郭樹(shù)春 苗紅梅 李素萍 于海峰 聶 惠牟英男 溫馨雨 梁 晨 張海斌 邵 盈

（1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，450002，河南鄭州；2內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，010031，內(nèi)蒙古呼和浩特；3內(nèi)蒙古烏蘭察布市察右中旗大灘鄉(xiāng)人民政府，013558，內(nèi)蒙古烏蘭察布）

向日葵（Heliauths annuus L.）起源于北美洲，屬菊科向日葵屬一年生草本植物，具有抗逆性強(qiáng)和適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，是世界四大油料作物之一[1]。世界上有40多個(gè)國(guó)家種植向日葵，其中種植面積較大的國(guó)家有俄羅斯、烏克蘭、阿根廷、羅馬尼亞、中國(guó)等[2]。向日葵籽油是南美洲國(guó)家、俄羅斯、法國(guó)及部分東歐國(guó)家的主要食用油[3]。向日葵籽是東南亞國(guó)家主要休閑食品之一[4-5]，也是重要的工業(yè)原料，在東南亞的市場(chǎng)需求旺盛，其次籽粒還是一種優(yōu)質(zhì)的飼料原料。目前，向日葵籽在炒貨和籽仁市場(chǎng)中的消費(fèi)量呈上升趨勢(shì)。在我國(guó)，向日葵是改良鹽堿地的先鋒作物，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整中具有不可替代的作用。

向日葵列當(dāng)（Orobanche cumana Wallr.）屬列當(dāng)科列當(dāng)屬植物，寄生在向日葵等寄主根部引起植株莖稈低矮細(xì)弱，產(chǎn)量和品質(zhì)明顯降低，甚至整株死亡，對(duì)向日葵生產(chǎn)危害嚴(yán)重[6]。19世紀(jì)上半葉人們認(rèn)為向日葵的寄主是蒿屬（Artemisia spp.）植物，Antonova[3]研究發(fā)現(xiàn)向日葵更合適列當(dāng)寄生。此后，隨著不同國(guó)家和地區(qū)向日葵種植面積的擴(kuò)大，向日葵列當(dāng)?shù)陌l(fā)生及危害也愈漸嚴(yán)重[7]。向日葵列當(dāng)具有很強(qiáng)的傳播和突變能力[8]。單株列當(dāng)會(huì)產(chǎn)生數(shù)千個(gè)微小的種子，種子大小為200～300μm，且很容易被風(fēng)和其他媒介（包括向日葵種子和農(nóng)機(jī)具等）傳播[9]。列當(dāng)種子從無(wú)限花序蒴果中釋放后，可在土壤中休眠長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年之久[10]，可在寄主植物根系分泌物的誘導(dǎo)下發(fā)芽[11]，開(kāi)始新的寄生生活。

據(jù)估計(jì)，地中海和西亞地區(qū)有1600萬(wàn)hm2的土地受到列當(dāng)影響[12-13]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[14-16]，在易感列當(dāng)品種種植區(qū)，由列當(dāng)侵染造成的損失超過(guò)50%，受侵染嚴(yán)重的田地可達(dá)100%。黃長(zhǎng)權(quán)[17]研究表明，單株向日葵被5株列當(dāng)寄生時(shí)，株高降低11.8%，莖粗降低15.2%；寄生40株時(shí)，株高和莖粗分別降低40.9%和39.2%。任文義等[18]研究發(fā)現(xiàn)，單株向日葵上列當(dāng)寄生數(shù)為10～20株時(shí)，向日葵減產(chǎn)30%，寄生數(shù)為30株以上時(shí)，會(huì)造成80%的減產(chǎn)；寄生數(shù)量達(dá)到50株以上時(shí)其產(chǎn)量近乎絕收。在選用非抗性品種條件下，選用合理的管理和栽培方法，可以降低列當(dāng)對(duì)其生產(chǎn)的不良影響。研究證明，使用化學(xué)方法控制列當(dāng)是可行的，但高成本和污染環(huán)境問(wèn)題限制了其推廣與應(yīng)用。使用抗列當(dāng)品種是控制寄生性列當(dāng)?shù)淖罴逊椒?。培育抗列?dāng)品種的基礎(chǔ)是挖掘有效抗源，然而，這是一項(xiàng)長(zhǎng)久持續(xù)的工作，因?yàn)橐坏┌l(fā)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有小種的抗源，列當(dāng)就會(huì)進(jìn)化出更具毒性的生理小種。向日葵抗列當(dāng)基因有單基因和多基因遺傳抗性的報(bào)道[19]。目前，向日葵列當(dāng)正在我國(guó)快速蔓延，對(duì)向日葵產(chǎn)業(yè)的影響日趨嚴(yán)重。

