劉海婷 李東碩 張蕾 王寧 王彬 丁楊明 姚蓉 陸宇

耐藥結核病的迅速出現對結核病化療提出了挑戰(zhàn)，需要開發(fā)新的藥物和治療方案，并且對現有抗結核藥物間相互作用的研究將有助于開發(fā)更好的協(xié)同藥物組合。吡法齊明(pyrifazimine，TBI-166)是我國自主研發(fā)的抗耐藥結核病新藥，在體外及小鼠體內研究中發(fā)現其具有較好的安全性和有效性[1-2]，目前正在進行Ⅱ期臨床試驗。TBI-166的作用機制尚不明確，筆者所在課題組前期對TBI-166的作用機制進行了研究，發(fā)現其通過累積活性氧(ROS)，降低三磷酸腺苷(ATP)水平，從而發(fā)揮抗結核活性[3-4]。由于結核病的治療依賴于有效的藥物組合方案，因此，對TBI-166的藥物組合進行抗結核活性研究十分必要。為此，筆者所在課題組基于前期研究結果，著重開展TBI-166與貝達喹啉(bedaquiline，Bdq)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)、德拉馬尼(delamanid，Dlm)、SQ109、PBTZ169的兩藥組合對3株結核分枝桿菌(MTB)臨床分離株(包括2株藥物敏感菌、1株耐藥菌)的體外抗結核活性，并初步探討TBI-166與Bdq的協(xié)同作用機制，以期發(fā)現更有效的抗結核新方案。

材料和方法

一、 材料

1.實驗菌株：MTB標準株H37Rv(ATCC 27294)、2株藥物敏感性MTB臨床分離株(菌株編號：30031和30091)，以及1株前廣泛耐藥結核分枝桿菌(pre-XDR-MTB)臨床分離株(菌株編號：13385；對異煙肼、利福平、氟喹諾酮類藥物耐藥)于北京市結核病胸部腫瘤研究所藥物學研究室保存。

2.主要儀器：高壓蒸汽滅菌器(日本三洋公司)、超低溫冰箱(日本三洋公司)、METTLER TOLEDO電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團)、電熱恒溫水浴鍋(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、Tecan Infinite 200酶標儀(瑞士帝肯集團公司)、二級生物安全柜(新加坡Esco公司)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技公司)、MaX-Q8000低溫搖床(美國賽默飛世爾科技公司)、1730R微量高速冷凍離心機(美國基因技術公司)。

3.材料及試劑：二分隔培養(yǎng)皿、涂布器、Alamar Blue指示劑(英國AbD Serotec公司)；7H9液體培養(yǎng)基干粉、7H10固體培養(yǎng)基干粉(美國Becton Dickinson公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；北京索萊寶科技有限公司)；丙三醇(北京化工廠)；細菌ROS檢測試劑盒(上海貝博生物科技有限公司；批號：BB-46111)、ATP檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

4.實驗藥物：TBI-166(純度>99%，由中國醫(yī)學科學院藥物研究所黃海洪教授課題組提供)、異煙肼(isoniazid，INH；純度≥99%，美國Sigma公司)、利福平(rifampicin，RFP；純度≥97%，美國Sigma公司)、Bdq(純度>99%，上海瀚香生物科技有限公司)、Mfx(純度>98%，上海瀚香生物科技有限公司)、Dlm(美國TargetMol公司)、SQ109(純度>98%，上海昶衍化工科技有限公司)、PBTZ169(由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所劉明亮課題組合成)。

二、 方法

1.棋盤法測定兩藥組合的相互作用：將TBI-166、INH、RFP、Bdq、Mfx、Dlm、SQ109、PBTZ169以DMSO為溶劑配制成2 mg/ml的儲備液，以7H9肉湯進行稀釋，通過微孔板阿爾瑪藍染色法(microplate alamar blue assay，MABA)[5]，采用連續(xù)二倍稀釋測定藥物對3株MTB臨床分離株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。應用棋盤法在96孔板中測定TBI-166與其他抗結核藥物合用的MIC，96孔板中每孔含有經二倍稀釋的TBI-166和另一種抗結核藥物(Bdq、Mfx、Dlm、SQ109、PBTZ169)，按棋盤方式進行分配[6-7]，兩者的最終濃度分別為各藥物的2×MIC-1/16×MIC。通過觀察96孔板中顏色的變化來確定藥物聯合應用中單藥的MIC。組合作用由分級抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index，FICI)確定，FICI=(MICA聯合/MICA單獨)+(MICB聯合/MICB單獨)，MICA單獨和MICB單獨分別表示A藥和B藥單用時的MIC，MICA聯合和MICB聯合分別表示A藥和B藥組合后相應的MIC。兩藥組合相互作用的判定標準如下：當FICI≤0.5時，兩藥為協(xié)同作用；當0.5

