許存賓，張建昆，孟 攀，田 野，蔡 菊，朱國飛

（貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽 550003）

獨腳金內(nèi)酯（strigolactones，SLs） 是來源于植物類胡蘿卜素代謝途徑的一類萜類小分子化合物，是近年發(fā)現(xiàn)的能調(diào)控植物生長發(fā)育的新型植物激素[1]，并且還能分泌到根外影響根系周圍土壤微生物的生長[2-3]。獨腳金內(nèi)酯最初是在研究寄生雜草獨腳金（Striga spp.）的種子萌發(fā)信號物質(zhì)時，在寄主棉花的根際分泌物中被發(fā)現(xiàn)的[4]。目前已在植物中鑒定出約36種天然獨腳金內(nèi)酯化合物，并人工合成了多個類似物[5]。獨腳金內(nèi)酯在植物中的合成途徑和功能已被廣泛研究，其能影響植物分枝、分蘗、葉片發(fā)育、株高、花青素合成、根系生長以及抗逆性等[6-8]。獨腳金內(nèi)酯對微生物生長的影響在叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）中研究較多，其能促進叢枝菌根真菌的孢子萌發(fā)、菌絲分枝、線粒體代謝及與植物共生關(guān)系的形成[9]，從而促進叢枝菌根和植物的生長，但是獨腳金內(nèi)酯具體如何影響叢枝菌根分枝的分子調(diào)控機制仍不清楚。獨腳金內(nèi)酯還對部分植物病原真菌[10-11]、內(nèi)生菌[12]產(chǎn)生影響，但表現(xiàn)形式并不統(tǒng)一，可能促進菌絲生長和分枝，也可能抑制菌絲生長和分枝[10]。

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea） 是傳統(tǒng)的食藥兼用真菌，與名貴藥用植物天麻為共生關(guān)系，能為天麻生長提供營養(yǎng)物質(zhì)[13]，同時其本身也具有與天麻相似的藥理作用。Yuan等[14]發(fā)現(xiàn)獨腳金內(nèi)酯能促進蜜環(huán)菌形成分枝，黃靖雯等[15]發(fā)現(xiàn)獨腳金內(nèi)酯能促進高盧蜜環(huán)菌（Armillaria gallica） 形成分枝，且認為幾丁質(zhì)酶可能參與了蜜環(huán)菌分枝的形成。但目前關(guān)于獨腳金內(nèi)酯對蜜環(huán)菌生長的影響報道仍較少。蜜環(huán)菌的分枝及生長情況能影響藥用植物天麻的生長和產(chǎn)量，通過分析獨腳金內(nèi)酯GR24對蜜環(huán)菌的分枝數(shù)、菌絲干質(zhì)量及多糖產(chǎn)量的影響，為獨腳金內(nèi)酯在蜜環(huán)菌或天麻生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

蜜環(huán)菌菌株A9，為蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵和天麻人工栽培生產(chǎn)中的常用菌種，購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所。

1.1.2 化學(xué)試劑

將獨腳金內(nèi)酯GR24（上海源葉生物科技有限公司）用丙酮溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的儲備液。將儲備液進行稀釋，制備質(zhì)量濃度為0.01 mg·mL-1的工作液。

丙酮、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、KH2PO4、MgSO4、NaCl均為分析純 （AR）。

1.1.3 培養(yǎng)基及配方

市售玉米粉、菜籽餅，瓊脂粉、酵母浸粉均為生物試劑（BR）。共使用3種培養(yǎng)基，配方見表1。

如表1所示，PDA培養(yǎng)基為蜜環(huán)菌培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；玉米粉-菜籽餅液體培養(yǎng)參照陳偉[16]的研究結(jié)果；玉米粉-酵母浸粉液體培養(yǎng)基將玉米粉-菜籽餅培養(yǎng)基中的菜籽餅替換為酵母浸粉，以改進菜籽餅顆粒不易從菌絲體上分離的問題。

表1 培養(yǎng)基配方Tab.1 Medium formulation

1.2 蜜環(huán)菌培養(yǎng)

1.2.1 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)

