魯 鐵，李 登，朱園園，蘇正嫻，段鵬菲，陳懷中，劉 宇，謝朝暉**

（1.河南城建學院生命科學與工程學院，河南 平頂山 467036；2.暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；3.魯東大學 農學院，山東 煙臺 264025）

血紅密孔菌[Pycnoporus sanguineus（L.）Murrill]又稱血紅栓菌，隸屬擔子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科 （Polyporaceae） 密孔菌屬（Pycnoporus）；分布于我國河南、云南、湖南、陜西、四川、新疆等省份[1]。研究表明[2-4]該菌及其菌絲體發(fā)酵提取物在醫(yī)藥方面有較廣泛應用，如消炎、燒傷后感染的治療、抗腫瘤等。此外，其富含多糖、黃酮等活性物質。隨著食（藥）用菌產業(yè)的發(fā)展，真菌多糖在功能性食品開發(fā)方面具有的潛在價值日益凸顯，如提升免疫力、預防腫瘤、抗疲勞、促進傷口痊愈等[5-9]。

血紅密孔菌的前期研究主要集中在培養(yǎng)、酶學、生態(tài)機制方面，而對其菌絲體多糖的提取及活性相關的研究尚未見報道。因此以血紅密孔菌液體發(fā)酵獲得的菌絲體為原材料，利用超聲輔助法提取多糖成分，通過單因素、多因素試驗獲得最佳提取工藝條件，在最佳條件的基礎上制備的菌絲體為材料進行活性研究，以為血紅密孔菌菌絲體多糖的提取制備以及對深入性的研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與主要設備

血紅密孔菌采自平頂山市魯山縣龍?zhí)秿{景區(qū)，經(jīng)組織分離獲得菌種，保存于河南城建學院生命科學與工程學院菌物標本室，編號為XHMK28542。其菌絲體根據(jù)參考文獻[2，10]的方法制備，放入烘箱60℃烘干至恒重，烘干后用粉碎機粉碎成粒徑為小于75 μm的粉末，過篩，置于密封袋內，凍存于-20℃，備用。

蘆丁標準品，北京索萊寶科技有限公司；Al（NO3）3、FeSO4·7H2O、焦性沒食子酚，天津市科密歐化學試劑有限公司；NaOH、NaNO2，煙臺市雙雙化工有限公司；其他試劑均為分析純。

KQ-50B型超聲儀，昆山市超聲波儀器有限公司；JP-100A-2型紫外分光光度，上海元析儀器有限公司；PE Eenspire型酶標儀，美國PE公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗多糖提取

精確稱取0.1 g菌絲體粉末按照料液比1∶30加入蒸餾水中，80℃熱水超聲輔助浸提15 min，然后使用水浴鍋80℃熱水提取60 min，冷卻至室溫，將粗多糖溶液轉入離心管，加入等體積Sevage溶液 [V（氯仿）∶V（正丁醇）=5∶1]，搖勻震蕩，4 000 r·min-1室溫（25℃） 離心10 min，得上清。按照1∶3的體積比向上清中添加95%的乙醇并在4℃醇沉過夜，后于4 000 r·min-1室溫 （25℃） 離心5 min，并將沉淀物抽濾，沉淀物用1 mL蒸餾水溶解。即得血紅密孔菌菌絲體粗多糖溶液。

1.2.2 血紅密孔菌菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化

單因素試驗：分別評估不同的水浴溫度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、超聲輔助時間 （10 min、15 min、20 min、25 min、30 min） 和熱水浸提時間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min） 對菌絲體多糖提取率的影響。其除單因素優(yōu)化因素外，其他粗多糖提取方法同1.2.1。

響應面試驗：選取提取水浴溫度、料液比、熱水浸提時間、超聲輔助時間4種單因素，以菌絲體多糖的提取率作為響應值。采用Box-Behnken方法優(yōu)化其最佳提取條件，其他方法如1.2.1所示。

1.2.3 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[11-13]測定多糖的含量，以葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，得葡萄糖標準曲線回歸方程y=3.488 6x+0.006 2，相關系數(shù)R2=0.991 1，按該方程計算其粗多糖含量。吸光度值使用酶標儀測定。將樣品溶液稀釋10倍得到待測液，取100 μL待測液于5 mL的試管中計算多糖含量（Y，%）。其計算公式如下：

式中：C為粗多糖的含量（g·mL-1）；V為菌絲體多糖溶液的體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品的質量（g）。