2.時間殺菌曲線法評估含TBI-166的兩藥組合的抗菌活性：采用時間殺菌曲線法進一步評估具有部分協(xié)同或相加作用的含TBI-166兩藥組合的抗菌效果，各藥物濃度設定為1/2MIC或1/4MIC。

具體操作方法：在24孔板中設置各亞抑制濃度(1/2MIC或1/4MIC)的單藥孔及兩藥聯用孔，以7H9進行稀釋，調整每孔菌終濃度為1×105CFU/ml，將24孔板在37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。分別在給藥當天(D0)、第3天、第7天、第10天和第14天，吸取100 μl，以無菌1×磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋液進行連續(xù)10倍稀釋，吸取100 μl的上述稀釋菌液涂布在含10%OADC、0.5%丙三醇的7H10固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)3～4周。

兩藥相互作用的定義：與兩藥組合中抗菌活性最好的單藥相比，藥物聯合作用使活菌數減少量≥2 log10CFU/ml被認為是協(xié)同作用；1 log10CFU/ml<活菌數減少量<2 log10CFU/ml被認為是相加作用；活菌數減少量≤1 log10CFU/ml被認為是無關作用；活菌數增加量≥2 log10CFU/ml被認為是拮抗作用[9]。

3.MTB菌體內ATP含量測定：采用ATP檢測試劑盒檢測MTB經藥物處理24 h后菌體內的ATP含量變化，具體操作步驟：(1)藥物處理MTB：取培養(yǎng)至對數生長期[吸光度(A)值=0.4]的H37Rv標準株菌液，將菌液加入至50 ml細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶10 ml，設置不同處理組：空白對照組(H37Rv標準株)、TBI-166處理組(0.04、0.4、4 μg/ml)、Bdq處理組(0.03、0.3、3 μg/ml)、兩藥聯用組(0.04 μg/ml TBI-166+0.03 μg/ml Bdq、0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq)，分別處理H37Rv標準株菌液24 h后檢測菌體內ATP含量。(2)ATP檢測：用酶標儀測定波長570 nm下各藥物處理組的A值，于每組中吸取4×107個菌體至1.5 ml高壓過的EP管中，13 570×g離心5 min，棄上清，用無菌1×PBS重懸菌體，離心，棄上清，重復洗滌2次。加入200 μl裂解液，振蕩器振蕩混勻，在冰上溶解ATP檢測工作液，并按1∶9的比例將ATP檢測液加入ATP稀釋液中，避光混勻，將96孔黑板中加入100 μl裂解菌液和100 μl稀釋后的ATP檢測液，酶標儀測定相對光單位(relative light unit，RLU)值。

4.MTB菌體內ROS含量測定：采用細菌ROS檢測試劑盒檢測MTB經藥物處理24 h后菌體內的ROS含量變化，具體操作步驟：(1)藥物處理MTB：取培養(yǎng)至對數生長期(A=0.4)的H37Rv標準株菌液，將菌液加入至50 ml細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶10 ml，設置不同處理組：空白對照組(H37Rv標準株)、TBI-166處理組(0.04、0.4和4 μg/ml)、Bdq處理組(0.03、0.3、3 μg/ml)、兩藥聯用組(0.04 μg/ml TBI-166+0.03 μg/ml Bdq、0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq)分別處理H37Rv標準株24 h后用酶標儀測定熒光值。(2)ROS檢測：按照試劑盒操作步驟進行，事先將探針稀釋液B從-20 ℃冰箱中取出，待其融化后用純水將其10倍稀釋即制得探針稀釋液；用10倍稀釋后的探針稀釋液將探針進行1000倍稀釋即配制成染色工作液。從各處理組中吸取108個菌體并于6000×g離心10 min，棄上清，用無菌1×PBS重懸菌體，離心，棄上清，重復洗滌2次。于每管中加入1 ml染色工作液重懸菌體，并在37 ℃下避光孵育30 min，孵育結束后離心收集菌體，用1×PBS重懸菌體，離心，棄上清。于每管中加入500 μl無菌1×PBS，重懸菌體，充分混勻，吸取200 μl加入到96孔黑板中，將上述96孔黑板置于酶標儀中，測定激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm下各組熒光值。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、棋盤法測定結果

