秦 娜 朱燦燦 代書桃 宋迎輝 李君霞 王春義

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，450002，河南鄭州）

葉片是作物進(jìn)行光合作用的主要器官，葉色與葉綠素含量、光合作用強(qiáng)度及作物產(chǎn)量密切相關(guān)[1-4]，谷子因其基因組小、高效轉(zhuǎn)化、生育期短、抗旱耐瘠，且易于在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，正在快速發(fā)展成為禾本科黍亞科功能基因組和C4光合作用的模式植物。因此，谷子葉色突變體已成為解析C4作物高效光能利用效率和探索葉綠體發(fā)育機(jī)制的重要遺傳材料[5-7]。作物葉色突變基因的鑒定與功能分析，對(duì)揭示葉綠素代謝分子機(jī)制、創(chuàng)制高光效育種新種質(zhì)奠定技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)作為標(biāo)記性狀在農(nóng)作物雜交種選育方面發(fā)揮重要作用[8]。

葉色突變體在水稻、玉米等作物中均有較多報(bào)道。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中200多個(gè)葉色突變體中已克隆出50多個(gè)突變基因；Guan等[10]對(duì)200多個(gè)玉米葉色突變體進(jìn)行相關(guān)研究，并成功克隆出黃葉色突變基因ygl1-1。目前，谷子相關(guān)葉色突變體則鮮有報(bào)道，李傳宗[11]鑒定出苗期黃葉色突變基因Seita.7G305300，該基因編碼磷酰乙醇胺胞苷轉(zhuǎn)移酶（phosphorylethanolamine cytidylyltransferase，PECT），通過線粒體途徑影響植物葉綠體發(fā)育，并最終導(dǎo)致苗期黃葉色表型；Li等[12]克隆出了黃綠色葉片突變基因SiYGL1，該基因編碼葉綠素合成途徑關(guān)鍵酶D亞基（CHLD）蛋白，其突變后抑制葉綠素合成，導(dǎo)致葉色突變；條紋葉突變體則是由SiSTL1[13]和SiSTL2[14]突變致使葉綠體發(fā)育異常，2個(gè)基因分別編碼核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RNR）大亞基蛋白和脫氧胞苷單磷酸脫氨酶（deoxy-cytidine monophosphate deaminase，DCD）蛋白。目前，隨著谷子成為模式植物的研究熱點(diǎn)，其葉色突變相關(guān)分子機(jī)制研究不能滿足對(duì)C4光合作用和葉綠體發(fā)育機(jī)制的研究，因此迫切需要?jiǎng)?chuàng)制更多的葉色突變體并發(fā)掘其作用基因和功能。

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，Abe等[15]利用突變位點(diǎn)圖譜（MutMap）技術(shù)對(duì)混池進(jìn)行測(cè)序和克隆突變體基因，該技術(shù)被稱為一種克隆突變體基因的快速高效技術(shù)，已在擬南芥[16]、水稻[17]、玉米[18]和谷子[19]等作物中成功克隆多個(gè)突變基因。MutMap適合對(duì)甲基磺酸乙酯（EMS）誘變的隱性突變基因進(jìn)行鑒定與克隆。植物通過EMS誘變和自交得到純合體后，將突變體和親本雜交構(gòu)建F2分離群體，分別得到野生型表型和突變體表型群體，對(duì)這2個(gè)群體DNA分別進(jìn)行等量混合，得到野生型DNA混池和突變體DNA混池，對(duì)2個(gè)混池分別進(jìn)行DNA測(cè)序，利用MutMap pepline進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算SNP在突變體混池和野生型混池出現(xiàn)的頻率，即可得到和突變表型連鎖的染色體區(qū)段和可能的突變位點(diǎn)，從而篩選鑒定出突變基因。

