董紅紅， 趙子聞， 李 騰， 周小峰

(深圳市長隆科技有限公司 邁葳生物事業(yè)部，廣州 深圳 518116)

化學(xué)法和生物法是廢水中氮去除的主要方法，其中生物法較為經(jīng)濟有效且不會造成二次污染[1-3].好氧條件下進行硝化反應(yīng)，缺氧或厭氧條件下進行反硝化反應(yīng)是傳統(tǒng)的生物脫氮過程，由于對環(huán)境條件的要求不同，這2個過程不能同時發(fā)生，只能依次進行.因此,傳統(tǒng)的工藝硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)發(fā)生在2個不同的反應(yīng)池中，這就造成基建投入大.與傳統(tǒng)的反硝化菌相比，好氧反硝化菌有著生長迅速、耐有機負(fù)荷、脫氮效率高及反硝化反應(yīng)可發(fā)生在好氧條件下等特點[4-7]，避免了硝化和反硝化分離而投入大等缺點.隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展，特別是第三產(chǎn)業(yè)的大量引進，污水的類型也在不斷增加，其中含鹽廢水分布最為廣泛，與傳統(tǒng)的城市污水相比，印染、農(nóng)藥、煤化工、造紙、煉油、海水利用、糧果、制藥等行業(yè)廢水都是高鹽廢水，水中鹽含量偏高[8].水中鹽含量高會降低水中微生物體內(nèi)脫氫酶活性，從而抑制其生長代謝，嚴(yán)重的甚至?xí)斐杉?xì)菌細(xì)胞的質(zhì)壁分離致其破裂死亡，最終降低脫氮效率[9].因此，開發(fā)耐鹽反硝化細(xì)菌非常必要.近年來，針對特殊環(huán)境，國內(nèi)外研究者開展了大量篩選耐鹽反硝化菌株研究，為耐鹽菌的篩選奠定了重要基礎(chǔ)[10-11].目前，耐鹽耐冷氨氧化細(xì)菌已被篩選鑒定，在高鹽低溫的條件下仍具有較好的脫氮效能，之后，耐高氨氮和耐低溫特性的菌株也陸續(xù)被篩選鑒定[12-13].而能夠同時適應(yīng)高鹽廢水并具有高效反硝化脫氮性能的菌種較少[8]，因此篩選耐高鹽的反硝化菌具有十分重要的意義.

1 材料與方法

1.1 樣品來源

所用污泥來自廣東惠州某高鹽污水處理廠A/A/O處理工藝A池出口,取活性污泥.

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH為7.2～7.6.

LB營養(yǎng)培養(yǎng)基的成分及含量：酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH為7.2～7.6.

無機鹽培養(yǎng)基：乙酸鈉2 g/L，硝酸鉀1.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，七水合硫酸亞鐵0.05 g/L，氯化鈣1 g/L，七水合硫酸鎂1.0 g/L，pH為7.2～7.6.

1.3 菌株富集馴化

將5 g的活性污泥接種至硝態(tài)氮(0.5 g/L，鹽度為10 %)的無機鹽培養(yǎng)基中，在30 ℃、鹽度為10 %，180 r/min的搖床上培養(yǎng)1 d，得到第1菌液；吸取10 %的第1菌液轉(zhuǎn)接至硝態(tài)氮(1.5 g/L,鹽度為10 %)的無機鹽培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min的搖床上培養(yǎng)3 d，得到第2菌液；吸取10 %第2菌液轉(zhuǎn)接至硝態(tài)氮(2.0 g/L,鹽度為10 %)的無機鹽培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min的搖床上培養(yǎng)3 d，得到第3菌液.此過程為耐鹽反硝化菌的富集馴化過程[14].

1.4 菌株的純化分離

吸取1 mL馴化后的菌液采用涂布平板法用LB固體培養(yǎng)基進行分離，在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，獲得單菌落;采用平板劃線法把單菌落分別劃線接種至LB固體培養(yǎng)基上，在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，獲得單菌落;之后再重復(fù)以上操作2次(即劃線3)次使其純化[10].

1.5 菌株的鑒定

對篩選出的菌株進行形態(tài)鑒定，將其與《伯杰氏細(xì)菌手冊》進行對照.對篩選出的菌株做革蘭氏染色實驗后，用電子顯微鏡觀察其微觀形態(tài).使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒對篩選出的菌株DNA進行提取，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rRNA基因序列測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中與其他菌種基因序列進行BLAST比對，從而確定所篩出菌株的菌屬.下載親緣關(guān)系較近的菌株16S rRNA基因，并同目標(biāo)菌株通過MAGA 6.0進行親緣關(guān)系分析.