向日葵列當(dāng)已成為研究重點(diǎn)，本文側(cè)重于通過(guò)育種手段提高向日葵對(duì)列當(dāng)?shù)目剐裕绕涫峭ㄟ^(guò)分子育種得到對(duì)毒力更強(qiáng)的列當(dāng)小種具有抗性的向日葵品種進(jìn)行了綜述。同時(shí)還開(kāi)展生理小種的結(jié)構(gòu)和分布、定性和定量抗性基因在提高向日葵抗性中應(yīng)用以及分子標(biāo)記輔助選擇等方面的研究。此外，展望了在今后工作中要充分利用生物技術(shù)工具，如基因組學(xué)和基因編輯技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)向日葵對(duì)列當(dāng)?shù)某志每剐?，為向日葵抗列?dāng)育種研究提供理論依據(jù)，對(duì)我國(guó)向日葵生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 向日葵列當(dāng)生理小種分布

向日葵列當(dāng)具有宿主特異性，這一現(xiàn)象在寄生植物中很少見(jiàn)[20]。向日葵列當(dāng)以自花授粉為主，因此其種群間遺傳多樣性很高[21]。向日葵列當(dāng)基因組較小，易受環(huán)境影響而突變，其群體進(jìn)化速度快，且存在生理小種分化的現(xiàn)象[22]。在列當(dāng)屬植物中，一種向日葵列當(dāng)生理小種類型（根據(jù)其毒力強(qiáng)弱，以A、B、C…小種順序表示）對(duì)應(yīng)一種特定的向日葵抗列當(dāng)基因型，表現(xiàn)出明顯的種族結(jié)構(gòu)。目前已知的向日葵列當(dāng)生理小種有8種（A～H）。

據(jù)文獻(xiàn)[2]記載，第一次發(fā)現(xiàn)了列當(dāng)存在不同生理小種，鑒定出與之對(duì)應(yīng)的抗列當(dāng)品種，并區(qū)分了2個(gè)向日葵列當(dāng)生理小種，即A和B。后來(lái)，隨著新的生理小種C的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響向日葵生產(chǎn)，A和B的遺傳抗性因此而變得無(wú)效[21]。研究發(fā)現(xiàn)，在一段時(shí)間內(nèi)新的抗列當(dāng)向日葵種質(zhì)的引入可控制列當(dāng)?shù)陌l(fā)生，但隨著環(huán)境壓力的增加，新的毒性更強(qiáng)的列當(dāng)小種就會(huì)出現(xiàn)，并使原有的抗原失去效力。目前，向日葵列當(dāng)存在的地區(qū)有所有南歐國(guó)家、黑海周邊地區(qū)、北非、以色列和中國(guó)[16]。據(jù)報(bào)道[23]，俄羅斯南部地區(qū)存在多種列當(dāng)生理小種，已命名為F、G和H。繼F小種之后，在羅馬尼亞和西班牙相繼發(fā)現(xiàn)了致病力更高的G小種，該生理小種能夠在抗F小種的向日葵寄生[7,24]。2014年，Kaya[6]報(bào)道稱，在土耳其發(fā)現(xiàn)一種新的向日葵列當(dāng)，其致病力比當(dāng)時(shí)已發(fā)現(xiàn)的向日葵列當(dāng)小種都高，并將其命名為生理小種H。2011年，Dicu等[25]在羅馬尼亞也發(fā)現(xiàn)了向日葵列當(dāng)生理小種H。Hablak等[26]在烏克蘭東北部觀察到H小種的存在，以及毒力高于H小種的向日葵列當(dāng)生理小種。摩爾多瓦向日葵列當(dāng)不同生理小種的空間分布不均，在該國(guó)中部地區(qū)較低毒力的小種占主導(dǎo)地位，而在南部和北部地區(qū)高侵染性生理小種占主導(dǎo)地位，超過(guò)60%的列當(dāng)樣本歸類為G和H小種[27]。羅馬尼亞2005年就出現(xiàn)了高毒力G小種[28-29]。