采用MABA法測定TBI-166與抗耐藥結核病新藥對H37Rv菌株及3株MTB臨床分離株的MIC值，結果顯示，所有菌株均對TBI-166、Bdq、Dlm、SQ109、PBTZ169敏感，其MIC值介于0.0004～0.54 μg/ml(表1)。

表1 抗結核藥物對4株結核分枝桿菌菌株的體外最低抑菌濃度 (μg/ml)

棋盤法測定TBI-166與上述藥物組合的相互作用結果見表2。結果顯示，TBI-166與Bdq、PBTZ169、Dlm的兩藥組合對菌株30031的相互作用均為部分協(xié)同或相加作用，FICI值分別為1.00、0.75、0.75；TBI-166與Bdq、SQ109、PBTZ169兩藥組合對菌株30091的相互作用均為部分協(xié)同，FICI值均為0.75；TBI-166與Bdq、Mfx、SQ109、PBTZ169、Dlm的兩藥組合對菌株13385的相互作用為部分協(xié)同或相加作用，FICI值為0.75或1.00。

二、時間殺菌曲線法評估結果

單藥及兩藥組合對MTB臨床分離株30031的時間殺菌曲線圖顯示TBI-166與Bdq、PBTZ169兩藥組合對菌株30031的殺傷具有相加作用，而TBI-166與Dlm兩藥組合顯示無相互作用(圖1)。各藥物單用時對MTB無明顯殺傷作用，當0.08 μg/ml TBI-166分別與0.03 μg/ml Bdq、0.0001 μg/ml PBTZ169 兩藥聯用與MTB孵育14 d后顯示具有部分協(xié)同殺菌活性，與0.08 μg/ml TBI-166相比活菌量分別降低1.59 log10CFU/ml和1.51 log10CFU/ml(圖1a和圖1b)；0.08 μg/ml TBI-166與0.01 μg/ml Dlm聯用與MTB孵育14 d后抗菌活性與0.08 μg/ml TBI-166單獨應用時相比活菌量僅降低0.94 log10CFU/ml(圖1c)，表明兩藥組合無相互作用。

單藥及兩藥組合對MTB臨床分離株30091的時間殺菌曲線圖顯示TBI-166與Bdq、PBTZ169、SQ109的兩藥組合均對菌株30091的殺傷具有相加作用，比單藥作用后抗菌活性增強(圖2)。0.05 μg/ml TBI-166分別與0.03 μg/ml Bdq、0.0002 μg/ml PBTZ169兩藥聯用與MTB孵育14 d后與0.05 μg/ml TBI-166相比活菌量分別降低1.27 log10CFU/ml和1.18 log10CFU/ml(圖2a和圖2b)；而當0.05 μg/mlTBI-166與0.27 μg/ml SQ109聯用與MTB孵育14 d后與0.27 μg/ml SQ109相比活菌量降低1.1 log10CFU/ml(圖2c)，上述結果均表明當Bdq、PBTZ169、SQ109分別與TBI-166組合后能增強TBI-166的抗結核活性。

表2 抗結核藥物組合對3株臨床分離菌株的部分抑菌濃度指數

注 圖a為0.08 μg/ml TBI-166、0.03 μg/ml Bdq單用及兩藥組合時對菌株30031的時間殺菌曲線圖；圖b為0.08 μg/ml TBI-166、0.0001 μg/ml PBTZ169單用及兩藥組合時對菌株30031的時間殺菌曲線圖；圖c為0.08 μg/ml TBI-166、0.01 μg/ml Dlm單用及兩藥組合時對菌株30031的時間殺菌曲線圖。TBI-166：吡法齊明；Bdq：貝達喹啉；Dlm：德拉馬尼；菌株30031：藥物敏感性結核分枝桿菌臨床分離株圖1 單藥及兩藥組合對結核分枝桿菌臨床分離菌株30031的時間殺菌曲線圖