1.6 菌株脫氮效果的影響因素

為了探究不同菌株反硝化脫氮效果，選取從活性污泥中篩選出的3株耐鹽反硝化菌HX-1，IL-3和YFX-6，作為研究對象，設(shè)置菌劑添加量為20 %，在好氧環(huán)境中對提升鹽度10 %的糧果廢水進行16 h處理，并測定硝態(tài)氮脫除效率.反應(yīng)前糧果廢水的硝態(tài)氮含量為110.41 mg/L，總氮含量為122.01 mg/L.以乙酸鈉為碳源，將菌株接種到不同C/N質(zhì)量濃度比的某糧果廢水中，提升鹽度10 %，投加量為20 %，反應(yīng)16 h，考察不同C/N質(zhì)量濃度比對菌株脫氮效果的影響，測定初始和結(jié)束時糧果廢水的硝態(tài)氮；將菌株接種到某糧果污水中，鹽度提升10 %，在不同的溶解氧條件下培養(yǎng)16 h，考察不同溶解氧對菌株脫氮效果的影響，測定初始和結(jié)束時糧果廢水的硝態(tài)氮.將不同量的菌株接種到某糧果污水中，鹽度提升10 %，培養(yǎng)16 h，考察不同接種量對菌株反硝化脫氮效果的影響，測定初始和結(jié)束時糧果污水的硝態(tài)氮；將菌株接種到糧果廢水中，在鹽度10 %的條件下培養(yǎng)不同的時間，考察不同處理時間對菌株脫氮效果的影響，測定初始和結(jié)束時市政污水的硝態(tài)氮.

1.7 測定方法

采用水質(zhì)硝酸鹽氮紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)測定反應(yīng)前后的硝態(tài)氮.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選與鑒定

a.在平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； b.革蘭氏染色后在油鏡下的形態(tài).圖1 菌株YFX-6的形態(tài)特征Fig.1 The Morphological Characteristics of Strain YFX-6

從該污水處理廠A/A/O處理工藝反應(yīng)池出口活性污泥中共篩選出3株耐鹽反硝化菌，分別命名為HX-1，IL-3,YFX-6，其中僅有YFX-6在30 ℃下對硝態(tài)氮的去除率可達(dá)90 %以上.在固體培養(yǎng)基上進行多次劃線分離，挑選生長形態(tài)特征較好的單菌落進行觀察和革蘭氏染色，菌落形態(tài)如圖1所示.菌落呈規(guī)則形狀，圓凸透明，大小統(tǒng)一，直徑2～4 mm，表面濕潤，邊緣平整，革蘭氏染色為陰性，具有運動性，兼氧生長.菌株生長溫度為20～35 ℃，pH為6.0～9.0.最適生長溫度為30 ℃，pH為7.5.通過油鏡觀察，該菌是長桿菌.通過測序,把該株菌的16S rRNA序列同NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，顯示YFX-6菌與TG67鹽單包菌(DQ994161.1)的序列相似度為100 %.將親緣關(guān)系較近的菌株的同基因通過MEGA 6.0進行親緣關(guān)系分析，如圖2所示.通過生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析后，初步確定該菌株為鹽單胞菌(Halomonassp.).

圖2 菌株YFX-6及部分鹽單胞菌屬菌株的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic NJ Tree of Strain YFX-6 and Some Halomonas Strains

2.2 不同菌株對硝態(tài)氮的去除效果

圖3 菌株HX-1,IL-3和YFX-6分別 對高鹽度廢水的硝態(tài)氮去除情況Fig.3 The Removal of Nitrate Nitrogen from High-salinity Wastewater by Strain HX-1,IL-3 and YFX-6,Respectively

如圖3所示，3株反硝化菌選擇添加量占總體積的20 %，處理16 h時，YFX-6菌已在好氧環(huán)境中，對糧果高鹽(10 % NaCl)廢水處理16 h時的硝態(tài)氮脫除效率達(dá)到98.54 %，此時硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為1.68 mg/L.而HX-1菌與IL-3菌反硝化性能顯著低于YFX-6菌，硝態(tài)氮處理效率分別為75.69 %和85.33 %.因此，YFX-6菌的脫氮效果更優(yōu)，可進行后續(xù)研究.從圖3中可以看出，YFX-6菌的脫氮效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HX-1菌與IL-3菌.