不同國(guó)家向日葵列當(dāng)生理小種的組成情況有所不同。Shindrova[30]于2000-2004年間在保加利亞向日葵主產(chǎn)區(qū)采集列當(dāng)種子，然后利用成套鑒別寄主對(duì)其生理小種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明保加利亞存在D、E和F小種，其中E小種的分布區(qū)域最為廣泛，F(xiàn)小種存在于中北部的個(gè)別區(qū)域。Shindrova[30]于2012年對(duì)保加利亞116份向日葵列當(dāng)進(jìn)行了生理小種鑒定，發(fā)現(xiàn)有E、F、G和H生理小種，其中E和G小種的分布最為廣泛，F(xiàn)小種有零星分布，H小種為首次發(fā)現(xiàn)。Pacureanu-Joita等[31]對(duì)西班牙向日葵列當(dāng)進(jìn)行了生理小種鑒定，發(fā)現(xiàn)西班牙向日葵列當(dāng)主要由E小種組成，但也有F小種的存在。Dedic等[32]對(duì)塞爾維亞伏伊伏丁那省向日葵列當(dāng)致病力分化及分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)B小種是該省南部主要的小種類型，而E小種則是該省北部地區(qū)主要的小種類型。Molinero-Ruiz等[33]在西班牙北部地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了列當(dāng)?shù)膫鞑?，其中生理小種F最具毒力。

對(duì)中國(guó)列當(dāng)小種結(jié)構(gòu)和分布分析，發(fā)現(xiàn)A～G小種在我國(guó)均有不同程度的存在[4]。1996年，董百春等[34]利用源自西班牙的5份向日葵列當(dāng)國(guó)際鑒別寄主，采用人工接種方法對(duì)吉林省3個(gè)向日葵列當(dāng)群體進(jìn)行了生理小種鑒定，結(jié)果證明它們均屬于生理小種A。馬德甯等[35]于2014年對(duì)來(lái)自內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、吉林和黑龍江等地的向日葵列當(dāng)進(jìn)行了生理小種鑒定，發(fā)現(xiàn)這些向日葵列當(dāng)樣本中包含有生理小種A到F的全部類型。石必顯等[36]利用向日葵列當(dāng)國(guó)際通用鑒別寄主，對(duì)我國(guó)不同省區(qū)29個(gè)地點(diǎn)的向日葵列當(dāng)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)向日葵列當(dāng)生理小種A、D、E、F和G的存在，其中D小種是優(yōu)勢(shì)生理小種。

2 向日葵抗列當(dāng)遺傳改良

2.1 向日葵抗列當(dāng)品種選育

抗列當(dāng)品種的成功選育很大程度上取決于相關(guān)性狀的遺傳變異[37]，抗性品種可阻礙列當(dāng)在向日葵根部的寄生，從而達(dá)到防治的效果。由于栽培向日葵的遺傳多樣性相對(duì)狹窄，因此現(xiàn)有遺傳資源是非常寶貴的變異來(lái)源；通過(guò)引入重要農(nóng)藝基因，可提高向日葵栽培品種的抗性和品質(zhì)性狀。此外，野生向日葵和世界各地研究機(jī)構(gòu)開(kāi)發(fā)的栽培向日葵的基因庫(kù)是向日葵列當(dāng)抗性的重要來(lái)源，可通過(guò)自交與雜交等手段為特定品系引入列當(dāng)抗性。

