王雪琪，羅世城，馬 瑩，李 莉，李立安，李亞里，翟青枝，孟元光

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 婦產(chǎn)科，北京 100853

宮頸癌是世界范圍內(nèi)女性的第四大常見(jiàn)腫瘤，2020年全球約有60.4萬(wàn)例新發(fā)病例和34.2萬(wàn)例死亡病例，80%以上發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]。高危型人乳頭瘤病毒(high risk-human papilloma virus，HR-HPV)的持續(xù)感染已明確為宮頸病變甚至癌變的危險(xiǎn)因素[2]。大部分HR-HPV感染女性可通過(guò)自身免疫能力將其從體內(nèi)清除，但仍有5% ～10%的感染女性無(wú)法自行清除，從而導(dǎo)致持續(xù)性HR-HPV感染[3]。宮頸錐切術(shù)是高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)的主要治療方式之一，但仍有5% ～ 16%的HSIL患者在進(jìn)行錐切手術(shù)后進(jìn)展為宮頸癌[4-5]。治療后HR-HPV持續(xù)感染是疾病進(jìn)展的高危因素，但導(dǎo)致持續(xù)感染的原因尚未明確。有研究顯示，陰道微生態(tài)的變化與宮頸 HR-HPV 持續(xù)感染及宮頸病變有一定相關(guān)性[6-7]。目前國(guó)內(nèi)陰道微生態(tài)相關(guān)研究主要集中在形態(tài)學(xué)檢測(cè)，具有較強(qiáng)的主觀性[8]。本研究采用高通量測(cè)序，針對(duì)16S rRNA V3 + V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，進(jìn)而更為準(zhǔn)確、客觀地反映出陰道微生態(tài)的構(gòu)成，比較HSIL患者術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)陰組、HR-HPV陽(yáng)性組和對(duì)照組的宮頸菌群組成和多樣性。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 對(duì)象概況：經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)同意(S2018-221-01)，簽署知情同意書(shū)，入組解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心2020年9月- 2021年9月因HSIL行宮頸錐切手術(shù)的患者116例，根據(jù)術(shù)后3個(gè)月復(fù)查結(jié)果，術(shù)后持續(xù)感染24例。為避免樣本量差異造成偏差，根據(jù)年齡及體質(zhì)量指數(shù)進(jìn)行1∶1∶1配比，納入術(shù)后轉(zhuǎn)陰的患者及同期門(mén)診體檢的健康受試者各24例。術(shù)后持續(xù)感染組和術(shù)后轉(zhuǎn)陰組的納入標(biāo)準(zhǔn)：1)HR-HPV陽(yáng)性的HSIL患者；2) 3 d內(nèi)無(wú)性生活或陰道灌洗；3) 1周無(wú)抗生素或陰道用藥；4)無(wú)宮頸手術(shù)史(錐切、LEEP)；5)采樣前1周無(wú)異常子宮出血；6) 1周內(nèi)無(wú)性激素使用；7)取材前未行陰道消毒；8)非孕期或哺乳期的育齡女性；9)無(wú)急性期的陰道或盆腔炎性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)錐切手術(shù)后切緣陽(yáng)性者；2)錐切病理結(jié)果為宮頸癌；3)術(shù)后3個(gè)月內(nèi)有性生活但未使用工具避孕；4)惡性腫瘤、免疫性疾病患者。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)除HR-HPV陰性外，余標(biāo)準(zhǔn)同上。

2 樣本采集及處理 無(wú)菌棉拭子在婦科檢查時(shí)留取宮頸分泌物，置于-80℃保存。待臨床結(jié)果回報(bào)后進(jìn)行分組。根據(jù)Swab Genomic DNA kit試劑盒(康為世紀(jì))說(shuō)明書(shū)對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/μL。用341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGACTC NNGGGTATCTAAT-3')引物對(duì)V3 + V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒(Thermofisher)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

