王國(guó)艷 范建強(qiáng) 黨文慶 何敏 王志宇

摘要 [目的]調(diào)查山西省某肉牛場(chǎng)犢牛腹瀉源大腸桿菌耐藥基因的流行情況。[方法]采用Kirby-Bauer紙片法和PCR法，對(duì)分離出的8株腹瀉大腸桿菌進(jìn)行了7種臨床常用藥物的藥物敏感試驗(yàn)及相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)。[結(jié)果]耐3種藥物的菌株有1株，耐2種藥物的菌株有6株，僅有1株菌對(duì)1種藥物耐受;分離的8株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌菌株對(duì)四環(huán)素、慶大霉素高度耐藥，耐藥率分別為100%、87.5%;對(duì)氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素敏感性較高。分離的8株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌菌株的 aph3′-Ⅱ、TetD和TetB基因檢出率分別為75.0%、62.5%和37.5%。[結(jié)論]該肉牛場(chǎng)犢牛源腹瀉大腸桿菌存在一定程度的耐藥性。

關(guān)鍵詞 大腸桿菌;牛腹瀉;耐藥基因

中圖分類號(hào) S 852.61? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）12-0079-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.020

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Drug Resistance Gene Analysis of Escherichia coli from Diarrhea of Calves in Shanxi

WANG Guo-yan1，F(xiàn)AN Jian-qiang2， DANG Wen-qing1 et al

（1.Longcheng Campus， College of Animal Medicine， Shanxi Agricultural University， Taiyuan， Shanxi 030032;2.Loufan Wanshunyuan Agriculture and Animal Husbandry Development Co.，Ltd.，Taiyuan， Shanxi 030300）

Abstract [Objective]In order to investigate the prevalence of drug resistance genes of Escherichia coli from diarrhea in calves of a beef cattle farm in Shanxi Province.[Method]8 strains of E.coli isolated by Kirby Bauer method and PCR were tested for drug sensitivity and related drug resistance genes.[Result]The results showed that 1 strain were resistant to 3 drugs， 6 strain were resistant to 2 drugs， and only 1 strain was resistant to 1 drug.Eight strains of E.coli isolated from calves were highly resistant to tetracycline gentamicin， and the resistance rates were 100%， 87.5%， respectively.The sensitivity to ofloxacin amikacin kanamycin was higher.The detection rates of aph3-Ⅱ、TetD and TetB genes of 8 strains of E.coli isolated from calves were 75.0%， 62.5% and 37.5%， respectively.[Conclusion]The study indicates that there was a certain degree of resistance to E.coli from calf diarrhea in this cattle farm.

Key words Escherichia coli;Cattle diarrhea;Drug resistance genes

犢牛腹瀉是一種臨床表現(xiàn)以腹瀉、脫水、發(fā)熱、消瘦為主的疾病，沒(méi)有明顯的季節(jié)性[1-3]。該病是由病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等眾多因素引起[4-6]，而由致病性大腸桿菌混合感染引起的占90%[3，7-8]。近幾年，山西太原地區(qū)肉牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較為迅速，犢牛腹瀉越來(lái)越引起人們的重視。筆者于2019—2020年在養(yǎng)殖場(chǎng)共采集分離出8株?duì)倥８篂a大腸桿菌，并進(jìn)行了耐藥表型及耐藥基因的檢測(cè)，旨在為養(yǎng)殖場(chǎng)犢牛大腸桿菌腹瀉的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源。

于2019—2020年共采集山西省太原地區(qū)某肉牛場(chǎng)分離的8株腹瀉大腸桿菌，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)龍城校區(qū)（原山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所）保存。菌株編號(hào)為1～8號(hào)。

