任新宇，羅 晟，魏宏宇，程 新

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

農(nóng)田土壤重金屬污染關(guān)系到農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康。其中，鎘（Cd）是對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害最大的重金屬元素之一[1]。環(huán)境中過量的Cd 不僅會(huì)對(duì)農(nóng)作物生長造成嚴(yán)重傷害，大大降低產(chǎn)量和品質(zhì)[2]，同時(shí)食物中的Cd 會(huì)進(jìn)入人體并在體內(nèi)逐漸累積且不會(huì)排出體外，最終對(duì)人體健康產(chǎn)生非常嚴(yán)重的負(fù)面影響[3]。水稻是我國主要的糧食作物，Cd 和鉛（Pb）是稻米中最主要的健康風(fēng)險(xiǎn)因子[4‐5]。因此，降低稻田土壤重金屬尤其是Cd 污染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

土壤中重金屬的有效性受土壤性質(zhì)極顯著影響[6]。其中，土壤pH 值是影響重金屬生物有效性的重要因素。酸性土壤環(huán)境不僅會(huì)造成土壤質(zhì)量和肥力下降，影響作物的生長[7]，同時(shí)還會(huì)引起重金屬離子的活化，提高重金屬的生物有效性，進(jìn)而造成植物的大量吸收[8‐9]，導(dǎo)致中輕度重金屬污染農(nóng)田農(nóng)產(chǎn)品中Cd、Pb積累[10]。我國南方主要農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)為典型的酸性紅壤區(qū)域，大部分土壤的pH值低于5.5，有些低于5.0 甚至更低，且土壤pH 值有逐年下降的趨勢(shì)[11‐12]。水稻是我國主要的糧食作物，保障及提高水稻產(chǎn)量對(duì)我國糧食安全具有重要意義。目前，關(guān)于酸性環(huán)境、重金屬對(duì)水稻生長發(fā)育的影響研究主要集中于酸性環(huán)境或重金屬單一脅迫方面[13‐18]，關(guān)于兩者的復(fù)合脅迫研究較少[19‐21]，僅ALI等[19]研究了pH 值對(duì)水稻幼苗Cd 積累的影響，陳利等[20]研究了根際pH值與Cd共同脅迫對(duì)超高產(chǎn)雜交稻幼苗光合特性的影響，蘇國立等[21]研究了不同pH值條件下Cd 含量對(duì)水稻種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，但其pH 值設(shè)置偏堿性。尚未見關(guān)于酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗生長影響的系統(tǒng)研究。為此，參考國家二類土壤標(biāo)準(zhǔn)（GB 15618—2018，土壤pH 值小于7.5 時(shí)Cd 含量是0.6 mg/kg）添加Cd（CdCl2·2.5 H2O）至質(zhì)量濃度分別為0、0.3、0.6 mg/L，研究酸性環(huán)境（pH 值分別為5.0、6.0、6.8）對(duì)Cd 脅迫下水稻幼苗生長發(fā)育的影響，以期明確酸性環(huán)境與Cd脅迫的互作效應(yīng)，并為農(nóng)作物的安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種為五優(yōu)308，由廣東省金稻種業(yè)有限公司提供。選取大且飽滿的水稻籽粒，用5%NaClO 浸泡消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗5～7 次，于28 ℃蒸餾水中浸泡24 h，瀝干水備用[22]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將消毒好的水稻種子均勻撒在放置有濕潤紗布的白瓷盤中，28 ℃恒溫暗光催芽48 h，保持紗布濕潤。將長勢(shì)一致的水稻幼苗轉(zhuǎn)移至霍格蘭（Hoagland）[23]營養(yǎng)液進(jìn)行水培，每3 d 更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)水稻幼苗生長至兩葉一心（10 d 左右）時(shí)，調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH 值分別為5.0、6.0、6.8（CK），并參考國家二類土壤標(biāo)準(zhǔn)（GB 15618—2018，土壤pH 值小于7.5 時(shí)Cd 含量是0.6 mg/kg）添加Cd（CdCl2·2.5 H2O）至質(zhì)量濃度分別0、0.3、0.6 mg/L。水稻生長30 d 時(shí)取樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 幼苗形態(tài)指標(biāo) 水稻生長30 d 時(shí)，隨機(jī)取樣，測(cè)定株高、葉長[24]，并使用Winrhizo 根系掃描儀測(cè)定根系的總長、表面積、平均直徑、總體積、根尖數(shù)[25]。