3 生物信息學(xué)分析 對(duì)Illumina NovaSeq 測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控、過(guò)濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類(lèi)和物種分類(lèi)分析，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的菌群豐度分布情況。以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs，共有3 720個(gè)OTUs，其中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs數(shù)目為3 240(87.10%)，注釋到界水平的比例為87.10%，門(mén)水平的比例為62.47%，綱水平的比例為61.94%，目水平的比例為59.09%，科水平的比例為52.28%，屬水平的比例為39.70%。然后對(duì)OTUs序列與Silva132數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋。根據(jù)物種注釋情況，進(jìn)一步計(jì)算α多樣性與β多樣性，并進(jìn)行組間差異的比較。α多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。Chao1在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，Shannon、Simpson指數(shù)用來(lái)評(píng)估菌群的多樣性，Shannon值越大，多樣性越高， Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低，通過(guò)α組間差異分析，初步判斷各組間微生物群落結(jié)構(gòu)的組成相似性，根據(jù)樣本所屬生態(tài)類(lèi)別進(jìn)行分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究數(shù)據(jù)一般資料為非正態(tài)分布的計(jì)量資料，以Md(IQR)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。使用R Studio，STAMP(v.2.1.3)軟件對(duì)于數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，微生物含量數(shù)據(jù)組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三組一般資料比較 對(duì)各組受試者的年齡及體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)進(jìn)行正態(tài)分布驗(yàn)證，顯示為偏態(tài)分布，使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)受試者基礎(chǔ)信息，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)，入組人群具有可比性。

表1 三組受試者一般資料比較[Md(IQR)]Tab. 1 Basic imformation in the three groups (Md[IQR])

2 宮頸菌群分布 對(duì)宮頸菌群進(jìn)行物種分布分析，三組人群宮頸菌群在屬水平均以乳桿菌屬(Lactobacillus)為優(yōu)勢(shì)菌。根據(jù)樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度前10名的菌屬進(jìn)行聚類(lèi)并繪制柱狀圖(圖1)?？煽吹饺M宮頸微生物優(yōu)勢(shì)菌屬存在明顯的差異。乳酸桿菌為豐度最高的菌，在三組內(nèi)均為高豐度。奇異菌屬(Atopobium)為豐度第2高的菌，該菌屬相對(duì)豐度在轉(zhuǎn)陰組中最高。加德納菌(Gardnerella)為豐度第3高的菌，在陽(yáng)性組中相對(duì)豐度更高。

圖1 三組患者宮頸菌群屬水平物種分布柱狀圖Fig.1 Histogram of species distribution at genus level of cervical microflora in the three groups

3 組間聚類(lèi)分析 根據(jù)樣本屬水平的物種注釋及豐度信息，選取前35名的菌進(jìn)行聚類(lèi)分析，繪制熱圖(圖2)。其中可看到三組菌群優(yōu)勢(shì)菌屬存在明顯的差異，除了共有的乳酸桿菌外，陽(yáng)性組以腸球菌為主，轉(zhuǎn)陰組以葡萄球菌、棒狀桿菌屬為

圖2 三組宮頸菌群豐度聚類(lèi)圖Fig.2 Cluster diagram of species abundance of cervical microflora in the three groups

主，對(duì)照組則以雙歧桿菌屬、克雷伯氏菌屬為主。

4 α多樣性分析 本研究結(jié)果顯示, Chao1指數(shù)P均＞0.05，組間物種總數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明三組物種總數(shù)相仿。而陽(yáng)性組與轉(zhuǎn)陰組對(duì)比，Shannon指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)，這說(shuō)明兩組的宮頸菌群多樣性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中陽(yáng)性組物種分類(lèi)總數(shù)與群落多樣性高于轉(zhuǎn)陰組。在物種分布的均勻程度(即Simpson指數(shù))的比較中，其中健康對(duì)照組的宮頸菌群群落均勻度高于轉(zhuǎn)陰組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)。而健康對(duì)照組與陽(yáng)性組、轉(zhuǎn)陰組比較，其群落多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 三組間宮頸菌群α多樣性指數(shù)Fig.3 Alpha diversity index of cervical microflora among the three groups