無菌條件下，分別向滅菌冷卻后尚未凝固的PDA培養(yǎng)基中分別添加GR24工作液，使其最終質(zhì)量濃度為 0、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、1.5 μg·L-1、2.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1，以及單獨添加 30 μL 丙酮（CK），各處理混勻后倒板。分別接種經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化的蜜環(huán)菌（取長度為5 mm的菌索） 于培養(yǎng)皿中央，置于25℃條件下恒溫培養(yǎng)，定期觀察并記錄，每個處理3次重復(fù)。

1.2.2 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)

無菌條件下，分別向滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中添加GR24工作液，使其最終質(zhì)量濃度為0、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、1.5 μg·L-1、2.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1。接種經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化的蜜環(huán)菌（取長度為5 mm的菌索），置于25℃、121 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，定期觀察并記錄，每個處理3次重復(fù)。

1.3 蜜環(huán)菌菌索計數(shù)與分枝率計算

分別在培養(yǎng)11 d、14 d、17 d、20 d對培養(yǎng)皿內(nèi)肉眼可觀察到的菌索進行統(tǒng)計，得到菌索總數(shù)；再對菌索上出現(xiàn)分枝的菌索進行計數(shù)，得出分枝菌索數(shù)。蜜環(huán)菌菌索分枝率（R，%）的計算公式為：

式中：Nb為分枝菌索數(shù)（個）；Nt為菌索總數(shù)（個）。

1.4 蜜環(huán)菌菌絲干質(zhì)量的測定

測定固體培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌絲干質(zhì)量：將固體培養(yǎng)基融化后用蒸餾水洗滌菌絲，獲得無培養(yǎng)基殘留的菌絲置于培養(yǎng)皿中，75℃烘箱烘干至恒重。

測定液體培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌絲干質(zhì)量：將液體培養(yǎng)的蜜環(huán)菌通過20目標準檢驗篩，用100 mL蒸餾水洗滌菌絲球；將濾液再次通過100目標準檢驗篩，用50 mL蒸餾水洗滌菌絲球。將2次過濾所得菌絲球置于培養(yǎng)皿中，75℃烘箱烘干至恒重。

1.5 蜜環(huán)菌多糖的測定

蜜環(huán)菌多糖的測定方法參考張琦等[17]的苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準物質(zhì)測定標準曲線，以上述培養(yǎng)獲得的干菌絲為樣品進行多糖含量的測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft office 2019軟件整理，GraphPad Prism軟件進行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GR24對蜜環(huán)菌生長和分枝的影響

通過在PDA培養(yǎng)基中添加不同濃度獨腳金內(nèi)酯GR24后培養(yǎng)蜜環(huán)菌，培養(yǎng)11 d、14 d、17 d和20 d時觀察其生長情況，結(jié)果見圖1。

圖1 不同GR24質(zhì)量濃度對蜜環(huán)菌生長和分枝的影響Fig.1 Effect of different mass concentrations of GR24 on Armillaria mellea growing and branching

如圖1A所示，GR24能顯著增加蜜環(huán)菌分枝，菌索兩側(cè)產(chǎn)生大量毛刺狀凸起。

如圖1B和1C所示，菌索總數(shù)與分枝菌索數(shù)的變化情況基本一致。添加GR24質(zhì)量濃度為1 μg·L-1時，菌索總數(shù)和分枝菌索數(shù)最少，且均低于對照組（CK）；而后隨GR24添加量的增加，促進了蜜環(huán)菌的生長，且當(dāng)質(zhì)量濃度為2 μg·L-1時，培養(yǎng)11 d的蜜環(huán)菌菌索和分枝菌索的數(shù)量均已顯著超過對照組（CK）；GR24 在低質(zhì)量濃度時抑制生長、2 μg·L-1時促進生長的結(jié)果，與Dor Evgenia[10]研究獨腳金內(nèi)酯對根部病原菌生長影響的結(jié)果相一致。當(dāng)GR24質(zhì)量濃度為2.5 μg·L-1時，培養(yǎng)前期蜜環(huán)菌生長速度較慢，培養(yǎng)20 d后其菌索總數(shù)和分枝菌索數(shù)達到最大值；這可能是因為GR24在培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)生了消耗或降解，時間延長后降低至蜜環(huán)菌生長的最適濃度。另外，使用丙酮處理的對照組（CK）中菌索總數(shù)略少于GR24質(zhì)量濃度為0的試驗組，但兩者之間無顯著差異性。

