝桿菌，而NGS技術(shù)的檢測特異度低于這幾種方法，為7/9，認(rèn)為主要與2例疑似患者不能確診為結(jié)核病有關(guān)。該2例患者均有較長時(shí)間的咳嗽咳痰癥狀，結(jié)核病常規(guī)篩查方法均陰性，在以診斷性肺炎治療后，癥狀并無明顯好轉(zhuǎn)，針對此情況，研究重復(fù)分析了2例患者測序結(jié)果，均檢測到結(jié)核分枝桿菌rpoB基因特異性序列，且序列數(shù)均大于100個(gè)，提示檢出結(jié)核分枝桿菌。故筆者認(rèn)為此2例非肺結(jié)核患者可高度可疑為肺結(jié)核，后續(xù)還需進(jìn)一步收集患者標(biāo)本并隨訪其癥狀發(fā)展及診治情況。如該患者最終診斷為肺結(jié)核，則可大大提高NGS技術(shù)的檢測特異度和臨床應(yīng)用價(jià)值。

周睍等[21]曾應(yīng)用宏基因組二代測序技術(shù)對活動性結(jié)核病患者進(jìn)行診斷價(jià)值評估，其檢測標(biāo)本為支氣管灌洗液、腦脊液、胸腔積液、膿液、腹腔積液及肝組織，在確診患者中NGS的檢測敏感度為66.7%，特異度為100.0%，大大提高了活動性結(jié)核病的診斷效能。雖然該研究標(biāo)本不包括痰液，但NGS測序技術(shù)能快速檢測MTBC，為其在結(jié)核病早期輔助診斷方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2021年，全球結(jié)核病報(bào)告中特別提到了結(jié)核病新診斷技術(shù)的創(chuàng)新，其中就包括可直接分析痰標(biāo)本的新一代測序方法[22]。本研究是基于rpoB基因的單重PCR-NGS技術(shù)，相對于宏基因組NGS檢測結(jié)核病而言，該技術(shù)具備更強(qiáng)的靶向性，且具有建庫和分析均相對簡單、高通量、報(bào)告方便解讀等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NGS技術(shù)檢測敏感度高，尤其是在肺結(jié)核臨床診斷病例和常規(guī)病原學(xué)檢測陰性患者中的陽性率尤為明顯，具有很好的結(jié)核病診斷及防治應(yīng)用前景。另外，本研究使用的單重PCR-NGS技術(shù)的費(fèi)用方面與Xpert檢測基本相當(dāng)，明顯低于宏基因組測序費(fèi)用，而且該技術(shù)還可同時(shí)預(yù)測耐藥情況，但由于例數(shù)較少，本文不做分析，但認(rèn)為隨著科技的不斷進(jìn)步，NGS技術(shù)將具有很大的應(yīng)用前景。

本研究也存在以下局限：首先，因?yàn)楸敬窝芯拷?jīng)費(fèi)所限，選例數(shù)量相對較少，可能對結(jié)果產(chǎn)生偏倚影響，但從研究納入的病例中能夠很明顯的觀察到NGS技術(shù)在陽性檢出方面的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)者后續(xù)將繼續(xù)積累樣本，以增大結(jié)果的代表性；其次，雖然NGS技術(shù)也可以同時(shí)預(yù)測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，但限于研究選例中耐藥患者數(shù)量不足以進(jìn)行比較分析，今后的研究應(yīng)增加樣本量以及耐藥的標(biāo)本數(shù)，進(jìn)行更詳細(xì)的分組和深入分析；最后，NGS測序結(jié)果陽性的疑似肺結(jié)核患者，后續(xù)的復(fù)檢和抗結(jié)核治療效果追蹤需在患者同意的情況下進(jìn)行，可能會對診斷結(jié)果的最終判定產(chǎn)生一定影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)代小偉：研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及論文撰寫；王嫩寒、陳雙雙、陳紅：采集和整理數(shù)據(jù)；楊新宇和田麗麗：課題溝通及技術(shù)支持；張泓泰和李傳友：研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和知識性指導(dǎo)