1.3.2 可溶性糖和可溶性蛋白含量 水稻生長30 d 時(shí)，取葉片，采用硫酸-蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量[26]，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量[27]。

1.3.3 光合色素含量 水稻生長30 d 時(shí)，取葉片，研磨成勻漿，以95%乙醇為對(duì)照，分別在波長665、649、470 nm 下測(cè)定吸光度，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量[28]。

1.3.4 根系細(xì)胞損傷 水稻生長30 d 時(shí)，取根系，根系細(xì)胞活性的測(cè)定采用伊文思藍(lán)（Evans blue）染色法，在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察[24]?；钚匝醯臋z測(cè)采用熒光染色法，用熒光顯微鏡觀察并拍照記錄[29]。

1.3.5 過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性、脯氨酸及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量 水稻生長30 d 時(shí)，取根系，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD 活性[30]，采用磺基水楊酸法測(cè)定脯氨酸含量[31]，采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定MDA含量[32]。

1.3.6 根系傅里葉變換紅外光譜分析 水稻生長30 d 時(shí)，取根系于烘箱中105 ℃殺青30 min，再于75 ℃干燥48 h，粉碎后過篩，將樣品與KBr（光譜純）混合，采用美國PE Spectrum Two 傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行特定吸收峰與官能團(tuán)分析，設(shè)置波數(shù)為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1[33‐34]。

1.3.7 Cd 含量 水稻生長30 d 時(shí)，取葉片和根系，烘干，采用68%硝酸與30%過氧化氫對(duì)其進(jìn)行消化[35]，然后使用原子吸收分光光度計(jì)（SP-3530AA，Shanghai Spectrum Instruments Co，Ltd，China）測(cè)定樣品Cd含量[36]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 7.05 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗地上部生長發(fā)育的影響

2.1.1 株高、葉長 由表1 可以看出，Cd 抑制水稻幼苗生長發(fā)育，且隨著Cd 質(zhì)量濃度增加，這種抑制作用增加。在0.3 mg/L Cd 脅迫下，水稻幼苗的株高、葉長分別較無Cd 脅迫處理降低了25.3%、25.9%；在0.6 mg/L Cd 脅迫下，水稻幼苗的株高、葉長分別較無Cd 脅迫處理降低了32.8%、17.7%。pH值對(duì)水稻幼苗生長及Cd 的抑制效應(yīng)有影響，同一Cd 質(zhì)量濃度下，水稻幼苗在pH 值6.0 時(shí)長勢(shì)最好，株高最高；總體上以pH 值5.0 時(shí)長勢(shì)最差，株高和葉長均最低。總體來看，Cd對(duì)水稻幼苗地上部的生長有明顯的抑制效應(yīng)，弱酸環(huán)境（pH 值6.0）可以緩解這種抑制作用，但是當(dāng)pH 值下降至5.0 時(shí)，酸性環(huán)境對(duì)Cd 脅迫下水稻幼苗葉長的毒害效應(yīng)明顯增強(qiáng)。

表1 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗株高和葉長的影響Tab.1 Effects of acid environment on plant height and leaf length of rice seedlings under Cd stress

2.1.2 葉片中可溶性糖和可溶性蛋白含量 從圖1可以看出，在Cd 質(zhì)量濃度為0～0.3 mg/L 時(shí)，水稻葉片中可溶性蛋白含量均以pH 值6.0時(shí)最高，但當(dāng)Cd質(zhì)量濃度提高至0.6 mg/L 時(shí)，可溶性蛋白含量隨pH值的降低而逐漸升高，以pH值5.0時(shí)最高。在Cd質(zhì)量濃度為0～0.6 mg/L 時(shí)，在同一Cd 質(zhì)量濃度下，水稻葉片中可溶性糖含量均隨pH 值的降低逐漸升高，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，可溶性糖含量最高。

圖1 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗葉片中可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effects of acid environment on soluble sugar and protein contents in leaf of rice seedling under Cd stress