2.3 C/N質(zhì)量濃度比的影響

碳源是影響硝化過程的重要因素，反硝化細(xì)菌多為異養(yǎng)型細(xì)菌，異養(yǎng)反硝化細(xì)菌可以以有機物為碳源，硝態(tài)氮為能源進行反硝化作用，其生化過程為5CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2↑+4N2↑+8OH-+能量.碳源濃度的高低影響著反硝化作用的進程.如圖4所示，在YFX-6菌株添加量為20 %，溶解氧(DO)為3.5 mg/L的環(huán)境中好氧反應(yīng)16 h，以乙酸鈉為碳源，分別對C/N質(zhì)量濃度比為2，4，6，8和10的硝態(tài)氮的去除效果進行考察，結(jié)果顯示碳氮質(zhì)量濃度比越高，硝態(tài)氮和總氮的脫除速率越大.C/N質(zhì)量濃度比為2，4，6，8和10處理后的硝態(tài)氮質(zhì)量濃度分別為58.52，33.08，14.23，3.87和10.40 mg/L.YFX-6菌利用NO2-和NO3-為呼吸作用的最終電子受體，把硝酸還原成氮(N2)，其脫氮作用過程：NO3-→NO2-→N2↑.C/N質(zhì)量濃度比為2，4和6時，碳源相對不足，硝態(tài)氮及總氮濃度相對較高，其中硝態(tài)氮脫除效率分別為47.04 %，70.06 %，87.12 %.碳氮質(zhì)量濃度比為8時，碳源濃度適宜，此時硝態(tài)氮和總氮脫除效率分別達(dá)到96.49 %和90.92 %，處理后質(zhì)量濃度分別為3.87，11.09 mg/L，碳氮質(zhì)量濃度比為10時，碳源較為充足，硝態(tài)氮和總氮脫除效率反而有所降低，為90.58 %和86.15 %，在實驗進行中亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度均低于0.36 mg/L，氨氮處于1.07～2.92 mg/L.

2.4 溶解氧的影響

如圖5所示，從評價結(jié)果來看，對比80 r/min(ρ(DO)=1 mg/L)，120 r/min(ρ(DO)=2 mg/L)，150 r/min(ρ(DO)=2.8 mg/L)，180 r/min(ρ(DO)=3.5 mg/L)及230 r/min(ρ(DO)=4.5 mg/L)5個處理組可以看出，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，硝態(tài)氮和總氮的去除率逐漸提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min，相應(yīng)的ρ(DO)為3.5 mg/L，硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為97.28 %,90.20 %，處理后的硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為2.99 mg/L，總氮濃度為11.92 mg/L；搖床轉(zhuǎn)速繼續(xù)提升到230 r/min，相應(yīng)的ρ(DO)為4.5 mg/L，硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為97.88 %和91.33 %，處理后的質(zhì)量濃度分別為2.33，10.55 mg/L，所有處理組中亞硝態(tài)氮和氨氮質(zhì)量濃度分別低于0.42，2.96 mg/L，該菌反硝化性能較好，但氨氧化性能不明顯.綜合考慮，性價比最高的搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，ρ(DO)為3.5 mg/L.

圖4 C/N質(zhì)量濃度比對菌株FX-6去除硝態(tài)氮 和去除總氮的影響Fig.4 The Effect Mass Concentration Ratio of C/N on the Removal of Nitrate Nitrogen and Removal of Total Nitrogen by Strain FX-6

圖5 不同轉(zhuǎn)速對菌株FX-6去除硝態(tài)氮和 去除總氮的影響Fig.5 The Effect of Different Speeds on the Removal of Nitrate Nitrogen and Removal of Total Nitrogen by Strain FX-6