1.2.4 血紅密孔菌菌絲體多糖體外抗氧化活性的測定

以相同質量濃度的VC溶液作為陽性對照，將菌絲體多糖溶液用蒸餾水配制成質量濃度分別為0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1、2.4 mg·mL-1、4.8 mg·mL-1、9.6 mg·mL-1的待測液。羥基自由基清除率的測定參照參考文獻[14-16]；超氧陰離子自由基清除率的測定參照參考文獻[17]。

1.2.5 血紅密孔菌多糖抑菌試驗

參照參考文獻[18]，以青霉素為陽性對照，制備質量濃度為 0.60 mg·mL-1、1.20 mg·mL-1、2.40 mg·mL-1、4.80 mg·mL-1、9.60 mg·mL-1的菌絲體多糖溶液，過濾除菌待用。并分別培養(yǎng)供試菌株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）溶液。利用紫外分光光度法探究不同質量濃度菌絲體多糖對大腸桿菌等的抑菌活性，其抑菌率（I，%）的計算公式為：

式中：A0是空白對照的吸光度值；A1是樣品測量管的吸光度值；Ai是樣品背景管的吸光度值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析方法

將所測得的數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0進行統(tǒng)計計算，利用Design-Expert 10.0.7對響應面進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

單因素提取溫度、料液比、熱水浸提時間、超聲輔助時間的試驗統(tǒng)計結果見圖1。

圖1 單因素試驗對多糖得率的影響Fig.1 Single factor test on the extraction rate of polysaccharides

由圖1可知，在提取溫度為60℃～80℃，菌絲體多糖的提取率隨溫度升高呈現(xiàn)正相關，在80℃時達到最高峰，80℃～100℃時，隨著溫度的升高，菌絲體多糖的提取率呈下降趨勢。因此，在其他條件一定的情況下，菌絲體多糖提取的最佳溫度為80℃。當料液比為1∶30時，曲線出現(xiàn)拐點，此時菌絲體多糖的提取率最高。熱水浸提時間在20 min～40 min時，菌絲體多糖提取率呈下降趨勢，而在40 min～60 min時，菌絲體多糖提取率增加，60 min時達到峰值，峰值后呈下降趨勢，綜合所述，60 min是菌絲體多糖熱水浸提的較佳時間。超聲輔助時間在15 min時達到峰值，超聲輔助處理可以有效的使用超聲的空穴效應破除殘留的細胞壁，以利于多糖的析出。

2.2 響應面結果與分析

選取提取水浴提取溫度、料液比、熱水浸提時間、超聲輔助時間4種單因素，以菌絲體多糖的提取率作為響應值。采用Box-Behnken方法優(yōu)化其最佳提取條件，其他方法如1.2.1所示。在單因素的基礎上，采用中心組和設計進行響應面試驗，試驗設計因素水平表見表1；試驗設計以及結果見表2。采用響應面軟件Design-Expert對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合并進行方差分析，得到的結果見表3。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 響應面試驗設計及結果分析Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)表3數(shù)據(jù)獲得的回歸方程為：

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of variance for the fitted regression model

根據(jù)方差分析結果可得，菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化模型回歸極顯著（P<0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），說明了模型構建較成功，與試驗的差異較小。決定系數(shù)R-Squared=0.942 2，調整決定系數(shù)=87.99%，說明該模型可以反映出87.99%的變化規(guī)律，結果表明，該模型完全符合試驗數(shù)據(jù)。由F值可知，根據(jù)影響菌絲體多糖提取率的程度，對因素排序為：料液比（A） ＞熱水浸提時間（D） ＞超聲輔助時間（C）＞提取溫度（B）。兩因素交互作用對多糖產量的響應面結果圖見圖2。

由圖2可知，各因子之間存在交互作用，響應面圖的斜率越陡，相互作用越顯著，斜率越小，相互作用越不顯著。分析結果表明，料液比與超聲輔助時間、超聲輔助時間與熱水浸提時間、料液比與熱水浸提時間的響應面圖均較陡峭。根據(jù)對響應面分析的回歸方程進行數(shù)理統(tǒng)計分析，并結合圖2兩因素交互作用對多糖產量的響應面可知，4個因子之間對血紅密孔菌菌絲體多糖的提取率存在最大值，對擬合出的二次多項式回歸方程分別求出A、B、C和D的偏導數(shù)得出菌絲體多糖提取的最優(yōu)工藝為超聲輔助時間