目前，通過(guò)種間雜交、自交和回交等手段可將向日葵野生種H.tuberosu的抗性基因?qū)朐耘嗖牧?，并已成功選育出抗生理小種E、F和G的向日葵新品種[38]。Joel[39]將向日葵野生種H.maximiliani Schrad，H.grosseserratus Mart和 H.divarticatus與常規(guī)栽培種交叉種植，培育出4個(gè)（BR1-BR4）抗小種F品種。陳燕芳等[40]從原有感列當(dāng)“三道眉”群體中尋求抗源，采用連續(xù)自交選擇純化的方法成功選育出抗列當(dāng)食葵新品種622。由此可見(jiàn)，現(xiàn)有栽培向日葵基因庫(kù)也是列當(dāng)抗性的重要來(lái)源，這些基因庫(kù)由不同類型的種群和近交系組成。Joita等[7]從羅馬尼亞農(nóng)業(yè)研究與發(fā)展研究所的栽培向日葵基因庫(kù)中鑒定出對(duì)F和G小種有抗性的LC1093、LC009和AO-548品系，這些研究所開(kāi)發(fā)和改良的向日葵抗列當(dāng)材料極大地豐富了向日葵遺傳資源多樣性，為向日葵抗列當(dāng)育種做出了巨大貢獻(xiàn)。

2.2 向日葵抗列當(dāng)基因

抗性育種是一項(xiàng)持續(xù)性很強(qiáng)的工作，其中包括發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制抗性基因。Vranceanu等[19]鑒定了5個(gè)抗列當(dāng)單顯性基因（以O(shè)r1、Or2、Or3…表示），成功培育出抗E小種的自交系和雜交種，提高了歐洲和亞洲等區(qū)域的向日葵產(chǎn)量。通過(guò)培育抗性品種防治列當(dāng)簡(jiǎn)單易行，能夠有效控制列當(dāng)蔓延，已成為向日葵抗列當(dāng)育種的首選手段[41]。然而，由于該寄生性列當(dāng)?shù)目焖龠M(jìn)化，該類型抗性很容易被打破[37,42]，這主要是由不同列當(dāng)生理小種的特異性導(dǎo)致，如由基因Or6控制的抗性基因?qū)及以下生理小種有效[43-44]。Goncharov[45]研究表明，向日葵列當(dāng)G小種的致病力極強(qiáng)，其所對(duì)應(yīng)的抗性基因?yàn)镺r7。

除了對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)拇怪笨剐匝芯客?，人們從分子遺傳水平揭示向日葵列當(dāng)抗性的復(fù)雜性，對(duì)向日葵列當(dāng)不同生理小種特異性抗性的數(shù)量位點(diǎn)已有報(bào)道[44,46-48]，利用不同的定位群體，在不同遺傳區(qū)域定位了一個(gè)控制列當(dāng)抗性的QTL。QTL基因定位法的主要優(yōu)點(diǎn)是，除可以定位主效QTL外，還可對(duì)列當(dāng)抗性影響較小的互補(bǔ)QTL定位，并可作為標(biāo)記輔助選擇的有效標(biāo)記。Pérez-Vich等[44]研究表明，QTL對(duì)列當(dāng)抗性并不總是與抗性親本的等位基因相對(duì)應(yīng)，在某些情況下，它是由易感親本的等位基因賦予的。向日葵抗列當(dāng)育種的主要目的是培育攜帶所需目的基因的高產(chǎn)向日葵資源。由此可見(jiàn)，對(duì)高毒力小種有抗性的向日葵基因型是稀缺抗性基因的來(lái)源，并可用于區(qū)分高級(jí)別列當(dāng)小種。此外，獲得抗特定列當(dāng)生理小種的基因序列信息，能夠?qū)ο蛉湛剐院土挟?dāng)小種進(jìn)行更加準(zhǔn)確的區(qū)分。