1.1.2 主要試劑。

水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）培養(yǎng)基、Mueller-Hinton 肉湯（MH肉湯）購(gòu)自青島賓得生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq MasterMix、marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京） 有限公司;藥敏紙片：阿米卡星（10 μg/片）、頭孢曲松（30 μg/片）、氧氟沙星（30 μg/片）、諾氟沙星（30 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、四環(huán)素（30 μg/片），購(gòu)自北京天壇生物制品有限公司。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成。

參照參考文獻(xiàn)[9-11]合成相關(guān)引物，包括四環(huán)素類耐藥基因（TetA、TetB、TetD）、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（SHV）、氨基糖苷類耐藥基因[aph3′-Ⅱ、aac（6′）-Ib]，引物信息見(jiàn)表 1。引物由生工生物工程（ 上海） 股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇。

將保存的菌株分別劃線接種于MH瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB） ，37? ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng);將EMB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落接種于MH營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12～16 h。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)。

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)[12]（NCCLS）推薦的K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)復(fù)蘇的8株菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，并根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)[13]（CLSI） 標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.2.3 大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)。

以大腸桿菌細(xì)菌基因組DNA為模板對(duì)分離的8株大腸桿菌進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各1 μL，DNA 模板1μL，ddH2O 7 μL，各PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)表2。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株復(fù)蘇

8株菌株在MH上呈灰白色;在MAC上呈磚紅色或粉紅色菌落，在EMB上呈黑綠色金屬光澤菌落。

2.2 藥敏試驗(yàn) 8株大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、4。

由表 3、4可知，四環(huán)素的耐藥率為 100%;對(duì)氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素的高敏率為均87.5%;經(jīng)過(guò)對(duì)這8株菌株的耐藥譜分析發(fā)現(xiàn)，耐3種藥物的菌株有1株，耐2種藥物的菌株有6株，僅有 3號(hào)菌株對(duì)1種藥物耐藥，說(shuō)明該肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉大腸桿菌有嚴(yán)重的多重耐藥性。

2.3 耐藥基因的PCR檢測(cè)結(jié)果 該研究選取了6種耐藥基因，通過(guò)PCR方法對(duì)8株分離菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，8株菌株分別攜帶不同的耐藥基因，具體結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，氨基糖苷類aph3′-Ⅱ基因的檢出率較高，為75.0%;未檢測(cè)到aac（6′）-Ib基因。四環(huán)素類TetD基因的檢出率為62.5%;TetB基因的檢出率較低，為37.5%;未檢測(cè)到TetA基因。也未檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類SHV基因。

3 小結(jié)

隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)牛肉的需求也不斷增加，肉牛規(guī)?；B(yǎng)殖在不斷發(fā)展，抗生素被用于預(yù)防疾病，提高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也刺激細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生對(duì)動(dòng)物疾病的治療有很大的影響，對(duì)健康養(yǎng)殖危害極大。該研究選取2019—2020年從山西省太原地區(qū)某肉牛場(chǎng)分離的8株牛源腹瀉大腸桿菌進(jìn)行敏感藥物篩選試驗(yàn)，其中耐3種藥物的菌株有1株，耐2種藥物的菌株有6株，僅1株菌對(duì)1種藥物耐受;所有菌株對(duì)阿米卡星、卡那霉素、氧氟沙星均高度敏感，可以作為該養(yǎng)殖場(chǎng)的優(yōu)先選擇藥物。所有菌株對(duì)四環(huán)素均耐藥，對(duì)氨基糖苷類藥物慶大霉素的耐藥率均為87.5%。李慧等[14]對(duì)寧夏地區(qū)66株牛源大腸桿菌進(jìn)行耐藥性，檢出顯示慶大霉素的耐藥率為15.15%;高?；鄣萚15]研究結(jié)果表明，寧夏地區(qū)164株?duì)倥８篂a源大腸桿菌對(duì)頭孢唑啉的耐藥率達(dá)到95%。這些報(bào)道表明，不同地區(qū)分離的腹瀉大腸桿菌菌株的耐藥性不同，山西省太原地區(qū)某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)的腹瀉大腸桿菌菌株有其耐藥表征。