注 圖a為0.05 μg/ml TBI-166、0.03 μg/ml Bdq單用及兩藥組合時對菌株30091的時間殺菌曲線圖；圖b為0.05 μg/ml TBI-166、0.0002 μg/ml PBTZ169單用及兩藥組合時對菌株30091的時間殺菌曲線圖；圖c為0.05 μg/ml TBI-166、0.27 μg/ml SQ109單用及兩藥組合時對菌株30091的時間殺菌曲線圖。TBI-166：吡法齊明；Bdq：貝達喹啉；菌株30091：藥物敏感性結核分枝桿菌臨床分離株圖2 單藥及兩藥組合對結核分枝桿菌臨床分離株30091的時間殺菌曲線圖

注 圖a為0.04 μg/ml TBI-166、0.125 μg/ml SQ109單用及兩藥組合時對菌株13385的時間殺菌曲線圖；圖b為0.04 μg/ml TBI-166、0.0001 μg/ml PBTZ169單用及兩藥組合時對菌株13385的時間殺菌曲線圖；圖c為0.04 μg/ml TBI-166、0.015 μg/ml Bdq單用及兩藥組合時對菌株13385的時間殺菌曲線圖；圖d為0.04 μg/ml TBI-166、0.005 μg/ml Dlm單用及兩藥組合時對菌株13385的時間殺菌曲線圖；圖e為0.04 μg/ml TBI-166、0.625 μg/ml Mfx單用及兩藥組合時對菌株13385的時間殺菌曲線圖。TBI-166：吡法齊明；Bdq：貝達喹啉；Dlm：德拉馬尼；Mfx：莫西沙星。菌株13385：前廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株圖3 單藥及兩藥組合對結核分枝桿菌臨床分離株13385的時間殺菌曲線圖

單藥及兩藥組合對MTB臨床分離株13385的時間殺菌曲線圖顯示TBI-166與SQ109、PBTZ169的兩藥組合對菌株13385的殺傷具有協(xié)同作用，比單藥作用后抗菌活性明顯增強(圖3)。0.04 μg/ml TBI-166分別與0.125 μg/ml SQ109、0.0001 μg/ml PBTZ169兩藥聯用與MTB孵育14 d后分別與兩藥組中活性較好的單藥(0.125 μg/ml SQ109和0.04 μg/ml TBI-166)相比活菌量降低3.58 log10CFU/ml和2.82 log10CFU/ml(圖3a和圖3b)；TBI-166與Bdq、Dlm、Mfx的兩藥組合對菌株13385的殺傷具有相加作用，當0.04 μg/ml TBI-166與0.015 μg/ml Bdq、0.005 μg/ml Dlm、0.625 μg/ml Mfx聯用與MTB孵育14 d后與0.04 μg/ml TBI-166相比活菌量分別降低1.70 log10CFU/ml、1.84 log10CFU/ml、1.90 log10CFU/ml(圖3c至圖3e)，上述結果均表明當SQ109、PBTZ169、Bdq、Dlm、Mfx分別與TBI-166組合后能增強TBI-166的抗結核活性。

三、MTB菌體內ATP含量測定

采用不同濃度的TBI-166與Bdq刺激H37Rv標準株24 h后，空白對照組、0.04 μg/ml TBI-166組、0.4 μg/ml TBI-166組、4 μg/ml TBI-166組、0.03 μg/ml Bdq組、0.3 μg/ml Bdq組、3 μg/ml Bdq組、0.04 μg/ml TBI-166+0.03 μg/ml Bdq組、0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq組菌體內RLU值分別為756 971.20±69 110.53、557 022.17±112 487.20、498 944.17±56 804.81、446 099.40±28 559.58、450 618.67±85 299.64、208 599.20±24 078.74、47 879.40±6562.80、359 801.40±40 648.56、115 160.67±19 129.79，各給藥組菌體內ATP含量呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(F=75.109，P<0.001)。其中，0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq組菌體內的RLU值明顯低于0.3 μg/ml Bdq單藥組，菌體內ATP含量下降最明顯。