如圖1D所示，添加GR24后分枝率顯著增加。其中，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 μg·L-1時，統(tǒng)計不同培養(yǎng)時長的蜜環(huán)菌分枝率均為最高。但不同質(zhì)量濃度的獨腳金內(nèi)酯對真菌生長和分枝的影響仍存在很大區(qū)別[18]，因為獨腳金內(nèi)酯是脂溶性分子，在不同溶劑和培養(yǎng)基介質(zhì)的溶解、擴散等存在差異，這也導(dǎo)致同一處理中菌索生長數(shù)據(jù)離散性加大。

綜合分析顯示，GR24在低質(zhì)量濃度（＜2.0 μg·L-1）以及高質(zhì)量濃度（＞2.0 μg·L-1）下均會抑制蜜環(huán)菌菌索生長，但能促進其菌索分枝的形成。這與前期報道的獨腳金內(nèi)酯對AM真菌、植物病原真菌的結(jié)果相一致[9-11]；當(dāng)獨腳金內(nèi)酯GR24的質(zhì)量濃度為2.0 μg·L-1時，既可促進菌索生長，又可提高蜜環(huán)菌的分枝菌索數(shù)和分枝率。

2.2 GR24對蜜環(huán)菌菌絲球形態(tài)的影響

使用添加GR24的玉米粉-菜籽餅液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌絲體見圖2。

如圖2所示，使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌絲體呈球形，添加不同質(zhì)量濃度的獨腳金內(nèi)酯GR24對菌絲球的大小有顯著的影響。添加獨腳金內(nèi)酯GR24后形成的菌絲球直徑均大于不添加的處理；其中GR24質(zhì)量濃度為1.0 μg·L-1的培養(yǎng)液中形成的菌絲球直徑最大，但數(shù)目最少。此外，使用添加不同質(zhì)量濃度GR24的玉米粉-酵母浸粉液體培養(yǎng)基培養(yǎng)蜜環(huán)菌，其菌絲球生長情況與前者相似。因此，推測獨腳金內(nèi)酯能增加蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)菌絲球的大小，可能是其可促進蜜環(huán)菌分枝，分枝纏繞易形成大的菌絲球。

圖2 不同GR24質(zhì)量濃度的玉米粉-菜籽餅液體培養(yǎng)基中的蜜環(huán)菌菌絲球Fig.2 Mycelium pellets of Armillaria mellea in liquid media of cornmeal-yeast extract powder with different mass concentrations of GR24

2.3 GR24對蜜環(huán)菌菌絲干質(zhì)量的影響

對PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d的蜜環(huán)菌和玉米粉-酵母浸粉液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 d的蜜環(huán)菌菌絲干質(zhì)量進行測定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同GR24質(zhì)量濃度對蜜環(huán)菌菌絲干質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of GR24 on dry weight of Armillaria mellea mycelia at different mass concentrations

如圖3所示，隨著GR24質(zhì)量濃度的升高，固體和液體培養(yǎng)基中蜜環(huán)菌的菌絲干質(zhì)量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；在GR24質(zhì)量濃度為2 μg·L-1時菌絲干質(zhì)量達到最大，而后又降低。這與GR24對菌索數(shù)量的影響結(jié)果一致，低質(zhì)量濃度對蜜環(huán)菌的生長有抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 μg·L-1時則促進其菌生長。

2.4 GR24對蜜環(huán)菌多糖含量的影響

試驗采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖作為標準物質(zhì)，得到的葡萄糖標準液線性回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1。

取玉米粉-菜籽餅液體培養(yǎng)基與玉米粉-酵母浸粉液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d的蜜環(huán)菌菌絲，烘干后測定其多糖含量，因獲得的菌絲較少，取3個重復(fù)混合后進行測定，結(jié)果見圖4。

