周瑞平 由 林 劉 鑫 李凱雄 郭 麗 梁又德

牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）來源于牙周膜組織，具有強大成骨能力，能夠在體內(nèi)形成骨組織、牙周韌帶等結(jié)構(gòu)［1］。已有研究證實，PDLSCs 在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下和動物模型中都表現(xiàn)出成骨潛力，可產(chǎn)生牙周膜樣組織，促進缺損部位修復(fù)、再生及重建［2，3］。有報道稱，miRNA 在PDLSCs 成骨分化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［4］。骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體來源的miR-206可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達，促進骨關(guān)節(jié)炎中成骨細胞的增殖和分化［5］?；谝陨涎芯浚茰ymiR-206 可能參與調(diào)控PDLSCs 的成骨分化。本研究通過過表達/敲降PDLSCs 中miR-206 表達水平，探討其對PDLSCs 成骨分化的影響及可能作用機制，旨在為促進PDLSCs 介導(dǎo)的骨再生研究提供新的思路和方法。

1.材料和方法

1.1 樣本收集 經(jīng)本院倫理委員會批準，志愿者知情同意，收集其拔除的正畸牙或第三磨牙，收集的離體牙需滿足以下條件：（1）年齡14～18歲；（2）牙根完整，無牙周炎、根尖周炎、齲齒等疾??；（3）無其他全身系統(tǒng)疾病。將牙齒置于含有5%雙抗、10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基中，2 h 內(nèi)進行牙周膜組織取材及原代細胞培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒、茜素紅S染色液購自碧云天公司；MTT 溶液購自美國Thermo Fisher Scientific公司；α-MEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公 司；Anti-CD34 PE、Anti-CD45 PE、Anti-CD105 FITC、Anti-CD90 FITC、Anti-CD73 FITC、購自美國eBioscience公司；miR-206擬似物（mimics）和mimics陰性對照（negative control，NC）及miR-206抑制劑（inhibitor）和inhibitor-NC、胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）過表達和NC序列及載體質(zhì)粒由廣州銳博生物科技有限公司合成；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸購自美國Sigma公司；兔抗人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因 子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、ALP、IGF-1一抗及山羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司。

IX-70 倒置相差顯微鏡購自日本Olympus 公司；LightCycler480 II 實時熒光定量PCR 儀購自美國Roche公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD 公司；EXL-808 酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3 PDLSCs 的培養(yǎng)和傳代 將牙齒用PBS 沖洗數(shù)遍，清理干凈雜質(zhì)，放入培養(yǎng)液中，刮取根中1/3 的牙周膜，切成約1 mm3大小組織塊，1000 r/min 離心5 min，加入Ⅰ型膠原酶，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中消化，再次離心、重懸，接種，細胞長出后每3 d更換一次培養(yǎng)液。之后采用有限稀釋培養(yǎng)法挑選單克隆續(xù)進行培養(yǎng)，長至80%時傳代、消化、離心，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 PDLSCs 的鑒定 取第三代PDLSCs，消化、離心，PBS 重懸，調(diào)整為5×105個/mL 的密度，分裝至流式管（100 μL/管）。分別添加FITC 偶聯(lián) 的 鼠 抗 人CD90、CD73、CD105 和PE 偶 聯(lián) 的CD45、CD34 單抗，避光反應(yīng)30 min；對照管加入等量PBS，離心、重懸，流式細胞儀鑒定。

1.5 RT-qPCR 檢測成骨誘導(dǎo)前后miR-206表達 第三代PDLSCs 以5×105個/mL 接種于6 孔板，隨機分為空白組和誘導(dǎo)組，各設(shè)5個復(fù)孔。空白組正常培養(yǎng)，誘導(dǎo)組在細胞生長至80%時加入成骨誘導(dǎo)液（10% 胎牛血清、1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50 μg/mL 抗環(huán)血酸），每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后，收集細胞，TRIZOL 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制25 μL 反應(yīng)體系：12.5 μL SYBR?Green Realtime PCR Master Mix，上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，雙蒸水10.5 μL，混勻后，放 入PCR 儀：95℃ 60 s，95℃ 10 s，50℃ 45 s，72℃ 90 s，40個 循 環(huán)，72℃延 伸10 min。以U6 作為內(nèi)參，采用2-△△CT法進行定量分析。所用引物：miR-206 F：CCGAGGCCCACATGCTTCTTTA，R：TTGCCGAAACCACACACTTC；U6 F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染和分組 取第三代PDLSCs，接種于6孔板，細胞隨機分為對照組、miR-206 mimics組、mimics-NC 組、miR-206 inhibitor 組 和inhibitor-NC組，各設(shè)5個復(fù)孔。對照組正常培養(yǎng)，不作轉(zhuǎn)染；其余4 組24 h 后進行轉(zhuǎn)染：將1 μL LipofectamineTM2000與50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻；另將1 μL 含有miR-206 mimics、mimics-NC、miR-206 inhibitor和inhibitor-NC的質(zhì)粒與50 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基混合均勻，靜置20 min 后，將兩種混合物均勻混合，分別加入miR-206 mimics 組、mimics-NC 組、miR-206 inhibitor組和inhibitor-NC組細胞中進行轉(zhuǎn)染，每組各設(shè)5個復(fù)孔。6 h后，將各組培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)21 d。