四、MTB菌體內ROS含量測定

采用不同濃度的TBI-166與Bdq刺激H37Rv標準株24 h后，空白對照組、0.04 μg/ml TBI-166組、0.4 μg/ml TBI-166組、4 μg/ml TBI-166組、0.03 μg/ml Bdq組、0.3 μg/ml Bdq組、3 μg/ml Bdq組、0.04 μg/ml TBI-166+0.03 μg/ml Bdq組、0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq組菌體內ROS熒光值分別為10 229.75±522.38、11 311.50±357.59、12 319.25±212.97、16 471.60±252.49、11 683.00±505.73、13 715.00±907.93、12 995.50±769.50、15 765.67±337.96、21 014.33±1189.19，各給藥組菌體內ROS熒光值明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=115.403，P<0.001)，即在TBI-166、Bdq的刺激下將誘導菌株ROS的產生。兩藥組合組菌體內ROS含量與單藥組相比進一步增長，其中，0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq組ROS含量上升最明顯，明顯高于0.3 μg/ml Bdq組。

討 論

結核病的治療需要組合用藥，現有的藥物方案尚無法滿足結核病的治療需求，因此，迫切需要開發(fā)新的藥物及藥物方案縮短結核病的治療療程。亞胺吩嗪類藥物具有較強的抗結核活性，其中，氯法齊明具有廣泛的抗結核作用，但由于其會引起皮膚紅染等不良反應，使用受限。經過廣泛的藥物化學篩選最終發(fā)現了TBI-166[1]。TBI-166作為我國抗耐藥結核病新藥，已完成臨床單藥的安全性及有效性評估。由于單藥治療往往會導致MTB耐藥性的出現，因此，對TBI-166與現有抗結核藥物的組合研究是非常必要的。既往對TBI-166與一線及二線抗結核藥物組合的抗結核活性研究中發(fā)現INH和RFP對TBI-166的抗結核活性無明顯作用，而Bdq、吡嗪酰胺的加入卻明顯增強了TBI-166的抗結核活性[10]。隨著對抗結核藥物的廣泛研究，目前出現了幾種有效且具有新作用機制的抗結核新藥，如質子解偶聯劑SQ109、DprE1酶抑制劑PBTZ169、分枝菌酸合成抑制劑Dlm等，對這些新藥的研究有望縮短結核病療程。鑒于TBI-166將與抗耐藥結核病核心藥物及有潛力的新藥組成新方案用于耐藥結核病的治療，筆者所在課題組前期評估了TBI-166與抗耐藥結核病A組藥物(Bdq和Mfx)及新型抗結核藥物(Dlm、SQ109、PBTZ169)的兩藥組合對MTB標準株H37Rv的抗結核活性，發(fā)現Bdq、SQ109、PBTZ169與TBI-166的兩藥組合具有協(xié)同殺菌活性(數據未展示)，但由于菌株比較單一，因此，本研究進一步評估TBI-166與抗結核藥物(Bdq、Mfx、Dlm、SQ109、PBTZ169)的兩藥組合對3株臨床分離株的體外抗結核活性。

體外聯合藥物敏感性試驗顯示，TBI-166與Bdq、PBTZ169對臨床藥物敏感及耐藥菌株均表現出部分協(xié)同或相加作用，并且Bdq、PBTZ169的加入使TBI-166的MIC降低至其MIC的1/4～1/2。同時，筆者采用了時間殺菌曲線對TBI-166的協(xié)同藥物組合進行了14 d的殺菌實驗研究，結果顯示，0.08 μg/ml TBI-166分別與0.03 μg/ml Bdq、0.0001 μg/ml PBTZ169兩藥聯用與藥物敏感菌株30031孵育14 d后，兩藥聯用組的活菌量與兩藥組中活性較好的單藥(0.08 μg/ml TBI-166)相比分別降低1.59 log10CFU/ml和1.51 log10CFU/ml；0.05 μg/ml TBI-166分別與0.03 μg/ml Bdq、0.0002 μg/ml PBTZ169兩藥聯用與藥物敏感菌株30091孵育14 d后，與0.05 μg/ml TBI-166組相比活菌量分別降低1.27 log10CFU/ml和1.18 log10CFU/ml；而在菌株13385中，筆者發(fā)現TBI-166與PBTZ169的兩藥組合具有協(xié)同殺菌活性，與Bdq的兩藥組合具有相加作用。當0.04 μg/ml TBI-166與0.0001 μg/ml PBTZ169聯用14 d后，活菌量與0.04 μg/ml TBI-166組相比降低2.82 log10CFU/ml。然而，在聯合藥物敏感性試驗中，筆者發(fā)現TBI-166與Dlm的兩藥組合對敏感株30031表現出部分協(xié)同抗菌活性，但時間殺菌實驗顯示0.08 μg/ml TBI-166與0.01 μg/ml Dlm兩藥聯用與藥物敏感菌株30031孵育14 d后，兩藥聯合組的活菌量與TBI-166組相比僅降低0.94 log10CFU/ml，提示TBI-166與Dlm的兩藥組合無相互作用。