在課題組前期研究工作中，利用EMS對(duì)谷子主推品種豫谷1號(hào)進(jìn)行誘變，篩選鑒定到1個(gè)黃葉色突變體ylm-1，且該突變體表現(xiàn)出較高的光合速率和籽粒產(chǎn)量[20]。為進(jìn)一步深入研究該黃葉色突變體的遺傳機(jī)制，本研究以黃葉色突變體ylm-1和野生型豫谷1號(hào)雜交構(gòu)建的F2分離群體為定位群體，采用MutMap技術(shù)對(duì)突變基因ylm-1進(jìn)行精細(xì)定位，開發(fā)新的分子標(biāo)記，鑒定和克隆候選基因，揭示ylm-1基因在葉綠素代謝中的功能，為解析C4植物葉綠體發(fā)育機(jī)制奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料分別為野生型親本豫谷1號(hào)（安陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育）、黃葉色突變體ylm-1及ylm-1與野生型親本雜交構(gòu)建的F2分離群體（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所創(chuàng)制）。檢測(cè)突變體遺傳背景所用材料分別為冀谷41（河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所選育）、金苗紅酒谷（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所選育）和豫谷17和豫谷28（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育）。于2019和2020年種植在河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地（河南省新鄉(xiāng)市）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 突變體ylm-1表型及遺傳背景分析 于谷子苗期分別對(duì)突變體ylm-1和野生型葉片顏色進(jìn)行調(diào)查，同時(shí)選用已有的50對(duì)SSR標(biāo)記（表1）對(duì)ylm-1和野生型及4個(gè)遺傳背景差異的品種豫谷17、冀谷41、金苗紅酒谷和豫谷28進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證該突變體的遺傳背景。突變體ylm-1和野生型豫谷1號(hào)雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2分離群體，分別于3～5葉期調(diào)查F1葉色情況和F2葉色分離情況。計(jì)算F2分離群體中黃葉色表型和野生表型的分離比，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析突變體ylm-1的遺傳規(guī)律。

1.2.2 MutMap技術(shù)定位候選基因 采用MutMap技術(shù)和DNA混池測(cè)序（bulked segregant analysis，BSA）法定位和克隆候選基因[17-18]。于5葉期從F2分離群體中選取黃葉色表型植株30株葉片，提取DNA后進(jìn)行等量混合，構(gòu)建突變型DNA池，野生型DNA池為對(duì)照，進(jìn)行全基因組測(cè)序（百邁克生物科技有限公司）。完成測(cè)序后，將ylm-1突變型混池?cái)?shù)據(jù)與野生型數(shù)據(jù)分別同谷子參考基因組豫谷1號(hào)比對(duì)，獲得突變型DNA池和野生型基因組的一致性序列。并對(duì)染色體上得到SNPs數(shù)據(jù)集和SNP位點(diǎn)進(jìn)行過濾，去除豫谷1號(hào)和混池DNA共同的SNPs，篩選出混池DNA特異性的SNPs。最后計(jì)算SNP-index，將SNP-index數(shù)值接近1的區(qū)域定為關(guān)聯(lián)區(qū)間，根據(jù)關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)基因注釋結(jié)果進(jìn)一步鑒定候選基因。

利用Phytozome和Plant GDB數(shù)據(jù)庫(kù)查找定位區(qū)間內(nèi)的基因，對(duì)區(qū)間內(nèi)基因進(jìn)行功能注釋。同時(shí)結(jié)合SIFGD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行候選基因的轉(zhuǎn)錄模式分析[21]。

1.2.3 dCAPS分子標(biāo)記開發(fā)與檢測(cè) 根據(jù)候選SNPs區(qū)域內(nèi)的DNA序列和突變位點(diǎn)，采用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)dCAPS分子標(biāo)記（表1），分別以ylm-1和野生型基因組DNA及F2分離群體為模板，檢測(cè)ylm-1和野生型基因型差異，鑒定黃葉色表型是由該突變位點(diǎn)導(dǎo)致。

表1 引物名稱和序列信息Table 1 Name and sequence of primers

PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系：模板（10ng）2.00μL，10×Buffer 2.00μL，dNTPs（2.50mmol/L）1.60μL，正反向特異性引物（10μmol/L）各 0.50μL，Taq DNA聚合酶（0.50U）0.10μL，加 ddH2O 至 20.00μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃5min；94℃40s，57℃40s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物6.00μL，限制性內(nèi)切酶10U，10×Buffer 1.50μL，加ddH2O至16.00μL，37℃酶切12h。取酶切產(chǎn)物8.00μL于5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體ylm-1表型及遺傳學(xué)分析