另取第三代PDLSCs，接種于6 孔板，隨機分為miR-206 mimics+NC 組和miR-206 mimics+IGF-1 組，兩組細胞在轉(zhuǎn)染miR-206 mimics 后，分別轉(zhuǎn)染IGF-1-NC 和IGF-1，轉(zhuǎn)染6 h 后，進行成骨誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)21 d。每組各設(shè)5個復(fù)孔。

1.7 MTT法檢測PDLSCs增殖 將各組PDLSCs以1×105個/mL接種于96孔板，各設(shè)5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，按20 μL/孔加入MTT溶液孵育4 h，離心棄上清，按150 μL/孔加入二甲基亞砜，振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度值（OD）。

1.8 測定ALP活性 取各組細胞，PBS清洗，加入0.2% Triton-X100，12000 r/min離心10 min，4%多聚甲醛固定1 min，PBS清洗，使用ALP試劑盒進行染色，光鏡下呈現(xiàn)紫色的為ALP陽性細胞，酶標儀記錄405 nm波長OD值，計算ALP活性。

1.9 茜素紅染色檢測礦化能力 取各組細胞，PBS 清洗后，加入4%多聚甲醛固定30 min，使用茜素紅染色試劑盒進行染色，光鏡下呈現(xiàn)橙紅色的為礦化結(jié)節(jié)，隨機選取5個不重復(fù)視野，計數(shù)礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.10 RT-qPCR檢測miR-206、IGF-1 mRNA表達RT-qPCR方法同1.5所述。IGF-1以GAPDH為內(nèi)參，所用引物：IGF-1 F：5′-GGATTTCAA GCAGAACTGTGTTTT-3′；R：5′-CCTGGACCTTGAATTTTTTCTTTTT-3′；GAPDH F：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，R：5′-GAA GATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.11 Western blot 檢測蛋白表達 收集各組細胞，加入RIPA 裂解液，離心取上清。BCA 法測定蛋白濃度，100℃水浴變性，上樣行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉液室溫封閉2 h，分別與稀釋的RUNX2、OPN、ALP、GAPDH（均1∶800 稀釋）一抗4℃孵育過夜，洗膜，與HRP 標記的二抗（1∶2000 稀釋）室溫孵育2 h，洗膜。ECL 顯色，Image J軟件分析，結(jié)果以與內(nèi)參灰度值比值表示。

1.12 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-206與IGF-1 靶向性 根據(jù)Target Scan 生物學(xué)軟件進行預(yù)測，IGF-1 為miR-206 的潛在靶基因，獲取miR-206 與IGF-1 的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′-UTR）的 結(jié) 合 位 點，構(gòu) 建IGF-1 3′-UTR 野生型（wild type，WT）和突變型（mutation type，MUT）雙熒光素酶pmir GLO載體。將HPDLSCs 按1×105個/mL 接種到24 孔板，待細胞匯合至80%時，將miR-206 mimics/mimics-NC、miR-206 inhibitor/inhibitor-NC與IGF-1 3′-UTR WT/MUT使用LipofectamineTM2000 共轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，加入裂解液裂解細胞，測量螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。相對熒光素酶活性通過計算二者比值來表示。

1.13 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 進行處理，以（±s）表示計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢測，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 PDLSCs 的分離培養(yǎng) 培養(yǎng)5～7 d 后可見細胞爬出，呈放射狀。約14 d 后，細胞長至80%進行傳代。傳代后的細胞生長加快，呈長梭形，邊緣整齊，胞核呈卵圓形，核仁清晰，排列緊密，在3～5 d可匯合至90%，排列致密，網(wǎng)狀生長（圖1）。

圖1 PDLSCs形態(tài)學(xué)觀察（А：第一代PDLSCs；В：第三代PDLSCs，×100倍，標尺=100 μm）

2.2 PDLSCs 的鑒定 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細胞標志物CD90 表達率為98.69%，CD105 表達率為99.61%、CD73 表達率為99.02%，均呈陽性；而造血干細胞標志物CD34 表達率為5.27%，CD45表達率為6.13%，均呈陰性（圖2）。

2.3 成骨誘導(dǎo)對PDLSCs 中miR-206 表達的影響RT-qPCR 結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組miR-206 表達水平顯著低于空白組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 成骨誘導(dǎo)前后PDLSCs中miR-206表達

