周菲

（1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，150086，黑龍江哈爾濱；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，150086，黑龍江哈爾濱）

向日葵（Helianthus annuus L.）是世界上重要的油料作物之一。植物油的脂肪酸組成決定了它們的品質(zhì)和用途，從營養(yǎng)價值和工業(yè)應(yīng)用的角度來看，有必要降低植物油中飽和脂肪酸含量。高油酸是一種單不飽和脂肪酸，由于含高油酸的食用油在烹飪、加工或儲存時具有更高的抗氧化穩(wěn)定性，因此，提高種子中油酸所占比例也是向日葵品質(zhì)改良的重要目標。LACS編碼長鏈?；鵆oA合成酶，在高等植物中，LACS參與了多種代謝途徑且被定位在多種細胞器中，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[1]、葉綠體[2]和過氧化物酶體[1]。LACS能把游離脂肪酸轉(zhuǎn)化成長鏈酰基CoA，在脂肪酸合成、分解及其他相關(guān)代謝過程中發(fā)揮重要功能[3]。油菜BnLACS2基因的過表達導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因油菜中的油含量明顯增加，而BnLACS2-RNAi轉(zhuǎn)基因油菜的油含量降低[4]。在向日葵中，LACS1和LACS2蛋白分別在質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達，參與種子發(fā)育過程中油脂的合成[5]。

本研究通過分析實驗室前期獲得的高、低油酸向日葵種子的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，在脂肪酸生物合成代謝通路中鑒定出顯著差異表達的HaLACS7基因，以此為基礎(chǔ)，對該基因編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析，并對HaLACS7在高、低油酸向日葵不同發(fā)育時期的種子以及其他組織部位的表達模式進行分析，為后續(xù)該基因功能的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年將向日葵高油酸保持系“L-1-OL-1”和低油酸保持系“86-1”種植在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所試驗基地（哈爾濱呼蘭區(qū)康金鎮(zhèn)）。從開花7d起，每5d取1次樣，取至開花后37d，每次取花盤最外3圈的種子，同時取開花后7d的向日葵根、莖、葉、管狀花和舌狀花，將材料經(jīng)液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于實時熒光定量PCR分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因的生物信息學(xué)分析 在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性比對和相似性搜索。利用ExPASy系統(tǒng)下的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測工具 Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測氨基酸組成、相對分子量、等電點和原子組成等參數(shù)。利用SOPMA在線程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.ht ml）分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用ProtScale在線軟件（http://web.expasy.org/protscale/）分析基因氨基酸序列的親/疏水性。利用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預(yù)測基因的亞細胞定位。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 熒光定量PCR分析 利用植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]對向日葵種子總RNA進行提取，取0.5μg RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）合成cDNA第1條鏈。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）試劑，Roche LightCycler 480II熒光定量PCR儀，以向日葵β-actin基因（AF282624）為內(nèi)參基因，Real-Time PCR 總反應(yīng)體系為 20μL（cDNA 1.2μL，SYBR Green 10μL，前、后引物各 0.6μL，ddH2O 7.6μL）。Real-Time PCR 反應(yīng)程序如下：98℃ 2min；98℃10s，58℃10s，68℃30s，共45個循環(huán)，待PCR反應(yīng)結(jié)束后進行溶解曲線分析，采用2-ΔΔCt法分析HaLACS7基因的表達量。內(nèi)參基因β-actin引物為 F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCA GCTTCCATTCCAATCA。HaLACS7基因熒光定量引物為F：TGCTTTGGTTGTCCTGT，R：CGAGG TGACATCGTTGA。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaLACS7生物信息學(xué)分析

2.1.1 蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測HaLACS7基因包含948bp的開放閱讀框，編碼315個氨基酸。蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測表明，HaLACS7基因編碼蛋白的原子總數(shù)為4990個，分子式為C1611H2477N421O464S17，蛋白分子量35.71kD，等電點理論值5.82，預(yù)測該蛋白是酸性蛋白，HaLACS7編碼蛋白氨基酸組成見表1。

表1 向日葵HaLACS7編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of protein encoded by HaLACS7 in sunflower

2.1.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 預(yù)測分析HaLACS7編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)具有24.76%的α-螺旋、45.08%的無規(guī)則卷曲、23.81%的延伸鏈和6.35%的β-轉(zhuǎn)角。預(yù)測結(jié)果（圖1）表明，HaFATB編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲。

圖1 向日葵HaLACS7編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Secondary structure prediction of protein encoded by HaLACS7 in sunflower

2.1.3 蛋白質(zhì)親疏水性分析和亞細胞定位預(yù)測 由圖2可知，大于0部分多于50%為疏水性蛋白，而小于0部分多于50%為親水性蛋白，HaLACS7編碼蛋白為親水性蛋白。Cell-PLoc 2.0軟件預(yù)測HaLACS7編碼蛋白亞細胞定位于過氧化物酶體。

圖2 向日葵HaLACS7編碼蛋白質(zhì)親/疏水性分析Fig.2 Hydrophilic/hydrophobic analysis of protein encoded by HaLACS7 in sunflower

