陸霓虹 沈凌筠 劉洪璐 陳楊君 楊艷 杜映榮

目前，四聯(lián)抗結(jié)核藥物治療方案是最有效的治療肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)的方法[1]。但是隨著抗結(jié)核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATB-DILI)的發(fā)生率不斷上升，停用抗結(jié)核藥物導致的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)耐藥率也在明顯增加[2]。如何降低ATB-DILI的發(fā)生率，探尋其臨床影響因素已是目前ATB-DILI防治研究的熱點。早期分泌抗原靶6(early secreted antigenic target-6，ESAT-6)作為結(jié)核分枝桿菌毒力因子，可誘發(fā)機體產(chǎn)生炎癥反應，從而產(chǎn)生多種參與肝損傷后不同階段炎癥和修復過程的炎癥因子[3]，主要體現(xiàn)了MTB感染的嚴重性。而MTB感染引起的一系列炎癥反應，又可引起炎性因子的表達上調(diào)，其中包括新的與肝損傷密切相關的可降解細胞外基質(zhì)和激活人類肝星狀細胞的基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein，MMP-9)和MMP-14[4]。因此，筆者擬通過分析免疫指標、炎癥指標、ESAT-6和MMP在ATB-DILI患者中的表達，發(fā)現(xiàn)新的與ATB-DILI發(fā)生相關的評估因子及影響因素，為ATB-DILI的早期診斷及預防提供更多臨床依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

選擇2019年1月至2021年1月昆明市第三人民醫(yī)院收治的符合入組標準的肺結(jié)核患者325例，其中發(fā)生ATB-DILI的患者115例(A組)，未發(fā)生肝損傷的患者210例(B組)；同時收集同期門診的健康體檢者98名(C組)。研究經(jīng)昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(編號：201902313)，所有入組患者均告知研究目的并簽署知情同意書。

A組中，男性患者70例(60.7%)，女性患者45例(39.3%)；年齡范圍為18～79歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為51.2(18.9，77.2)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為18.2±3.5。B組中，男性患者122例(58.1%)，女性患者88例(41.9%)，年齡范圍為19～61歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為39.1(19.7，63.3)歲；BMI為20.6±2.8。C組中，男性55名(56.1%)，女性43名(43.9%)，年齡范圍為20～59歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為36.3(20.1，61.3)歲；BMI為21.2±2.5。3組對象的年齡總體差異有統(tǒng)計學意義(H=29.721，P=0.000)，其中A組與B組、C組的年齡差異均有統(tǒng)計學意義(H=27.695，P=0.000；H=29.982，P=0.000)，但B組和C組年齡的差異無統(tǒng)計學意義(H=3.245，P=0.137)；性別、BMI的差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.506，P=0.776；F=0.735，P=0.415)。

二、研究方法

1.患者入組標準：納入首次住院診斷肺結(jié)核患者作為A組和B組。排除既往患各類型肝炎者；患各類免疫功能低下疾病(腫瘤、糖尿病等)者；接受免疫抑制劑治療者；使用其他導致藥物性肝損傷藥物者；非首次確診肺結(jié)核或耐藥肺結(jié)核者。

2.臨床診斷標準：(1)肺結(jié)核：按照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[5]的相關標準，納入患者為臨床診斷及確診病例；(2)ATB-DILI診斷：指使用2H-R-Z-E/4H-R抗結(jié)核治療方案后，患者在治療過程中出現(xiàn)與抗結(jié)核藥物使用直接相關的肝損傷。診斷標準符合中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會制定的《抗結(jié)核藥物肝損傷診治指南(2019年版)》[6]。

3.檢測指標及方法：(1)白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)、C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、D-二聚體(D-dimer，D-D)和T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞)：抽取患者清晨空腹血，采用全自動生化分析儀檢測肝功能、凝血功能、感染指標，試劑盒購自瑞士羅氏公司及美國RD公司；使用美國BD公司FACSCalibur型流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群。(2)ESAT-6、MMP-9和MMP-14：血清管收集各組空腹靜脈血5 ml，4 ℃低速離心機中以2000 r/min離心5 min，離心半徑為16.80 cm，收集上清液于凍存管中。標本使用海爾4 ℃/-20 ℃冰箱保存。使用上海酶聯(lián)生物公司的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(貨號分別為ml037353、ml058617、ml026258)和蛋白酶標儀(美國Molecular Innovations公司的SPECTCA MAX190)采用雙抗體夾心法檢測血清ESAT-6、MMP-9、MMP-14的濃度。其中，使用酶標儀測定450 nm波長下吸光度值，通過標準曲線計算血清樣本中不同MMP的含量；使用酶標儀檢測450 nm波長下吸光度值，根據(jù)標準品濃度和吸光度值做出標準曲線并計算回歸方程，再根據(jù)所得回歸方程計算ESAT-6蛋白含量。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。偏態(tài)分布的計量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”描述，組間差異的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，總體差異的比較選用Kruskal-Wallis單因素ANOVA(k樣本)檢驗。使用多因素logistic回歸模型分析導致ATB-DILI發(fā)生的危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、 不同炎性指標在3組研究對象中的檢測情況

