詹奇，楊欣

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)外三科，黑龍江哈爾濱 150000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部一病房，黑龍江哈爾濱 150000

顱內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤之一為腦膠質(zhì)瘤，目前研究未發(fā)現(xiàn)其徹底根治的療法，故此治療膠質(zhì)瘤、提升生存率已成為神經(jīng)外科領(lǐng)域中的診療難點(diǎn)。目前外科手術(shù)只能盡力全部切除，輔助放療和化療等方法的療效仍不理想，患者往往在術(shù)后一段時(shí)間復(fù)發(fā)，難以根治。聲動(dòng)力療法（SDT）原理為超聲能夠激活光敏劑中的某些卟啉類增敏劑效應(yīng)，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，其組織穿透性更深[1-2]。SDT療法在體外和體內(nèi)同時(shí)具有抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用。凝血酶受體（PAR）-1可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，使腫瘤細(xì)胞的致瘤性增強(qiáng)；同時(shí)，PAR-1能增加體外腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中各種成分的粘附性，使細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移過(guò)程加快，從而誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)因子的合成及分泌，被認(rèn)為是一種潛在的促血管生長(zhǎng)因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[3-4]。阿加曲班是一種新型凝血酶抑制劑藥物，它能夠可逆地、高選擇性地和凝血酶活性相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，以此來(lái)阻斷由凝血酶催化的一系列復(fù)雜凝血過(guò)程，抑制血凝塊中的凝血酶活性[5-6]。該研究于2020年7月—2021年7月探討應(yīng)用阿加曲班聯(lián)合聲動(dòng)力治療C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果，結(jié)果可見(jiàn)二者聯(lián)合治療可提高抑瘤率，為臨床阿加曲班聯(lián)合聲動(dòng)力療法治療腦膠質(zhì)瘤奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

細(xì)胞系：C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。主要試劑：DMEM，10% 新生小牛血清，0.25% 胰酶，血卟啉甲醚（HMME），阿加曲班，兔抗鼠PAR-1抗體。

1.2 方法

1.2.1 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)選取10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，將C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中，常規(guī)2～3 d換液，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞，將其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。隨機(jī)分為4組，A組：空白對(duì)照組，不給予藥物治療。B 組：聲動(dòng)力（SDT）組。C 組：阿加曲班組。D組：聲動(dòng)力+阿加曲班組。

1.2.2 Real-time PCR 檢測(cè) 用三唑溶液（Invitrogen）分離細(xì)胞RNA。然后，利用PrimeScriptTM RTMaster Mix 將RNA 反 向 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA。RT-qPCR 是 與SYBR 預(yù)混料Ex-Taq-Ⅱ在480 儀器上實(shí)施。采用比較Ct法檢測(cè)基因表達(dá)。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)Wnt 蛋白表達(dá)，培養(yǎng)每組5×106個(gè)細(xì)胞，裂解細(xì)胞，25 μg 蛋白樣品；依次經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟；通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)蛋白表達(dá)，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析各蛋白條帶相對(duì)吸光度，并作定量計(jì)算。選用B-actin為內(nèi)參對(duì)照組。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞，接種于96 孔板，每孔100 μl，每孔為8×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)計(jì)5個(gè)復(fù)孔。加入氯化鈷、不同濃度VEGF抗體藥液處理24 h 后，每孔加入檢測(cè)溶液（5 mg/mL）20 μl，37℃孵育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔再加入200 μl 二甲基亞砜，作用10 min。以空白孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度，重復(fù)3次，計(jì)算各組數(shù)據(jù)均值。以對(duì)照組細(xì)胞活性為100%，處理組吸光度值與對(duì)照組比值×100%即為實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞活性。

1.2.5 FCM 法檢測(cè)C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)胰酶消化、放入離心機(jī)離心，培養(yǎng)液懸浮，制成單細(xì)胞懸液5 mL，放入直徑1.0 cm 的10 mL 玻璃試管中，分組SDT 處理。4 組細(xì)胞繼續(xù)避光培養(yǎng)6 h，離心棄上清收集細(xì)胞，PBS 溶液洗滌2 次，75%酒精固定，制備5×106的單細(xì)胞懸浮液1 mL，4℃放置24 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)4組腫瘤細(xì)胞的凋亡率情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果

聲動(dòng)力療法治療后通過(guò)Real-time PCR 檢測(cè)PAR-1 表達(dá)情況，結(jié)果顯示聲動(dòng)力療法治療后，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PAR-1 表達(dá)較治療前顯著升高，見(jiàn)圖1。聲動(dòng)力組治療后PAR-1 表達(dá)水平為（7.844±0.288），與對(duì)照組（4.844±0.184）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.416，P＜0.05)。

圖1 聲動(dòng)力治療前后Real-time PCR 檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PAR-1的mRNA表達(dá)情況

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

聲動(dòng)力療法治療后通過(guò)Western blot 檢測(cè)PAR-1表達(dá)情況，結(jié)果顯示聲動(dòng)力療法治療后，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PAR-1 表達(dá)較治療前顯著升高，見(jiàn)圖2。聲動(dòng)力組治療后PAR-1 表達(dá)為（9.874±0.273），與對(duì)照組（4.746±0.167）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.511，P＜0.05)。

圖2 聲動(dòng)力治療前后Western blot檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PAR-1的蛋白表達(dá)情況

2.3 MTT法檢測(cè)結(jié)果

SDT+阿加曲班組與其他3 組比較，抑瘤率顯著升高；阿加曲班組、SDT 組抑瘤率較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 FCM檢查結(jié)果