突變體ylm-1與野生型苗期葉色表現(xiàn)出明顯的差異（圖1），隨著植株的生長(zhǎng)，開花期葉片呈現(xiàn)黃綠色（圖2），整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程未恢復(fù)為正常葉色，而野生型全生育期葉片均表現(xiàn)為正常綠色。在苗期和開花期，F(xiàn)1葉色表型與野生型一致。

圖1 苗期野生型（WT）、突變體ylm-1和F1葉片顏色Fig.1 Leaf color of the wild type(WT),mutant ylm-1 and F1at seedling stage

圖2 開花期野生型（WT）、突變體ylm-1和F1葉片顏色Fig.2 Leaf color of the wild type（WT）,mutant ylm-1 and F1at flowering stage

在110株BC1F2分離群體中，通過谷子苗期葉色表型調(diào)查，正常葉色植株89株，黃葉色植株21株，卡方檢驗(yàn)（χ2=0.54，P=0.38），符合3:1分離比，表明該黃葉色突變性狀由1對(duì)單隱性基因控制。

選用50對(duì)分子標(biāo)記對(duì)ylm-1、野生型及豫谷17、冀谷41、豫谷28和金苗紅酒谷基因型進(jìn)行檢測(cè)，突變體與野生型對(duì)照的條帶在凝膠上的相對(duì)位置一致，DNA片段大小相同，說明突變體與野生型遺傳背景相同，不是其他品種混雜。而其余4個(gè)谷子品種的條帶與野生型在部分標(biāo)記間顯示出差異性（圖3）。

圖3 突變體ylm-1遺傳背景檢測(cè)Fig.3 Genetic background detection of mutant ylm-1

2.2 基于MutMap技術(shù)的候選基因鑒定

為進(jìn)一步探究ylm-1黃葉色形成的分子機(jī)制，利用MutMap技術(shù)對(duì)突變體ylm-1的候選基因進(jìn)行鑒定[21-22]。將ylm-1與野生型豫谷1號(hào)雜交的F2群體中30株黃葉色表型植株進(jìn)行混池測(cè)序，野生型豫谷1號(hào)作為對(duì)照，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行SNP位點(diǎn)分析。根據(jù)參考基因組信息，開發(fā)并過濾SNP位點(diǎn)，計(jì)算親本與混池中每個(gè)SNP的SNP-index值，其中SNP-index值接近1的為候選SNPs。最終得到高質(zhì)量可信的突變體ylm-1混池特異SNP 158 149個(gè)，突變體混池SNP-index分布見圖4。

圖4 SNP-index值在染色體上的分布Fig.4 Distribution map of SNP-index values on chromosomes

取所有位點(diǎn)擬合值的99百分位數(shù)，計(jì)算得0.97，最終得到3個(gè)區(qū)域，總長(zhǎng)度0.45Mb，共包含26個(gè)基因（表2）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，親本與混池間存在非同義突變的SNP共32個(gè)，分別位于13個(gè)基因上，即非同義突變的基因共13個(gè)，以上非同義突變基因與黃葉色突變性狀可能直接相關(guān)（表3）。

應(yīng)用BLAST軟件對(duì)候選區(qū)間內(nèi)13個(gè)非同義突變編碼基因進(jìn)行多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（NR，Phytozome，PlantGDB，Swiss-Pro）的深度注釋，其中Seita.9G249900是一個(gè)編碼紅葉綠素代謝還原酶（RCCR）的相關(guān)基因（表3），該基因位于第9號(hào)染色體19 937 988與19 940 620bp之間。利用SIFGD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)13個(gè)非同義突變基因在谷子不同組織器官的表達(dá)模式進(jìn)行分析[23]，基于mRNA-seq FPKM（fragments per kilobase million）的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明Seita.9G249900在葉片的表達(dá)量顯著高于其他部位（圖5）。因此，推測(cè)該基因?yàn)閥lm-1的重要候選基因。

圖5 13個(gè)非同義突變基因在不同部位中的FPKM值Fig.5 FPKM values of thirteen non-synonymous mutation genes in different parts