5 β多樣性分析 β多樣性對(duì)不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析，距離矩陣熱圖顯示三組兩兩對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)?；贚DA將三組做LEfSe分析對(duì)比三組差異菌屬，評(píng)估顯著差異菌屬的影響力，篩選出LDA＞4的菌屬，認(rèn)為是影響力大的菌屬。三組比較，其中轉(zhuǎn)陰組中影響力較大的為棒狀桿菌屬(圖5A)。兩兩比較中，陽(yáng)性組與轉(zhuǎn)陰組對(duì)比分析檢測(cè)出4個(gè)影響力較大的菌(圖5B)，均集中在轉(zhuǎn)陰組，在目、科、屬、種水平均為棒狀桿菌。陽(yáng)性組與對(duì)照組、轉(zhuǎn)陰組與對(duì)照組均未篩選出LDA＞4的差異菌屬。

圖4 三組間β多樣性指數(shù)熱圖Fig.4 Heat map of beta diversity index among the three groups

圖5 LDA值分布圖Fig.5 Histogram of LDA value distribution

取相對(duì)豐度前10的菌群，在門(mén)水平做UPGMA聚類(lèi)分析(圖6)，可以看到陽(yáng)性組與轉(zhuǎn)陰組較為相似，與對(duì)照組差異較大，優(yōu)勢(shì)菌群均以厚壁菌門(mén)(Firmcutes)為主。

圖6 三組門(mén)水平 Top10菌群UPGMA聚類(lèi)樹(shù)Fig.6 UPGMA clustering tree of the top 10 microflora at phylum level among the three groups

6 差異菌種分析 經(jīng)Meta Stat分析篩選具有差異的物種(圖7)，在轉(zhuǎn)陰組與對(duì)照組的對(duì)比中，單胞菌屬(Stenotrophomonas)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)、擬桿菌屬(Bacteroides)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且均在對(duì)照組中相對(duì)豐度較高。在陽(yáng)性組以及轉(zhuǎn)陰組的對(duì)比中，鏈球菌屬(Streptococcus)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，單胞菌屬、擬桿菌屬、韋榮球菌屬(Veillonella)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，以上菌屬在陽(yáng)性組中豐度更高；而在陽(yáng)性組與對(duì)照組對(duì)比中，存在差異的菌屬較多(P＜0.05)，分別為支原體菌屬、漫游球菌屬、依格納季氏菌，且在健康組中相對(duì)豐度較高。

圖7 三組屬水平Meta Stat組間差異分析熱圖Fig.7 Heatmap based on MetaStat analysis among the three groups at genus level

討 論

全球大多數(shù)女性在其一生中至少感染過(guò)一次HR-HPV，80%的感染者在2年內(nèi)可自然清除。有少部分患者因持續(xù)感染發(fā)展為宮頸病變、宮頸癌[9]?，F(xiàn)有研究已證實(shí)，高齡、合并感染、病毒類(lèi)型、癌基因整合與過(guò)度表達(dá)、免疫逃逸均為HPV持續(xù)感染的危險(xiǎn)因素[10]。盡管通過(guò)宮頸錐切術(shù)的治療，仍有部分患者持續(xù)感染HR-HPV，且發(fā)生宮頸癌的概率是健康人群的5倍[5]。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，陰道微生態(tài)會(huì)影響HR-HPV的感染或清除[11]。菌群失調(diào)是最常見(jiàn)的一種微生態(tài)失衡形式，即陰道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬乳酸桿菌大量減少，乳酸產(chǎn)生減少，陰道的pH值上升，陰道對(duì)病原菌的抵抗力降低，進(jìn)而導(dǎo)致了各種陰道炎的發(fā)生，同時(shí)也為HR-HPV的侵襲和繁殖提供了便利。解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心統(tǒng)計(jì)了2019年1月- 2020年5月行錐切術(shù)女性3個(gè)月后的HR-HPV和TCT結(jié)果，HR-HPV轉(zhuǎn)陰率為73.04%[12]，明顯高于現(xiàn)有報(bào)道的25.8% ～ 73.8%[13]。依據(jù)年齡、BMI按1∶1∶1分別配比24例術(shù)后轉(zhuǎn)陰者及健康受試者入組。配比雖然不能直接控制混雜因素，但提高了控制混雜因素的效率，一定程度減少偏倚，增加可比性。