2.5 接種量的影響

在鹽度為10 %的水體中，鹽含量會抑制水中微生物的活性.因此，水體中菌種的初始投加量對其硝態(tài)氮脫除效果影響較大.在C/N質(zhì)量濃度比為8，分別投加菌液5 %，10 %，15 %，20 %，25 %和30 %(體積分?jǐn)?shù))，對糧果廢水處理16 h，ρ(DO)保持為3.5 mg/L的條件下，觀察接種量對菌株FX-6去除硝態(tài)氮和總氮的影響，見圖6.結(jié)果表明，當(dāng)菌株添加量為5 %～15 %時，菌株投加量越大，硝態(tài)氮和總氮脫除效率越高；當(dāng)添加菌株體積分?jǐn)?shù)為20 %時，YFX-6菌脫氮效率較高，性價比最高，其中硝態(tài)氮去除率為97.09 %、總氮去除率為90.36 %，此時硝態(tài)氮和總氮質(zhì)量濃度分別為3.23，11.79 mg/L；繼續(xù)增加菌株體積分?jǐn)?shù)為25 %和30 %時，總氮去除率提升不明顯，硝態(tài)氮去除率提升也較低，在添加菌株體積分?jǐn)?shù)為25 %和30 %時硝態(tài)氮去除率分別為97.12 %和97.33 %，處理后質(zhì)量濃度分別為3.20，2.96 mg/L.當(dāng)添加不同體積分?jǐn)?shù)的菌株時各組亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度均較低，最高值僅為0.47 mg/L.各組氨氮去除效果不明顯，其含量為1.21～2.44 mg/L，體現(xiàn)出該菌不具備明顯的氨氧化能力.

2.6 處理時間的影響

反硝化時間也是影響硝態(tài)氮和總氮去除率的一個重要因素，時間過短，反硝化進行不徹底；時間過長，反硝化進行完全，但成本增加.在添加YFX-6菌株體積分?jǐn)?shù)為20 %，ρ(DO)為3.5 mg/L的條件下分別考察0，5，10，13，16，19和23 h的硝態(tài)氮和總氮去除效果，實驗結(jié)果見圖7，可以看出，硝態(tài)氮和總氮的去除率均隨著時間的增加逐漸升高.其中，處理16 h時，YFX-6菌脫氮效率最高，硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為98.69 %和92.36 %，此時硝態(tài)氮和總氮質(zhì)量濃度分別為1.45，9.39 mg/L；不同處理時間組中氨氮的質(zhì)量濃度為1.79～2.91 mg/L，該菌氨氧化性能不明顯，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度也都低于0.39 mg/L，未發(fā)現(xiàn)亞硝態(tài)氮積累現(xiàn)象.從性價比綜合考慮，16 h為最佳的反應(yīng)時間.

圖6 接種量對菌株FX-6去除硝態(tài)氮和總氮的影響Fig.6 The Effect of Inoculation Amount on the Removal of Nitrate Nitrogen and Total Nitrogen by Strain FX-6

圖7 不同處理時間對菌株FX-6去除 硝態(tài)氮和總氮的影響Fig.7 The Effect of Different Treatment Time on the Removal of Nitrate Nitrogen and Total Nitrogen by Strain FX-6

3 結(jié) 論

本實驗從某污水處理廠A/A/O處理工藝反應(yīng)池出口活性污泥中篩選出一株耐鹽異氧反硝化菌YFX-6，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明其與鹽單胞菌(Halomonassp)同源性較高，且為革蘭氏陰性菌.所篩選出的3株耐鹽菌中YFX-6菌硝態(tài)氮去除效果最好，其對硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為110.41 mg/L的高鹽糧果廢水處理16 h后脫氮效果為98.54 %，此時硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為1.68 mg/L.在碳氮質(zhì)量濃度比為8時，硝態(tài)氮和總氮的脫除效率最高，分別達(dá)到96.49 %和90.92 %；溶解氧質(zhì)量濃度為3.5 mg/L時，YFX-6硝態(tài)氮和總氮去除率已達(dá)較高水平，分別為97.28 %和90.20 %；接種菌株體積分?jǐn)?shù)為20 %時綜合性價比最高，YFX-6菌硝態(tài)氮去除率為97.09 %，總氮去除率為90.36 %，處理16 h時該菌硝態(tài)氮和總氮達(dá)最高去除率，分別為98.69 %和92.36 %.

與傳統(tǒng)的缺氧/厭氧反硝化菌相比，好氧反硝化菌具有生長繁殖快、耐有機負(fù)荷、脫氮效率高、對環(huán)境的適應(yīng)能力強，反硝化反應(yīng)可發(fā)生在好氧條件下等特點，在高鹽廢水的脫氮應(yīng)用方面具有很大意義.本研究篩選出的好氧耐鹽菌YFX-6能在高鹽含量(10 %鹽度)的廢水中生長繁殖并在好氧條件下發(fā)揮出較好的脫氮性能，這對高鹽廢水總氮的處理具有重要意義.