2.3 突變位點(diǎn)驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證Seita.9G249900為黃葉色突變體ylm-1的候選基因，根據(jù)該基因突變位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)了dCAPS標(biāo)記（突變位點(diǎn)造成限制性內(nèi)切酶AluI的差異）（表1）。并利用該分子標(biāo)記檢測(cè)野生型豫谷1號(hào)、突變體ylm-1及野生型×ylm-1 F2單株群體帶型，凝膠電泳結(jié)果（圖6）顯示，突變體ylm-1與野生型豫谷1號(hào)存在明顯差異，野生型×ylm-1 F2群體中Seita.9G249900基因型和表型呈共分離。Seita.9G249900位點(diǎn)為純合野生型或者雜合型時(shí)，葉片顏色表現(xiàn)正常；Seita.9G249900位點(diǎn)為純合突變型時(shí)，葉片為黃色。綜上所述，ylm-1中確實(shí)存在基因位點(diǎn)突變，其黃葉色表型很可能是由基因Seita.9G249900的突變導(dǎo)致。

圖6 野生型×ylm-1 F2分離群體中dCAPS標(biāo)記凝膠分析Fig.6 Analysis of electrophoretic images of dCAPS marker for wild type×ylm-1 of F2populations

2.4 基因位點(diǎn)的功能分析

結(jié)合NCBI和Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)基因組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Seita.9G249900含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子（圖7a）。其中ylm-1突變發(fā)生在第2外顯子361bp處（A/T），導(dǎo)致1個(gè)谷氨酸（E）變成天冬氨酸（D）（圖7b）。Seita.9G249900編碼PCCR，主要參與葉綠素的分解代謝、生物合成及光合系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)光復(fù)合物的分解代謝過程，與擬南芥AT4G37000基因具有同源性，其編碼的紅葉綠素代謝還原酶（RCCR）在分解葉綠素的卟啉成分中起著重要的催化作用；同時(shí)也是水稻LOC-OS10g0389100的同源基因，且編碼葉綠體中RCCR，研究表明RCCR1基因沉默或表達(dá)下調(diào)時(shí)，植株葉片呈現(xiàn)黃色且生育期增加，葉片色素含量顯著降低。綜上所述，結(jié)合候選基因的功能注釋與位點(diǎn)分析，ylm-1應(yīng)為谷子1個(gè)新的黃葉色突變體，初步推斷其黃葉色表型是由一個(gè)編碼RCCR基因Seita.9G249900突變導(dǎo)致，其基因功能與作用機(jī)制需進(jìn)一步驗(yàn)證與分析。

圖7 Seita.9G249900編碼區(qū)結(jié)構(gòu)圖（a）及氨基酸序列分析（b）Fig.7 The structure diagram of Seita.9G249900 coding region(a)and analysis of peptide sequence(b)

3 討論

3.1 MutMap技術(shù)在突變基因定位與克隆中的應(yīng)用

MutMap是Abe等[15]于2012年提出的一種新的基因克隆技術(shù)，較圖位克隆更快捷、更高效、成本更低，較適合于由EMS誘變產(chǎn)生的隱性突變基因分析。植物通過EMS誘變和自交得到純合體后，將其與親本雜交得到F1，F(xiàn)1自交得到的F2群體會(huì)出現(xiàn)野生型和突變體的分離。對(duì)這2個(gè)表型群體的DNA分別進(jìn)行等量混合，構(gòu)建野生型DNA混池和突變體DNA混池。將2個(gè)混池分別進(jìn)行DNA測(cè)序，利用MutMap pepline進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算SNP在突變體混池和野生型混池出現(xiàn)的頻率，即可得到和突變表型連鎖的染色體區(qū)段和可能的突變位點(diǎn)。另外MutMap技術(shù)在定位質(zhì)量性狀隱性基因和數(shù)量性狀QTL位點(diǎn)方面均有較廣泛和高效的應(yīng)用[24-26]。本研究以野生型豫谷1號(hào)和黃葉色突變體ylm-1雜交構(gòu)建的F2群體為定位群體，利用MutMap技術(shù)對(duì)ylm-1突變基因進(jìn)行精細(xì)定位，通過提取30株黃葉色表型植株葉片DNA并等量混合作為突變型DNA混池，野生型豫谷1號(hào)DNA作為對(duì)照，二者進(jìn)行基因組重測(cè)序，根據(jù)測(cè)序和分析結(jié)果篩選SNP-index接近1的染色體區(qū)域作為與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的候選區(qū)域，結(jié)果顯示該區(qū)間內(nèi)共包含13個(gè)非同義突變基因，根據(jù)基因功能注釋結(jié)果和表達(dá)模式分析結(jié)果，進(jìn)一步推測(cè)候選基因。