3組研究對象的CD4+T淋巴細胞計數(shù)、PCT和D-D的差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；CRP、IL-6總體的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。各組間兩兩比較，僅CD4+T淋巴細胞計數(shù)、PCT和D-D的差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。具體見表1。

表1 不同炎性指標在3組研究對象中的檢測情況

二、不同免疫指標在3組中的檢測情況

與C組比較，ESAT-6在A組與B組表達均升高，3組總體差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；進一步進行組間兩兩比較，3組間差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。MMP-9、MMP-14在A組和B組表達均升高，3組總體差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；進一步組間對比分析，MMP-14在A組與C組、B組與C組間的差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，在A組與B組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而MMP-9在3組中各組間的兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，具體見表2。

表2 ESAT-6、MMP-9、MMP-14在3組研究對象中的檢測情況

表3 logistic回歸分析變量賦值表

三、ATB-DILI發(fā)生的影響因素分析

參照上文檢測結(jié)果，以是否發(fā)生ATB-DILI為因變量，將差異有統(tǒng)計學意義的年齡、CD4+T淋巴細胞計數(shù)、PCT、D-二聚體、ESAT-6、MMP-9、MMP-14納入到多因素模型中進行分析(賦值變量見表3)，結(jié)果顯示：年齡>65歲、ESAT-6>30.5 pg/ml是發(fā)生ATB-DILI的獨立危險因素，具體見表4。

表4 與ATB-DILI發(fā)生相關因素的logistic回歸分析

討 論

ATB-DILI的發(fā)生在PTB的治療過程中越來越常見，占PTB患者的10%[7]，嚴重影響PTB的全程規(guī)范治療，導致治療中斷、抗結(jié)核藥物的耐藥率上升[8]。如何預防ATB-DILI的發(fā)生及發(fā)展是目前ATB-DILI臨床研究的重點。

有研究報道，發(fā)生ATB-DILI的PTB患者年齡較大，BMI偏低，提示高齡患者更易發(fā)生ATB-DILI?？紤]與老年人整體機能減退，營養(yǎng)狀況、機體免疫功能、心肺負荷狀態(tài)均較年輕PTB患者下降，尤其是肝臟的代謝功能減退，使其不能及時緩解抗結(jié)核藥物所致的急性炎癥反應及免疫反應有關[9-10]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生ATB-DILI的PTB患者年齡明顯高于未發(fā)生ATB-DILI的患者；多因素分析結(jié)果也顯示，高齡是發(fā)生ATB-DILI的獨立危險因素，與文獻報道相符[9-11]，這提示對高齡PTB患者應及時應用預防性保肝藥物，可能會降低ATB-DILI的發(fā)生風險。

ATB-DILI的發(fā)生及進展機制目前仍未明了，有研究認為可能與炎癥機制相關[12]。抗結(jié)核藥物殺死MTB的同時促進了機體釋放炎癥因子，導致肝細胞損傷及凋亡[13]。PCT性能穩(wěn)定，是一種無激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，不易受免疫功能低下、心功能損傷等干擾，在機體正常狀態(tài)下，可由甲狀腺髓質(zhì)細胞分泌，但在機體炎癥狀態(tài)下，則與多種炎癥反應密切相關[14]，故目前已廣泛應用于感染程度的評估及指導臨床抗生素的使用[15]。本研究結(jié)果顯示，病例組PTB患者的PCT值均高于健康對照組，且在發(fā)生ATB-DILI與未發(fā)生ATB-DILI的患者間的差異有統(tǒng)計學意義，這可能與炎癥因子可以導致肝臟固有免疫細胞間的不平衡，引起機體的免疫反應，進一步加重肝細胞損傷，促使肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[16]有關，提示炎癥機制可能是ATB-DILI發(fā)生的原因之一。D-二聚體是纖維蛋白單體經(jīng)活化因子交聯(lián)后產(chǎn)生的一種特異性降解產(chǎn)物，在重癥感染及組織壞死的情況下可升高[17]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生ATB-DILI的PTB患者D-二聚體升高，明顯高于未發(fā)生ATB-DILI的患者，提示ATB-DILI的發(fā)生可能與炎癥反應下機體血液高凝狀態(tài)有關。