2.1.3 葉片中光合色素含量 由表2 可以看出，Cd對(duì)水稻幼苗葉片中光合色素含量的影響在不同pH值條件下不同。當(dāng)pH 值高于5.0 時(shí)，水稻幼苗葉片葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量總體上均隨Cd 質(zhì)量濃度增加而下降；當(dāng)pH 值為5.0 時(shí)，水稻幼苗葉片葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量均隨Cd 質(zhì)量濃度增加而增加。在同一Cd 質(zhì)量濃度下，總體上pH 值對(duì)水稻幼苗葉片類胡蘿卜素和葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量均有顯著的影響。總體來看，當(dāng)pH 值為6.0 時(shí)，水稻幼苗葉片類胡蘿卜素和葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量最高；當(dāng)pH 值為5.0時(shí)，水稻幼苗葉片類胡蘿卜素和葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量最低。

表2 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗葉片中光合色素含量的影響Tab.2 Effects of acid environment on photosynthetic pigment content in leaf of rice seedling under Cd stress mg/g

2.2 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗根系生長發(fā)育的影響

2.2.1 根系形態(tài) 當(dāng)Cd 質(zhì)量濃度≤0.3 mg/L 時(shí)，水稻幼苗根系的總長、表面積、直徑、總體積、根尖數(shù)總體上在pH 值6.0 時(shí)最高，在pH 值5.0 時(shí)最低；當(dāng)Cd 質(zhì)量濃度提高至0.6 mg/L 時(shí)，上述根系指標(biāo)均隨著pH值降低而略有增加（表3）。

表3 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗根系形態(tài)的影響Tab.3 Effects of acid environment on root morphology of rice seedlings under Cd stress

2.2.2 根系細(xì)胞損傷 伊文斯藍(lán)染色試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于鑒定細(xì)胞活性，染色程度與細(xì)胞質(zhì)膜損傷程度呈正相關(guān)。從圖2A 可以看出，在Cd（0～0.3 mg/L）脅迫條件下，水稻幼苗根系的染色程度隨著pH 值的降低變化不明顯，說明隨著pH 值的降低水稻幼苗根系細(xì)胞質(zhì)膜損傷無明顯變化；當(dāng)Cd質(zhì)量濃度提高至0.6 mg/L 時(shí)，水稻幼苗根系的染色程度隨著pH值的降低而增強(qiáng)，說明隨著pH 值的降低水稻幼苗根系細(xì)胞質(zhì)膜損傷程度增加。熒光染色試驗(yàn)結(jié)果（圖2B）表明，無Cd 條件下，水稻幼苗根系熒光亮度隨著pH 值的降低而減弱，說明水稻幼苗根系活性氧含量隨著pH值的降低而降低；在0.3～0.6 mg/L Cd脅迫條件下，水稻幼苗根系熒光亮度隨著pH 值的降低而增強(qiáng)，說明水稻幼苗根系活性氧含量隨著pH值的降低而增加。綜上，在Cd 脅迫條件下，酸性環(huán)境會(huì)增加水稻幼苗根系細(xì)胞受損傷程度。

圖2 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗根系細(xì)胞損傷的影響Fig.2 Effects of acid environment on cell damage in root of rice seedlings under Cd stress

2.2.3 根系POD 活性、脯氨酸及MDA 含量 由圖3可以看出，當(dāng)pH 值高于5.0 時(shí)，POD 活性和脯氨酸含量隨著Cd 質(zhì)量濃度的增加而增加，MDA 含量隨著Cd質(zhì)量濃度的增加先增加后降低；當(dāng)pH 值為5.0時(shí)，POD 活性隨著Cd 質(zhì)量濃度的增加先增加后降低，脯氨酸含量隨著Cd質(zhì)量濃度的增加先降低后增加，MDA 含量隨著Cd 質(zhì)量濃度的增加而降低。在0～0.6 mg/L Cd 脅迫條件下，水稻根系POD 活性及MDA 含量總體均隨著pH 值的降低而升高。脯氨酸含量在同一Cd質(zhì)量濃度下隨著pH值的降低先降低后升高。綜上，在一定質(zhì)量濃度的Cd 脅迫條件下，酸性環(huán)境會(huì)加劇Cd對(duì)水稻的傷害。

圖3 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗根系POD活性、脯氨酸及MDA含量的影響Fig.3 Effects of acid environment on POD activity，proline and MDA contents in root of rice seedlings under Cd stress