SDT+阿加曲班組與其他3 組比較，凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；阿加曲班組、SDT組凋亡率較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 4組MTT法檢測(cè)FCM檢查抑瘤率、凋亡率比較[(±s),%]

表1 4組MTT法檢測(cè)FCM檢查抑瘤率、凋亡率比較[(±s),%]

組別SDT+阿加曲班組阿加曲班組SDT組對(duì)照組抑瘤率62.36±11.34 15.76±10.12 14.36±9.24 0.01±7.12凋亡率39.36±4.56 12.36±5.23 11.56±4.12 1.36±0.12

3 討論

聲動(dòng)力療法（SDT）是目前研究發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤治療方法，它來(lái)源于光動(dòng)力療法，是1989年由Umemura等在研究超聲診斷和血卟啉的協(xié)同效應(yīng)而發(fā)展成的。大量實(shí)驗(yàn)證明SDT在體內(nèi)及體外具有抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用，由于SDT 相比PDT 有更深的組織穿透性，超聲亦能激活原為光敏劑的某些卟啉類增敏劑而殺傷腫瘤細(xì)胞[7-9]。超聲能夠穿透深部組織而激活增敏劑；光、聲動(dòng)力聯(lián)合治療其原理為激活共同的增敏劑，產(chǎn)生更多的毒性物質(zhì)，從而增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。

Billroth 于1878年在實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)的基礎(chǔ)上提出觀點(diǎn)為在腫瘤轉(zhuǎn)移和凝血機(jī)制之間存在某種聯(lián)系的假說(shuō)理念，使廣大學(xué)者對(duì)凝血系統(tǒng)和腫瘤的關(guān)系進(jìn)行了深入廣泛的研究[10]。相關(guān)研究證實(shí)了凝血酶存在于多種類型的腫瘤細(xì)胞中，從而解釋了在腫瘤患者中出現(xiàn)的高凝現(xiàn)象，但并不能完全解釋凝血酶與腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在直接、密切的關(guān)聯(lián)[11-13]。有研究證實(shí)，凝血酶能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移功能，因?yàn)槟副旧砭哂写龠M(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)的能力，其促血管生成作用在雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)此研究效應(yīng)是通過(guò)特殊凝血酶受體PAR-1 介導(dǎo)協(xié)同完成的，與纖維素的形成無(wú)關(guān)聯(lián)[14]。凝血酶在腫瘤的血管形成發(fā)展中起到了重要的作用，是腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的必要條件。凝血酶可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，腫瘤細(xì)胞的致瘤性增強(qiáng)，能增加腫瘤微環(huán)境中各種成分的粘附聚集，細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移過(guò)程不斷加快，從而誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)因子的分泌合成，其被認(rèn)為是一種潛在的促血管生長(zhǎng)因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。

阿加曲班是一種新型的凝血酶抑制劑藥物，它能夠可逆地、高選擇地與凝血酶活性相關(guān)位點(diǎn)相結(jié)合，中斷凝血酶催化的一系列凝血過(guò)程。臨床應(yīng)用于腦血栓、腦梗塞、靜脈竇血栓治療中，并取得良好效果。以往的研究中，阿加曲班可抑制PAR-1 表達(dá)水平，MTT 法檢測(cè)阿加曲班組的抑瘤率為（14.25±9.36）%，與其他組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與該研究結(jié)果相吻合；該研究中，MTT 法檢測(cè)SDT+阿加曲班組的抑瘤率為（62.36±11.34）%，與其他三組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；阿加曲班組的抑瘤率（15.76±10.12）%較對(duì)照組抑瘤率高，但較SDT+阿加曲班組抑瘤率低(P＜0.05)；SDT 組（14.36±9.24）%較對(duì)照組（0.01±7.12）%高，但較SDT+阿加曲班組低(P＜0.05)。有學(xué)者用膠原酶Ⅳ誘導(dǎo)大鼠腦出血模型，研究結(jié)果可見(jiàn)，應(yīng)用阿加曲班72 h能顯著減輕腦水腫，血腫未見(jiàn)擴(kuò)大；應(yīng)用阿加曲班24 h能抑制多形核白細(xì)胞的滲出，抑制單核-巨噬細(xì)胞的活性。故此，阿加曲班能減輕腦出血后伴發(fā)腦水腫在內(nèi)的繼發(fā)性腦損傷病例[15-16]。Huang J 等[15]研究指出，凝血酶通過(guò)誘導(dǎo)腦水腫發(fā)展形成、增殖細(xì)胞和生成血管的作用，引發(fā)膠質(zhì)瘤患者不良的預(yù)后反應(yīng)。而應(yīng)用阿加曲班治療，通過(guò)抗凝血酶能夠減輕腦水腫發(fā)展程度，減慢膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)速度，從而改善腫瘤導(dǎo)致的神經(jīng)性功能障礙情況[16-18]。該文中，Real-time PCR 檢測(cè)顯示，聲動(dòng)力組治療后PAR-1 表達(dá)水平為（7.844±0.288），與對(duì)照組（4.844±0.184）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Western blot 檢測(cè)顯示，聲動(dòng)力組治療后PAR-1 表達(dá)為（9.874±0.273），與對(duì)照組（4.746±0.167）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SDT+阿加曲班組與其他3組比較，凋亡率顯著升高；阿加曲班組、SDT組抑瘤率較對(duì)照組高(P＜0.05)。

綜上所述，應(yīng)用阿加曲班聯(lián)合聲動(dòng)力治療C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，可以提高抑瘤率，為臨床應(yīng)用阿加曲班聯(lián)合聲動(dòng)力治療腦膠質(zhì)瘤的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。