有研究發(fā)現(xiàn)，人體的呼吸系統(tǒng)會隨著MTB感染及播散不斷地經(jīng)歷巨噬細胞的吞噬及釋放，且在MTB攻擊呼吸道上皮細胞的同時，也吸引機體淋巴細胞的攻擊與殺滅[18]。由此認為結(jié)核病的發(fā)生與患者的免疫狀況密切相關。本研究顯示，PTB患者與健康對照組相比T淋巴細胞明顯降低，與文獻報道一致[19]。機體殺傷MTB過程中消耗大量T淋巴細胞，尤其是CD4+T淋巴細胞，使得PTB患者均有不同程度的免疫功能下降，尤其是CD4+T淋巴細胞的下降明顯[20]。另外，肝損傷患者免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，主要表現(xiàn)為體液免疫功能亢進、細胞免疫受抑制[21]。本研究中兩組PTB患者均有不同程度的CD4+T淋巴細胞減少，尤其是發(fā)生ATB-DILI的患者下降程度明顯高于未發(fā)生ATB-DILI的患者，研究結(jié)論符合目前文獻報道[20]。

ESAT-6是MTB早期產(chǎn)生的靶向分泌抗原，具有多項免疫活性特征。本研究采用ELISA方法檢測ESAT-6蛋白表達，該方法多用于腦脊液的ESAT-6檢測[22]，也有少量文獻報道其用于檢測血清中的ESAT-6，但因血清中ESAT-6含量較少，MTB大量存活才可能被檢測到，存在假陰性的可能。但若在受試者中檢測出ESAT-6，則不僅代表有MTB感染，更能預示著MTB已經(jīng)進入了大量繁殖、感染性和致病性強的階段。目前，常用的斑點試驗是檢測抗體，陽性率較高，但對于免疫功能低下的PTB患者無法做出良好的區(qū)分，這也是本研究使用ESAT-6抗原檢測的原因。研究結(jié)果顯示，ESAT-6在PTB患者中高表達，在健康對照組中幾乎無表達，故認為ESAT-6可用于活動性結(jié)核病的輔助診斷。

ESAT-6不僅能促進MTB遷移及播散，破壞肺上皮細胞，加重PTB患者病情[23]，還可以調(diào)節(jié)炎癥因子分泌MMP。MMP是一類Zn2+依賴的蛋白水解酶，參與多項炎癥反應及內(nèi)皮細胞代謝，在健康人群中基本不表達或表達量極低[24]。MMP-9是MMP家族中一員，可以由巨噬細胞、中性粒細胞等多種細胞分泌，在87位氨基酸殘基或附近被酶解激活，主要保持酶的活性穩(wěn)定[25]，并參與多種炎癥反應、組織修復、炎癥因子的表達等[26]。本研究顯示，ESAT-6及MMP-9在發(fā)生ATB-DILI的PTB患者中表達明顯上升，明顯高于未發(fā)生ATB-DILI的患者，提示ESAT-6及MMP-9高表達的患者更容易發(fā)生ATB-DILI。此外，多因素分析結(jié)果表明，ESAT-6升高(>30.5 pg/ml)是PTB患者發(fā)生肝損傷的獨立危險因素，其原因可能是ESAT-6高表達的PTB患者MTB的侵襲力更強[27]，引起的機體炎癥反應更重，導致大量的炎癥因子刺激多種分子作用于肝細胞，造成肝細胞線粒體損傷、肝細胞壞死凋亡，發(fā)生不同程度的肝損傷[28]。而MMP-9能降解細胞外基質(zhì)，干擾肝臟細胞-細胞、細胞-基質(zhì)的相互作用，以及肝星狀細胞的活化、增殖及細胞外基質(zhì)的形成，促進肝損傷及纖維化[29]。MMP-14表達升高也可觸發(fā)MMP的瀑布式激活，加重炎癥反應，溶解細胞周圍纖維蛋白，兩者是導致ATB-DILI中肝血管損傷發(fā)生發(fā)展的重要因素，也是導致肝血管增生、促進ATB-DILI后期肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素[30]。但遺憾的是，本研究中MMP-14雖在PTB患者中高表達，但在發(fā)生與未發(fā)生ATB-DILI的兩組PTB患者中未表現(xiàn)出差異，與前期的研究提示MMP-14在肝血管損傷型ATB-DILI患者中高表達[31]不一致，考慮與發(fā)生ATB-DILI的患者中肝血管損傷型較少，未發(fā)生ATB-DILI的患者納入數(shù)量較多有關。

綜上所述，高齡(>65歲)、ESAT-6升高(>30.5 pg/ml)是PTB患者發(fā)生ATB-DILI的獨立危險因素。針對這類患者進行抗結(jié)核藥物治療時，需密切觀察其用藥反應，提前應用保肝藥物，可能對降低ATB-DILI的發(fā)生發(fā)展的風險具有一定價值。由于本研究入組的數(shù)據(jù)有限，研究結(jié)論可能需要更多樣本的支持來進行佐證，后續(xù)筆者將開展更大樣本的ATB-DILI發(fā)生發(fā)展的流行病學數(shù)據(jù)分析及臨床研究，以提供更準確更翔實的依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻陸霓虹：分析數(shù)據(jù)及論文撰寫；沈凌筠、劉洪璐：數(shù)據(jù)采集；陳楊君、楊艷：患者臨床診療及管理；杜映榮：論文修改