2.4 miR-206對PDLSCs增殖的影響MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后細胞OD值減小，而轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor 后，細胞OD 值增加（P＜0.05）（圖4）。表明過表達miR-206可抑制PDLSCs增殖，而敲降miR-206可促進PDLSCs增殖。

圖4 MTT法檢測各組細胞增殖情況

注：與空白組比較，*P＜0.05

2.5 miR-206 對PDLSCs 中ALP 活性和礦化的影響 ALP 染色和茜素紅染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染mi-206 mimics 后細胞ALP 活性降低，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少；而在轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor 后細胞ALP 活性升高，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增加（P＜0.05）（圖5）。表明過表達miR-206可抑制ALP 活性和細胞礦化，而敲降miR-206后作用相反。

圖5 miR-206對PDLSCs中АLP活性和礦化的影響（?。骇P染色和茜素紅染色結(jié)果，×100倍，標尺=100 μm；В：АLP活性；C：礦化結(jié)節(jié)數(shù)）

2.6 miR-206 對PDLSCs 中成骨標志蛋白表達的影響Western blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimics 后，成骨分化標志蛋白RUNX2、OPN 和ALP 表達明顯下降，而轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor 后結(jié)果相反（P＜0.05）（圖6）。表明過表達miR-206可抑制PDLSCs 成骨分化，而敲降其表達可促進PDLSCs成骨分化。

圖6 miR-206對成骨蛋白表達的影響（А：RUNX2蛋白表達量化；В：OPN蛋白表達量化；C：АLP蛋白表達量化；D：RUNX2、OPN、АLP蛋白表達電泳圖）

2.7 miR-206對IGF-1表達的影響RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后，miR-206表達水平顯著升高，而IGF-1 mRNA表達水平明顯下降，轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor后，上述結(jié)果與之相反（P＜0.05）（圖7A、B）。在Western blot中也得到相似結(jié)果，轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后，IFG蛋白表達明顯下降，而轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor后，IGF-1蛋白表達明顯升高（P＜0.05）（圖7C、D），表明過表達miR-206可抑制IGF-表達，敲降其表達后可促進IFG-1表達。

圖7 miR-206調(diào)控IGF-1表達（?。簃iR-206表達量化；В：IGF-1 mRNА表達量化；C：IGF-1蛋白表達量化；D：IGF-1蛋白表達電泳圖）

2.8 miR-206靶向調(diào)控IGF-1 TargetScan生物學(xué)軟件顯示，IGF-1的3′-UTR區(qū)域存在miR-206結(jié)合位點（圖8A）。共轉(zhuǎn)染miR-206 mimics可顯著降低IGF-1 WT相對熒光素酶活性，而與miR-206 inhibitor 共轉(zhuǎn)染后則相反（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-206 mimics/inhibitor均對IGF-1 MUT相對熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05）（圖8B）。

圖8 miR-206靶向調(diào)控IGF-1表達（А：miR-206與IGF-1存在連續(xù)結(jié)合位點；В：相對熒光素酶活性）

2.9 過表達IGF1部分逆轉(zhuǎn)miR-206對PDLSCs成骨分化的抑制ALP 染色、茜素紅染色和Western blot 結(jié)果顯示，與miR-206 mimics+NC 組比較，miR-206 mimics+IGF-1組PDLSCs中ALP活性顯著升高，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量顯著增加，同時成骨分化蛋白RUNX2、OPN 和ALP 表達顯著升高（P＜0.05）（圖9）。表明IGF-1 能部分減弱過表達miR-206 對PDLSCs成骨分化的抑制作用。

圖9 過表達IGF-1逆轉(zhuǎn)miR-206對PDLSCs成骨分化的抑制（А：АLP染色和茜素紅染色結(jié)果，×100倍，標尺=100 μm；В：АLP活性；C：礦化結(jié)節(jié)數(shù)量；D：RUNX2、OPN、АLP蛋白表達量化；E：RUNX2、OPN、АLP蛋白表達電泳圖）