對(duì)6種耐藥基因檢測(cè)的結(jié)果表明，該養(yǎng)殖場(chǎng)分離的腹瀉大腸桿菌攜帶的耐藥基因主要是氨基糖苷類aph3′-Ⅱ基因，檢出率為75.0%。四環(huán)素類TetD基因，檢出率為62.5%;TetB基因的檢出率為37.5%。吳同壘等[16]對(duì)秦皇島地區(qū)肉牛腹瀉大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果表明，四環(huán)素類TetD基因檢出率較低，為33.3%，說(shuō)明不同地區(qū)肉牛腹瀉大腸桿菌菌株的耐藥基因存在不同。

因此，在預(yù)防和治療犢牛腹瀉大腸桿菌病時(shí)，要定期進(jìn)行敏感藥物篩選試驗(yàn)，為臨床上合理用藥提供科學(xué)指導(dǎo)，避免長(zhǎng)期使用同樣的藥物，探索新的治療方法。

參考文獻(xiàn)

[1]

荔霞，王勝義，劉永明，等.犢牛腹瀉病因及其藥物防治研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（10）：161-165.

[2] 喻華英，周麗婷.致?tīng)倥８篂a埃希氏菌eaeA基因克隆和序列分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（4）：1-5.

[3] 羅甜甜，王仲兵，雷宇平，等.山西省北部地區(qū)舍飼犢牛大腸桿菌病主要病原的分離和耐藥性調(diào)查研究[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012，29（3）：42-44.

[4] VALAT C，F(xiàn)OREST K，AUVRAY F，et al.Assessment of adhesins as an indicator of pathovar-associated virulence factors in bovine Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol，2014，80（23）：7230-7234.

[5] CONSTABLE P D.Antimicrobial use in the treatment of calf? diarrhea[J].J Vet Intern? Me，2004，18（1）：8-17.

[6] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[7]? PIANCIOLA L，D’ASTEK B A，MAZZEO M，et al.Genetic features of human and bovine Escherichia coli O157：H7 strains isolated in Argentina[J].Int J Med Microbiol，2016，306（2）：123-130.

[8] BLOOD D C，HENDERSON J A.Veterinary medicine[M].Baltimore，Maryland：The Williams and Wilkins Company，1960.

[9] SHAHBAZI S，ASADI KARAM M R，HABIBI M，et al.Distribution of extended-spectrum β-lactam，quinolone and carbapenem resistance genes，and genetic diversity among uropathogenic Escherichia coli isolates in Tehran，Iran[J].J Glob Antimicrob Resist，2018，14： 118-125.

[10] 張金寶，馬春芳，余婷，等.寧夏地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌毒力基因檢測(cè)和耐藥性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，47（1）：177-182.

[11] 岳山，劉宇，劉通，等.黑龍江某牛場(chǎng)腹瀉犢牛大腸桿菌致病株分離鑒定及耐藥性和耐藥基因檢測(cè)[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，28（6）：79-82.

[12] SAIDANI M，MESSADI L，SOUDANI A，et al.Epidemiology，antimicrobial resistance，and extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae in clinical bovine mastitis in Tunisia[J].Microb Drug Resist，2018，24（8）：1242-1248.

[13] 劉少昆.京津部分地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌分離鑒定及耐藥性分析[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[14] 李慧，張華雷，齊亞銀.石河子地區(qū)某規(guī)?；?chǎng)致?tīng)倥８篂a的病原分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（23）：102-104.

[15] 高?；?，高小斐，馮衛(wèi)平，等.寧夏地區(qū)犢牛腹瀉源大腸桿菌的分離鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2019，51（11）：114-117.

[16] 吳同壘，李巧玲，張志強(qiáng)，等.2017—2018年秦皇島地區(qū)犢牛源腹瀉大腸桿菌耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2019（10）：100-104.