2.1.4 HaLACS7基因系統(tǒng)進化分析 將向日葵HaLACS7與大豆（Glycine max L.）、甘藍型油菜（Brassica napus L.）和蓖麻（Ricinus communis L.）等物種的LACS基因以及擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）LACS家族9個基因的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建與分析（圖3），發(fā)現(xiàn)向日葵HaLACS7與其他物種的LACS7和LACS6基因進化關(guān)系較近，且與同屬菊科的萵苣（Lactuca sativa L.）和洋薊（Cynara cardunculus var.scolymus L.）的LACS6進化關(guān)系最近，序列相似性均為84%，向日葵HaLACS7與擬南芥LACS6和LACS7聚在一個大分支上，而擬南芥LACS家族其他7個基因聚在另一個大分支上。

圖3 向日葵HaLACS7基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of HaLACS7 gene in sunflower

2.2 HaLACS7基因表達分析

由圖4可知，HaLACS7在高、低油酸向日葵種子不同發(fā)育時期表達量變化趨勢明顯不同，在“86-1”種子花后27d表達量最高，其次是花后37d，在花后22d不表達，其他時期表達量較低?！癓-1-OL-1”種子在花后37d表達量最高，其次是花后22和32d，在花后7d表達量較低，其他時期不表達（圖4）?？傮w來說，HaLACS7在2份材料種子發(fā)育后期表達量均較高。HaLACS7在向日葵開花后7d時組織中的表達量排序為舌狀花＞根＞種子＞管狀花＞葉＞莖。

圖4 HaLACS7基因在不同發(fā)育時期及不同部位表達模式Fig.4 The expression patterns of HaLACS7 gene at different development stages and different parts

3 討論

擬南芥中發(fā)現(xiàn)的LACS基因家族共有9個成員，命名為AtLACS1-9[6]，其中AtLACS6和AtLACS7存在于過氧化物酶體中，能夠參與擬南芥脂肪儲備中脂肪酸的降解[7]，并與脂肪酸β-氧化途徑有關(guān)[1]。本研究通過對向日葵HaLACS7與其他物種LACS基因系統(tǒng)進化的分析，發(fā)現(xiàn)向日葵HaLACS7與擬南芥AtLACS6和AtLACS7聚在一個大分支上，亞細胞定位預(yù)測HaLACS7編碼蛋白定位于過氧化物酶體，這也與AtLACS6和AtLACS7亞細胞定位結(jié)果一致，這表明HaLACS7與擬南芥AtLACS6和AtLACS7功能上可能存在一定的相似之處，可能在脂肪酸β-氧化等代謝的過程中起關(guān)鍵作用，這些生理過程可為向日葵種子發(fā)育油脂積累提供必要的能量和碳源[8]，本研究可為向日葵HaLACS7基因功能的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

擬南芥LACS基因表達分析顯示，除AtLACS5在花中特異表達之外，其他成員在各組織中普遍轉(zhuǎn)錄，但具有明顯的器官或組織特異性，且大部分AtLACS基因在花以及萌發(fā)的種子中大量表達，表明這些基因不僅參與花組織的油脂代謝，而且對種子甘油酯的合成起到關(guān)鍵作用[9]。與擬南芥AtLACS7同源性較高的油茶CoLACS1基因在種子發(fā)育各時期平穩(wěn)表達，表達豐度變化不大[10]。LACS6在花生子房柄和花的表達量極高，與根、莖、葉和仁等組織有極顯著差異，其表達量為花＞子房柄＞葉＞仁＞莖＞根[11]。本研究中HaLACS7在向日葵舌狀花中相對表達量非常高，這與花生LACS6和擬南芥LACS基因表達結(jié)果一致，在2份高、低油酸向日葵材料種子發(fā)育后期表達量均較高，可能主要在于彌補呼吸作用等引起的能量消耗以及維持種仁油脂含量動態(tài)平衡[12]。

目前，關(guān)于植物L(fēng)ACS基因影響脂肪酸組成研究的報道較少。在亞麻中通過體內(nèi)、體外試驗[13]發(fā)現(xiàn)，LuLACS8A和LuDGAT2-3共表達能催化亞麻酸（18:0）在三酰甘油中富集。分別與擬南芥LACS9和LACS8基因序列同源的向日葵HaLACS1和HaLACS2在發(fā)育中的種子中表達水平較高，2種酶表現(xiàn)出相似的底物特異性，均對油酸的選擇性很高[5]。本研究中HaLACS7在低油酸材料種子發(fā)育前期，隨著種子油脂積累，HaLACS7表達逐漸上調(diào)，在發(fā)育后期表達量較高；而在高油酸材料中除了在種子發(fā)育中期和后期表達量較高，其他時期基本不表達，HaLACS7在高、低油酸向日葵種子不同發(fā)育階段表達變化趨勢明顯不同，推測HaLACS7表達可能影響向日葵種子油酸的合成，由于植物油脂的合成涉及多層次的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，基因具體功能仍需后續(xù)進一步研究。

4 結(jié)論

預(yù)測向日葵HaLACS7編碼蛋白為酸性且為親水性蛋白，蛋白二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲，預(yù)測亞細胞定位于過氧化物酶體。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，HaLACS7與萵苣和洋薊的LACS6進化關(guān)系最近，序列相似性均為84%，且與擬南芥LACS6和LACS7聚在一個大分支上，表明它們功能可能相似。HaLACS7在向日葵組織中的表達量為舌狀花＞根＞種子＞管狀花＞葉＞莖，HaLACS7在高、低油酸向日葵種子發(fā)育后期表達量均較高，但在2份材料種子不同發(fā)育時期表達變化趨勢明顯不同，推測HaLACS7表達可能影響向日葵種子油酸的合成。