3.討論

正常情況下，牙槽骨維持骨吸收和修復(fù)的動態(tài)平衡，發(fā)生牙周炎等疾病時，牙槽骨的吸收大于其修復(fù)過程，可導(dǎo)致牙周組織缺損，最終造成牙齒松動甚至脫落。近年來牙組織工程逐漸成為重建丟失組織的新方法，PDLSCs具有多種分化潛能和強大自我更新能力，可以分化為成骨細胞和牙骨質(zhì)細胞，在維持和再生中起關(guān)鍵作用，可作為種子細胞，在牙組織再生工程中具有廣泛應(yīng)用前景，如何提高PDLSCs的再生能力，對于促進牙周修復(fù)至關(guān)重要［6，7］。PDLSCs成骨分化受多種細胞因子的調(diào)控，其中miRNA具有潛在調(diào)控作用，本研究首次探討miR-206對PDLSCs成骨分化的影響及其分子機制，結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)后細胞中miR-206表達較低，提示miR-206可能參與PDLSCs成骨分化過程，并在此基礎(chǔ)上對其作用機制作了分析，對于牙周組織再生和修復(fù)具有重要臨床意義。

miR-206參與細胞生長、分化、凋亡和代謝過程，其表達與牙齒發(fā)育過程有關(guān)，可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路調(diào)控牙齒形態(tài)發(fā)育過程［8］。王獻剛等［9］報道，牙髓炎患者牙髓組織中miR-206的表達水平較健康人顯著下調(diào)，表明miR-206與牙周疾病密切相關(guān)。此外，另有研究表明，人間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可通過調(diào)控miR-206促進骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨細胞增殖，有助于軟骨組織修復(fù)［10］。由此，推測miR-206 或與PDLSCs 成骨分化有關(guān)，鑒于此，本研究提取培養(yǎng)PDLSCs并進了行鑒定，結(jié)果顯示細胞間充質(zhì)干細胞標志物和造血干細胞標志物分別呈現(xiàn)陽性和陰性表達，與之前的文獻［11，12］報道一致，PDLSCs培養(yǎng)成功。為觀察miR-206對PDLSCs成骨分化的影響，本研究在誘導(dǎo)前后檢測細胞中miR-206表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)后細胞中miR-206表達水平明顯降低，表明miR-206可能參與PDLSCs成骨分化。進而對PDLSCs分別轉(zhuǎn)染miR-206 mimics和inhibitor，過表達miR-206可抑制PDLSCs增殖，降低ALP活性，減少礦化結(jié)節(jié)形成；而敲降其表達，上述結(jié)果呈相反趨勢。成骨分化相關(guān)蛋白包括RUNX2、OPN和ALP等，RUNX2是骨形成的關(guān)鍵基因，參與成骨分化和骨形成過程；OPN可影響成骨細胞的粘附，常被用作標記蛋白，以測定成骨分化情況；ALP能促進骨基質(zhì)礦化，對骨形成有積極作用。Western blot結(jié)果同樣顯示，過表達miR-206后，RUNX2、OPN和ALP蛋白表達明顯降低，由此表明過表達miR-206 可抑制PDLSCs成骨分化能力。

在進一步的機制研究中，本研究發(fā)現(xiàn)miR-206對IGF具有調(diào)控作用，過表達miR-206可抑制IGF-1表達，敲降其表達后可促進IFG-1表達，推測miR-206可能通過調(diào)節(jié)IGF-1表達，進而影響PDLSCs成骨分化能力。IGF-1與胰島素有相似結(jié)構(gòu)，能夠促進骨細胞和成骨細胞增殖、分化和成熟［13］。Feng等［14］報道，IGF-1可提高細胞中成骨標志物RUNX2、OPN蛋白和mRNA表達，促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化。Yuan等［15］也證實，IGF-1能夠促進MC3T3-E1成骨細胞分化和礦化，并能顯著上調(diào)RUNX2、OPN等成骨相關(guān)基因表達，增加ALP合成。此外，還有研究顯示，使用IGF-1處理小鼠前成骨細胞，可增加ALP活性，增加成骨基因表達，誘導(dǎo)骨形成［16］。以上研究均表明IGF-1可影響成骨相關(guān)基因表達，與細胞成骨分化關(guān)系密切。miRNAs 通過結(jié)合mRNA 的3′-UTR，參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達。本研究通過生物學(xué)信息分析顯示，miR-206與IGF-1存在高度互補序列，IGF-1為miR-206的潛在靶基因，并經(jīng)雙熒光素酶實驗證實miR-206 可通過結(jié)合IGF-1 的3′-UTR，導(dǎo)致IGF-1 mRNA發(fā)生降解，表達水平明顯下降，表明IGF-1為miR-206的靶基因。進一步的共轉(zhuǎn)染實驗中，過表達IGF后miR-206 mimics對PDLSCs 的成骨分化抑制作用被減弱，由此推測miR-206通過靶向抑制IGF-1表達減弱PDLSCs成骨分化能力。

總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)miR-206可抑制PDLSCs增殖，并降低其成骨分化能力，其作用機制可能與靶向抑制IGF-1表達有關(guān)。在進一步的牙組織工程中，通過敲降miR-206表達，加快PDLSCs成骨分化，進而促進丟失牙組織的修復(fù)和重建，可為臨床治療提供新思路和方法。當然，本研究僅在體外細胞水平進行，未來仍需進行體內(nèi)動物實驗驗證上述結(jié)論。