2.2.4 根系傅里葉紅外變換光譜分析 由圖4 可知，在0.6 mg/L Cd 脅迫條件下，不同pH 值下各特征峰沒有出現(xiàn)位移，也無新特征峰出現(xiàn)，特征峰強(qiáng)度也無明顯變化；在0～0.3 mg/L Cd 脅迫條件下，1 036～1 065 cm-1、1 638～1 660 cm-1、2 880～2 930 cm-1和3 325～3 430 cm-1等處的特征峰強(qiáng)度隨pH 值的變化產(chǎn)生了明顯的變化。由此可知，pH 值對(duì)0.3 mg/L Cd脅迫條件下水稻根系中脂類和羧酸鹽、多肽和蛋白質(zhì)、碳水化合物含量均產(chǎn)生了明顯的影響。

圖4 水稻幼苗根系紅外吸收?qǐng)D譜Fig.4 Infrared absorption spectrum of rice seedling root

2.3 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻葉片和根系Cd含量的影響

由圖5 可以看出，Cd 脅迫對(duì)水稻幼苗葉片和根系Cd 含量有顯著的影響，水稻幼苗葉片和根系Cd含量總體上均隨著外源Cd質(zhì)量濃度的增加而增加，而且根系Cd含量明顯高于葉片。根系Cd含量均隨pH 值的降低先降低后升高。在外源Cd質(zhì)量濃度為0、0.6 mg/L Cd 時(shí)，葉片Cd 含量總體上均隨著pH 值的降低而增加，說明酸性環(huán)境會(huì)促進(jìn)Cd 的吸收；在外源Cd 質(zhì)量濃度為0.3 mg/L 時(shí)，葉片Cd 含量隨著pH 值的降低而降低。綜上，在一定質(zhì)量濃度Cd 脅迫下，酸性環(huán)境會(huì)促進(jìn)水稻體內(nèi)Cd的吸收。

圖5 酸性環(huán)境對(duì)Cd脅迫下水稻葉片和根系Cd含量的影響Fig.5 Effects of acid environment on Cd content in rice leaves and roots under Cd stress

3 結(jié)論與討論

酸被認(rèn)為是對(duì)重金屬吸收有重要影響的因素之一。生長環(huán)境的過分酸化不僅影響植物的生長和生理代謝，同時(shí)會(huì)活化土壤中的金屬元素，從而影響其吸收和在植物體內(nèi)的積累[37]。ALI 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，水稻幼苗Cd的攝取很大程度上取決于培養(yǎng)基的pH 值，且在pH 值6.0 條件下根向地上部的Cd 轉(zhuǎn)移量最高；而RAHMAN 等[38]研究結(jié)果表明，在低Cd濃度條件下，酸性環(huán)境可以顯著促進(jìn)小麥根的生長，減緩Cd 的毒害效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫抑制水稻幼苗的生長，而一定程度的弱酸性環(huán)境有利于Cd脅迫條件下水稻幼苗的生長，在pH 值6.0時(shí)生長最好，這一點(diǎn)可能與水稻屬于微嗜酸性的農(nóng)作物有關(guān)。但當(dāng)pH值下降至5.0時(shí)，水稻幼苗生長受Cd脅迫的毒害效應(yīng)增強(qiáng)。

根系是植物與外界環(huán)境接觸的第一道防線，是脅迫條件下變化最明顯的部位，酸及重金屬脅迫均會(huì)對(duì)植物根系的發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響[39]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)Cd 質(zhì)量濃度≤0.3 mg/L 時(shí)，水稻幼苗的根系發(fā)育在pH 值6.0 時(shí)最好，而在pH 值5.0 時(shí)發(fā)育最差，根系的總長、表面積、直徑、總體積、根尖數(shù)總體均最低，水稻根系MDA 含量總體上隨著pH 值的降低而增加。同時(shí)伊文斯藍(lán)染色等試驗(yàn)的結(jié)果也表明，在Cd 質(zhì)量濃度為0.6 mg/L 時(shí)，水稻幼苗根系的損傷程度隨著pH值的降低而增強(qiáng)。

綜上，酸性環(huán)境加劇了Cd對(duì)水稻幼苗的毒害效應(yīng)，這與前人[19，40‐41]研究結(jié)果基本一致。我國南方紅壤地區(qū)的土壤pH 值近年來有逐漸下降的趨勢(shì)，且很多地方土壤pH 值低于5.0。因此，如何降低酸性環(huán)境對(duì)Cd 脅迫條件下水稻等農(nóng)作物的毒害效應(yīng)將是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)要面臨的重要挑戰(zhàn)。