圖2 多糖產量的響應面結果圖Fig.2 Response surface results plot of polysaccharide yield

15 min、熱水浸提時間59 min、提取溫度79.7℃、料液為1∶30，此條件預測的菌絲體多糖提取率為5.231%。經(jīng)3次驗證試驗，可得菌絲體多糖平均實際提取率為5.228%，接近預測值，表明該模型能夠準確反映各種因素對菌絲體多糖提取率的影響，結果可靠。

2.3 活性試驗結果

2.3.1 抗氧化試驗結果

不同質量濃度的多糖對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除效率統(tǒng)計結果見圖3。

圖3 不同質量濃度多糖對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率Fig.3 The scavenging rate of·OH and O2·-clearance rate by polysaccharides with different mass concentrations

如圖3所示，菌絲體多糖在濃度增大的趨勢下，對羥基自由基的清除率呈正相關，當質量濃度在0.021 mg·mL-1～0.035 mg·mL-1時清除率上升幅度趨于平坦，當質量濃度為0.035 mg·mL-1時，清除率達到最大值為17.80%。且菌絲體多糖濃度為0.027 mg·mL-1時對超氧陰離子自由基清除率為32.31%，在同等質量濃度下高于陽性對照。

2.3.2 抑菌試驗結果

不同質量濃度的多糖抑菌效果統(tǒng)計見圖4。

圖4 不同質量濃度多糖的抑菌率Fig.4 The antibacterial ability rate of polysaccharides at different mass concentrations

由圖4所示，菌絲體多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌率隨著質量濃度的增加而增大，抑菌率呈現(xiàn)明顯正相關，表明菌絲體多糖對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。在質量濃度為1.2 mg·mL-1～2.4 mg·mL-1時對綠膿桿菌的抑菌率相差不顯著，后來隨著濃度增加，抑菌率變化明顯，在9.6 mg·mL-1時抑菌率達到最大值，表明菌絲體多糖對綠膿桿菌有明顯的抑制效果。在濃度 0.6 mg·mL-1～4.8 mg·mL-1時，對大腸肝菌的抑菌率隨質量濃度增加而增大，后隨著質量濃度的升高，抑菌率趨于平緩，并在質量濃度最大時抑菌效果達到最大，由此可見菌絲體多糖對大腸桿菌有顯著的抑制效果。對枯草芽孢桿菌的抑菌率隨質量濃度增加呈現(xiàn)正相關，在質量濃度最高時，抑菌率達到最大值，由此可見一定質量濃度的菌絲體多糖溶液對枯草芽孢桿菌有明顯的抑制效果。

3 討論與結論

目前，基于響應面法對多糖提取工藝條件的優(yōu)化已得到廣泛應用[19-22]，而這種方法在對發(fā)酵獲取菌絲體多糖的提取優(yōu)化上也得到了較好的效果，研究結果也得到了較理想的驗證。而前期的文獻表明血紅密孔菌含有耐高溫的漆酶，可降解木材，且提取的色素可用于染料生產[23]。試驗進一步拓展了血紅密孔菌的新功效，對其發(fā)酵菌絲體多糖進行制備及應用于功能食品的開發(fā)提供了一定的參考數(shù)據(jù)。隨著人口老齡化問題的凸顯，大健康產業(yè)在全球經(jīng)濟中的地位逐漸提升，菌類多糖一直是功能食品開發(fā)的熱點，而作為食（藥）用菌種質資源創(chuàng)新的重要來源，對拓寬新資源具有積極的導向作用。

通過料液比、提取溫度、超聲輔助時間、熱水浸提時間4個單因素試驗，設計多因素試驗得到提取血紅密孔菌菌絲體多糖的最佳條件，得到在超聲輔助時間為15 min、熱水浸提時間為59 min、提取溫度為79.7℃、料液比為1∶30；此時血紅密孔菌菌絲體多糖的提取率達到5.231%。與同等濃度的VC對照組相比，菌絲體多糖對羥基自由基有一定的清除能力，但清除能力低于VC；菌絲體多糖對超氧陰離子自由基的清除能力高于對照組，說明菌絲體多糖對超氧陰離子自由基具有較好的清除能力。此外，菌絲體多糖對4種指示菌的生長有顯著的抑制作用；整體來看，菌絲體多糖具有一定的抗氧化、抑菌能力，可作為一種天然的食品添加劑，在食（藥）用菌天然提取物抗氧化活性方面具有良好的應用前景，該結果為食品工業(yè)應用提供了一定的理論基礎。