本研究α多樣性提示三組人群均以乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道相同[14]。國(guó)內(nèi)有研究檢測(cè)不同級(jí)別宮頸病變女性的陰道微生態(tài)，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變級(jí)別升高，陰道微生態(tài)多樣性也隨之升高[15]。本研究中持續(xù)感染組宮頸群落多樣性高于轉(zhuǎn)陰組，轉(zhuǎn)陰組宮頸群落多樣性高于對(duì)照組，提示宮頸微生態(tài)紊亂患者錐切術(shù)后易于持續(xù)感染。進(jìn)一步分析其原因可能為其他菌群多樣性增高，病原體大量繁殖并生長(zhǎng)，使陰道菌群失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)菌性陰道病、需氧菌陰道炎等。這些致病菌產(chǎn)生的有害物質(zhì)如亞硝酸銨等增多，干擾陰道局部免疫系統(tǒng)，使機(jī)體抗感染能力下降，增加了各種宮頸疾病的患病率[16]。持續(xù)感染組中的另一豐度較高的腸球菌有極強(qiáng)的耐藥性[17]。有研究證實(shí)腸球菌能產(chǎn)生有害化學(xué)物質(zhì)，破壞DNA，改變一些腸道寄生細(xì)菌的生長(zhǎng)、分裂方式，甚至還會(huì)增強(qiáng)致癌基因的活動(dòng)，但該菌與HR-HPV持續(xù)感染的關(guān)系仍需要相關(guān)研究證實(shí)[18]。轉(zhuǎn)陰組中的葡萄球菌是條件致病菌，可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，并且該菌分泌的凝固素可使感染局限，促進(jìn)致病菌的清除。雙歧桿菌作為HR-HPV陰性人群相對(duì)豐度較高的菌屬，對(duì)人體健康具有生物屏障、營(yíng)養(yǎng)、抗腫瘤、免疫增強(qiáng)、改善胃腸道功能、抗衰老等多種重要的生理功能。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可激活機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬活性，而有助于抑制腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，被認(rèn)為是維持宮頸微生態(tài)平衡的重要菌群[19]。

β多樣性分析中，三組菌群結(jié)構(gòu)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與錐切后持續(xù)感染病例過(guò)少有關(guān)，也可能與隨訪時(shí)間較短有關(guān)[20]。大多數(shù)隨訪區(qū)間為6個(gè)月、6 ～ 12個(gè)月、大于12個(gè)月，其中持續(xù)感染組有一部分人群尚處于HPV清除階段，若延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，轉(zhuǎn)陰率也許會(huì)更高，兩組的菌群差異會(huì)更為明顯。本研究為避免術(shù)后因性生活帶來(lái)的干擾因素，根據(jù)錐切術(shù)后醫(yī)囑，選擇了術(shù)后3個(gè)月為復(fù)查節(jié)點(diǎn)。聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖中可以看到，術(shù)后持續(xù)陽(yáng)性組與術(shù)后轉(zhuǎn)陰組菌群結(jié)構(gòu)較為相似，但與對(duì)照組差異較大，提示宮頸微生態(tài)在一定程度上受HSIL疾病本身的影響，這與我們前期研究結(jié)果相符[21]。聚類(lèi)分析中，三組門(mén)水平上厚壁菌門(mén)(Firmcutes)占主導(dǎo)地位，這與既往研究一致[22]。消化鏈球菌是人體口腔、上呼吸道、腸道和女性生殖道的正常菌群，可引起人體各部組織和器官感染，多見(jiàn)與混合感染[23]。該結(jié)果提示造成錐切術(shù)后預(yù)后差異的因素，可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)，消化鏈球菌可能成為新的生物標(biāo)志物。

綜上所述，高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變與宮頸微生態(tài)相關(guān)，術(shù)前宮頸微生態(tài)可能是影響術(shù)后HRHPV轉(zhuǎn)歸的重要因素，但由于本研究樣本量較少，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。宮頸菌群分析中，消化鏈球菌是促進(jìn)轉(zhuǎn)陰的重要微生物，但其對(duì)機(jī)體消除HR-HPV的機(jī)制仍需大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。在HSIL患者術(shù)后應(yīng)注意糾正陰道微生態(tài)平衡，這有利于宮頸癌的防治。