2.3 向日葵抗列當(dāng)遺傳多樣性分子標(biāo)記

擁有單一列當(dāng)抗性的基因型往往在很短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)失去抗性。例如，當(dāng)攜帶Or5基因的向日葵遇到毒性更強(qiáng)的小種時(shí)，就會(huì)失去抗性，因此，要培育持續(xù)抗列當(dāng)品種，需要采取新的策略，如主效基因聚合或垂直抗性與水平抗性聚合等[19]。將1個(gè)以上的基因和QTL聚合于1個(gè)材料，迫使列當(dāng)克服2個(gè)或更多基因的抗性，達(dá)到持續(xù)抗列當(dāng)目的。但傳統(tǒng)育種手段很難實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，因此，通過(guò)MAS進(jìn)行基因聚合是快速遺傳改良的有效方法。與表型選擇育種相比，分子標(biāo)記輔助選擇是一種簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確的方法，在抗病育種中更為方便[49]。由于栽培向日葵對(duì)列當(dāng)?shù)目剐孕枰氩煌瑏?lái)源材料的抗性基因，可利用不同類型的分子標(biāo)記定位和鑒定抗性基因的位置和序列信息，從而聚合多個(gè)抗性基因。隨著更復(fù)雜的向日葵抗列當(dāng)數(shù)量遺傳信息的出現(xiàn)，分析和鑒定抗列當(dāng)基因?qū)⒆兊酶攥F(xiàn)實(shí)意義和挑戰(zhàn)性。

到目前為止，已經(jīng)明確了一些向日葵抗列當(dāng)分子標(biāo)記或基因。張明等[50]利用抗F小種列當(dāng)材料和高感材料，根據(jù)BSA法建立了抗、感池，對(duì)分布在17個(gè)向日葵連鎖群上的409對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，共篩選到77個(gè)多態(tài)性SSR引物，從這些引物中篩選到4對(duì)可將抗—感單株、抗—感混池明確區(qū)分開(kāi)的引物，它們可能是抗F小種通用分子標(biāo)記引物。Tang等[51]定位了一個(gè)抗列當(dāng)E小種的單基因Or5所連鎖的SSR分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)該基因定位在LG3的頂端，距離最近的標(biāo)記是CRT392，為5.6cM。此外，Pérez-Vich等[44]在第7條染色體上檢測(cè)到5個(gè)抗E小種的QTL和6個(gè)抗F小種的QTL，研究確定E小種抗性表型變異主要由第3染色體上與抗性或易感性狀相關(guān)的主效QTL產(chǎn)生。Imerovski等[52]通過(guò)SSR標(biāo)記得到抗列當(dāng)F小種的基因僅在LG3上顯示多態(tài)性，與該基因最接近的標(biāo)記為Orabvl-8，暫命名為ORS683，遺傳距離為1.5cM。雖然該基因與Or5在同一條染色體上，但這2個(gè)抗性基因是不同的。Or5基因位于第3染色體上端，最近的公共標(biāo)記ORS1036位于下游7.5cM處，而Orabvl-8定位于第3染色體下端。Imerovski等[48]在第3染色體上定位了2個(gè)抗列當(dāng)主要QTL，分別命名為QTL or3.1和QTL or3.2，前者定位于Or5的基因組區(qū)域，后者首次定位于同一染色體的下游區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)第3染色體存在抗性QTL，根據(jù)雜交結(jié)果，在向日葵基因組中定位了2～23個(gè)顯著QTL，并在距SSR標(biāo)記ht0464-ca約3cM處的LG4位點(diǎn)上推測(cè)了列當(dāng)小種H的抗性位點(diǎn)，2個(gè)SNP標(biāo)記（HT0183和HT090）被鑒定為潛在的重要標(biāo)記。Louarn等[47]鑒定了2個(gè)生理小種（F小種來(lái)自西班牙，G小種來(lái)自土耳其）在向日葵3個(gè)發(fā)育階段的不同QTL，并在9條染色體上定位了17個(gè)QTL，其中只有1個(gè)QTL在2個(gè)小種的抗性上共定位。最近研究[53]發(fā)現(xiàn)基因HaOr7已被定位到第7條染色體上。