圖4 不同GR24質(zhì)量濃度對蜜環(huán)菌菌絲多糖含量的影響Fig.4 Effect of GR24 on the polysaccharide content of Armillaria mellea mycelia at different mass concentrations

如圖4所示，隨著GR24質(zhì)量濃度的升高，2種液體培養(yǎng)基中蜜環(huán)菌菌絲的多糖含量逐漸增加，在GR24質(zhì)量濃度為2.0 μg·L-1時多糖含量達到最大值，隨后開始下降。玉米粉-酵母浸粉培養(yǎng)基中菌絲多糖的含量略高于玉米粉-菜籽餅培養(yǎng)基中菌絲多糖的含量，這為后期開展蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇提供一定參考。蜜環(huán)菌多糖是其藥用成分之一，具有一定抗腫瘤、抗驚厥和降血脂等藥理活性[19-20]，添加獨腳金內(nèi)酯能增加蜜環(huán)菌多糖含量，對蜜環(huán)菌液體發(fā)酵和開發(fā)應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義，但獨腳金內(nèi)酯促菌絲多糖含量增加的機制有待進一步研究。

3 討論與結(jié)論

獨腳金內(nèi)酯作為一種新型植物激素，既能調(diào)控植物生長發(fā)育，還能影響相關(guān)微生物的生長。蜜環(huán)菌是藥用植物天麻的共生菌，為其生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量，因此探究了不同質(zhì)量濃度的獨腳金內(nèi)酯GR24對蜜環(huán)菌生長的影響。研究發(fā)現(xiàn)，獨腳金內(nèi)酯能顯著影響蜜環(huán)菌菌絲分枝，這與Yuan等[14]的發(fā)現(xiàn)一致，低質(zhì)量濃度的獨腳金內(nèi)酯（1.0 μg·L-1）能快速促進蜜環(huán)菌分枝，高質(zhì)量濃度（2.0 μg·L-1）在長期促進蜜環(huán)菌分枝方面更顯著，但質(zhì)量濃度過高可能會抑制蜜環(huán)菌分枝。獨腳金內(nèi)酯可提高蜜環(huán)菌菌絲干質(zhì)量，質(zhì)量濃度為2.0 μg·L-1時菌絲干質(zhì)量增加最為顯著。獨腳金內(nèi)酯能促菌絲體形成的菌絲球直徑增大，這可能與其促進蜜環(huán)菌分枝從而菌絲更易相互纏繞有關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)獨腳金內(nèi)酯能促進蜜環(huán)菌多糖的形成，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 μg·L-1時促進作用最佳。

獨腳金內(nèi)酯能顯著影響蜜環(huán)菌的生長發(fā)育，為調(diào)控蜜環(huán)菌和天麻的生產(chǎn)提供新的思路；且蜜環(huán)菌培養(yǎng)方便，為研究獨腳金內(nèi)酯與真菌之間的作用機制提供新的研究材料。早期對獨腳金內(nèi)酯影響土壤微生物的研究集中在叢枝菌根真菌，認為獨腳金內(nèi)酯會通過激活線粒體[21]、激發(fā)ROS相關(guān)基因表達[11]等分子機制促進真菌分枝，但由于叢枝菌根真菌難培養(yǎng)、多核且無法建立遺傳轉(zhuǎn)化體系而難于開展深入研究；也有部分研究者將研究對象轉(zhuǎn)向植物病原真菌[11]；而蜜環(huán)菌-天麻的共生模式與叢枝菌根真菌-植物的共生模式更為相似，更有利于開展獨腳金內(nèi)酯調(diào)控真菌生長的分子機制研究。此外，目前關(guān)于蜜環(huán)菌-天麻之間的共生機制仍有很多問題尚未解決，獨腳金內(nèi)酯可能是影響兩者共生關(guān)系的調(diào)節(jié)因素，為開展共生機制研究提供新的方向。通過闡述獨腳金內(nèi)酯對蜜環(huán)菌生長的影響，為利用獨腳金內(nèi)酯提高蜜環(huán)菌和天麻的產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)，但其作用機制和應(yīng)用方式仍有待進一步研究。