3.2 紅葉綠素代謝還原酶（RCCR）的功能分析

植物葉綠素代謝和信號(hào)調(diào)控途徑較為復(fù)雜，作用基因眾多，其中任何一個(gè)基因發(fā)生突變都有可能引起葉綠素代謝途徑的變化，從而表現(xiàn)為葉色異常甚至植株死亡的現(xiàn)象。RCCR是葉綠體中一種可溶性蛋白，屬于鐵氧還蛋白依賴的膽紅素還原酶家族成員之一[27]，可以將紅葉綠素代謝產(chǎn)物（RCC）的C20/C1雙鍵還原形成初級(jí)熒光葉綠素分解代謝產(chǎn)物（pFCC）[28]。葉綠素代謝相關(guān)基因的研究對(duì)解析葉綠素代謝、葉色異常及光合效率變化的機(jī)制具有重要的理論價(jià)值[29]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有關(guān)葉綠素代謝相關(guān)基因的研究不斷深入，并取得一定的突破性進(jìn)展。目前研究普遍認(rèn)為葉綠素的代謝存在2種途徑，即葉綠素酶（CLH）代謝途徑和脫鎂葉綠素酶（PPH）途徑[30]。在由脫鎂葉綠酸a（pheide a）轉(zhuǎn)化成pFCC的過程中，RCCR在葉綠素代謝中起重要的調(diào)控作用，其活性與葉綠素代謝呈明顯的正相關(guān)，RCCR發(fā)揮活性的過程對(duì)葉片保持綠色起著重要調(diào)控作用[31-33]。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)RCCR基因表達(dá)與活性在葉片衰老過程中大幅度下調(diào)。Pruzinská等[35]報(bào)道了擬南芥中缺乏RCCR的acd2-2突變體表現(xiàn)出葉色變淺、葉綠素含量降低的表型。Fukasawa等[36]研究指出，BoRCCR表達(dá)量在青花菜黃化葉片中顯著降低。Gomez-Lobato等[37]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素、1-MCP以及熱空氣處理均能增加BoRCCR的表達(dá)量。

本研究中，利用MutMap技術(shù)克隆到一個(gè)與紅葉綠素代謝相關(guān)的RCCR基因Seita.9G249900，其是擬南芥ACD2（AT4G37000）基因的同源基因，編碼的RCCR在分解葉綠素的卟啉成分中起著重要的催化作用；同時(shí)也是水稻RCCR1（LOC-OS 10g0389100）基因的同源基因，在RCCR1基因沉默或表達(dá)下調(diào)時(shí)，植株葉片呈現(xiàn)黃色且生育期增長(zhǎng)，葉片色素含量顯著降低。根據(jù)候選基因功能注釋和表達(dá)分析，結(jié)果表明編碼RCCR蛋白的基因Seita.9G249900發(fā)生突變可能是導(dǎo)致ylm-1葉色發(fā)生突變的原因，該基因的功能與作用機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證與分析。

4 結(jié)論

黃葉色突變性狀受1對(duì)隱性核基因控制，定位于第9號(hào)染色體，利用MutMap技術(shù)在關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)精細(xì)定位到13個(gè)非同義突變基因，根據(jù)候選基因功能注釋和表達(dá)分析，鑒定和克隆到一個(gè)與紅葉綠素代謝相關(guān)的RCCR基因Seita.9G249900，該基因?yàn)閷?dǎo)致ylm-1葉色發(fā)生突變的候選基因，其物理位置位于第9號(hào)染色體19 937 988與19 940 620bp之間，推測(cè)Seita.9G249900基因在葉綠素代謝和光合作用過程中起重要作用。