2.4 向日葵抗列當(dāng)基因信息

近年來(lái)，隨著植物全基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組取得進(jìn)展，可在全基因組水平挖掘和鑒定抗性基因和蛋白。最近公開(kāi)的向日葵基因組序列為向日葵基因組的開(kāi)發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[53]。Duriez等[54]結(jié)合基因組學(xué)和圖譜克隆技術(shù)，定位和鑒定了HaOr7基因?qū)α挟?dāng)F小種的抗性功能。該基因位于一個(gè)約55kb的窗口。為了獲得親本基因組序列，從易感株系和抗性株系中建立并篩選了2個(gè)BAC文庫(kù)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)HaOr7基因起源于野生向日葵。將該序列與XRQ易感F小種的參考序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HaOr7基因編碼了一個(gè)完整的LRR蛋白激酶，而在易感向日葵品系中，該蛋白無(wú)跨膜和激酶結(jié)構(gòu)域。HaOr7阻止了向日葵根與維管系統(tǒng)的連接，其在列當(dāng)早期發(fā)生階段起作用。Imerovski等[48]分析了3個(gè)不同的雜交組合，在3號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了QTL峰顯著的區(qū)域。在主效QTL or3.1（31.9～38.48Mb）共鑒定出123個(gè)基因，選出HanXRQChr03g0065701（RPS2抗病蛋白）和HanXRQChr03g0065841（TMV抗病蛋白）基因。在該QTL or3.2共鑒定出71個(gè)基因，分布在97.13～100.85Mb，其中包括1個(gè)防御基因HanXRQChr03g0076321?？紤]到QTL or3.1附近區(qū)域之前已鑒定為攜帶對(duì)E小種具有完全抗性和對(duì)F小種具有部分抗性的Or5基因[43,51]，推測(cè)QTL or3.1可能是Or5基因，詳見(jiàn)表1。

表1 向日葵抗列當(dāng)抗性基因及其序列信息Table 1 Sunflower resistance gene and its sequence information

3 展望

列當(dāng)是影響向日葵產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。目前，仍未培育出持續(xù)抗列當(dāng)?shù)钠贩N。最近，向日葵基因組測(cè)序結(jié)果的公布為列當(dāng)小種無(wú)毒力鑒定、向日葵抗性基因定位和基因間調(diào)控關(guān)系明確奠定了基礎(chǔ)，可以更好地理清向日葵抗列當(dāng)機(jī)制以及挖掘新的抗性基因?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展有助于更快地設(shè)計(jì)出優(yōu)異的列當(dāng)抗性基因類型，促進(jìn)聚合抗性的產(chǎn)生，但由于向日葵再生出苗困難和轉(zhuǎn)化率低等難點(diǎn)，致使基因編輯技術(shù)和基因沉默技術(shù)難以應(yīng)用于向日葵育種。因此，使用現(xiàn)代基因編輯技術(shù)的第一步需要建立完善的向日葵再生、轉(zhuǎn)化體系，此外，將垂直抗性研究與水平抗性研究結(jié)合，開(kāi)展分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種和多基因聚合分子育種等多種育種方式，培育持續(xù)抗列當(dāng)向日葵新品種，是現(xiàn)代向日葵育種家的目標(biāo)之一。