同時，對體內外篩選出的協(xié)同藥物組合作用機制的探討將有利于基于靶標的新藥發(fā)現。前期研究發(fā)現，TBI-166與Bdq具有較強的協(xié)同殺菌活性。藥物產生協(xié)同作用可能是基于增加單藥療效和降低MTB耐藥性的產生等。本研究中，筆者測定不同濃度的TBI-166與Bdq單用及兩藥組合作用于H37Rv標準株24 h后ATP及ROS含量的變化，結果顯示，TBI-166與Bdq均能誘導菌體內ROS的產生并且降低ATP水平，與既往研究認為TBI-166可能通過累積ROS[3]、降低ATP水平而發(fā)揮抗菌活性，Bdq可抑制F0F1ATP合成酶阻止ATP合成發(fā)揮殺菌活性一致[11]。筆者進一步評估了TBI-166與Bdq兩藥組合后對菌體內ATP及ROS的影響，結果顯示，當TBI-166與Bdq兩藥聯用后，ATP水平與單藥組相比進一步降低，而ROS含量進一步升高。本課題組前期研究發(fā)現，TBI-166可在Ⅱ型NADH醌氧化還原酶(Type-Ⅱ NADH-quinone oxidoreductase，NDH-2)的作用下被NADH還原為活性形式，之后與O2自發(fā)反應產生ROS[4]。既往在對Bdq處理恥垢分枝桿菌后的蛋白質組學研究中發(fā)現NDH-2表達上調[12]，在Bdq處理MTB后的蛋白質組學研究中發(fā)現NADPH表達下調[13]?；诖?，筆者推測Bdq與TBI-166聯用后，菌體內有更多的NADPH在NDH-2的作用下被還原，電子釋放增多，進而導致TBI-166的還原當量增加、ROS的產生增加。由于TBI-166增強醌氧化還原酶介導的氧化還原反應使NADPH/NADP+比值下降，導致NAD+還原當量減少，下游呼吸鏈電子傳遞受阻，同時TBI-166與Bdq的刺激使丙酮酸的氧化及三羧酸循環(huán)受阻，最終導致菌體內的ATP合成大大減少。

本研究存在以下不足：(1)體外協(xié)同作用研究選取的臨床菌株數較少，后期研究還需加大樣本量進一步驗證；(2)協(xié)同作用僅是體外實驗的發(fā)現，還需要體內模型及人體試驗的驗證；(3)作用機制研究僅針對MTB標準菌株且尚需深入研究。

綜上，本研究通過體外棋盤法及時間殺菌實驗評估了TBI-166與抗結核新藥對3株MTB臨床分離株的抗結核活性，發(fā)現TBI-166與Bdq、PBTZ169的兩藥組合對MTB敏感株及耐藥株均具有協(xié)同殺菌活性；并且推測TBI-166與Bdq可能是通過作用于MTB呼吸鏈，進一步累積ROS、降低ATP水平來發(fā)揮協(xié)同殺菌作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻劉海婷：直接參與(包括：實施研究、采集數據、分析/解釋數據)、文章撰寫(起草文章)；李東碩、張蕾：直接參與(實施研究)；王寧：直接參與(分析/解釋數據)；王彬、丁楊明、姚蓉：工作支持(支持性貢獻)；陸宇：工作支持(獲取研究經費、行政/技術/材料支持、指導、支持性貢獻)