王春暉，徐 寧，吳 芳，肖穎群，王小艷，姜性堅(jiān)，張 宇，胡汝曉**

（1.湖南省食用菌研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410016；2.茶陵縣興農(nóng)食用菌種植農(nóng)民專(zhuān)業(yè)合作社，湖南 株洲 412415）

灰樹(shù)花 (Grifola frondosa)又名蓮花菌、栗蘑、舞茸等。其以闊葉林木屑為主要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，是典型的木腐真菌。分類(lèi)上隸屬傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales） 薄孔菌科（Meripilaceae） 樹(shù)花菌屬（Grifola）。90年代我國(guó)灰樹(shù)花馴化栽培研究取得成功[1]，2000年以來(lái)在品種的遺傳多樣性、生物學(xué)特性及栽培技術(shù)等方面開(kāi)展了探索[2-3]，不同原產(chǎn)地和不同生態(tài)類(lèi)型的菌株也逐漸增多，促進(jìn)了我國(guó)灰樹(shù)花栽培品種及產(chǎn)業(yè)化栽培技術(shù)的進(jìn)步發(fā)展?；覙?shù)花不僅風(fēng)味濃香，味道鮮美，具有極高的食用價(jià)值，且富含抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種活性成分[4-5]，是頗具研究?jī)r(jià)值與開(kāi)發(fā)潛力的食用菌。

食用菌在無(wú)性繁殖過(guò)程中種性會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象[6]，引起菌絲類(lèi)型變化，雙核菌絲相對(duì)減少，單核菌絲相對(duì)增多，并伴隨著形態(tài)、生理、遺傳等方面的變化和衰退[7]?；覙?shù)花種性退化現(xiàn)象明顯，母種多次無(wú)性擴(kuò)繁，會(huì)使菌絲變得纖細(xì)、生長(zhǎng)速度變緩、抗逆性減弱、原基數(shù)量減少、生物學(xué)效率降低，影響產(chǎn)量、品質(zhì)與效益。目前常用組織分離和孢子分離方法進(jìn)行菌種復(fù)壯。組織分離由子實(shí)體再生而成，無(wú)遺傳因子的重組，復(fù)壯效果不好；孢子分離雖有遺傳因子的重組，但遺傳背景復(fù)雜，缺乏標(biāo)記，篩選難度大，復(fù)壯時(shí)間較組織分離長(zhǎng)。

真菌原生質(zhì)體具有細(xì)胞全能性，是遺傳育種的良好材料。許多學(xué)者在原生質(zhì)體分離、再生、誘變、融合等方面開(kāi)展了大量試驗(yàn)[8-9]，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，取得了一系列研究成果[10]。薛平海等[11]對(duì)灰樹(shù)花原生質(zhì)體的制備和再生條件開(kāi)展了研究；楊軍等[12]獲得灰樹(shù)花原生質(zhì)體單核體，進(jìn)行了孢子單核體交配型分類(lèi)與鑒定。關(guān)于灰樹(shù)花原生質(zhì)體高溫脅迫條件及其再生菌株胞外酶活性的研究與分析，尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，通過(guò)高溫脅迫試驗(yàn)，揭示灰樹(shù)花原生質(zhì)體高溫脅迫條件以及其再生菌株在胞外酶活性的個(gè)體差異，為灰樹(shù)花和其他食用真菌品種復(fù)壯與選育研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

灰樹(shù)花2#，由湖南省食用菌研究所提供。

1.2 藥品與試劑

溶壁酶（Lywallzyme）、纖維素酶（Cellulases）、蝸牛酶（Snailase），由湖南海全醫(yī)療科技有限公司提供 （進(jìn)口分裝）；MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、KCl、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、蛋白胨，均為國(guó)產(chǎn)分析純，由長(zhǎng)沙先行化工有限公司提供。

1.3 儀器與設(shè)備

LMQ.C-50E蒸汽滅菌鍋，山東博越科學(xué)儀器有限公司；TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；BX-53熒光顯微鏡，奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HWS-26恒溫水浴鍋，蘇州江東州精密儀器有限公司；FA1204C分析天平，蘇州生物技術(shù)有限公司；TS-1102C立式雙層恒溫?fù)u床，長(zhǎng)沙市天恒科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；BCD-272WDPD低溫冰箱，海爾智家股份有限公司；Biosafer400up超聲波細(xì)胞粉碎儀，湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司。

1.4 培養(yǎng)基配制

普通培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖25 g、蛋白胨 2.5 g、MgSO41 g、KH2PO40.5 g、 K2HPO41 g，煮沸10 min，3層紗布過(guò)濾，定容至1 000 mL，加瓊脂25 g，用于菌絲體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基不加瓊脂，加羧甲基纖維素納10 g，用于液體菌絲培養(yǎng)。再生培養(yǎng)基：以液體培養(yǎng)基為基液，用0.55 mol·L-1KCl等滲液配制再生培養(yǎng)基（調(diào)節(jié)滲透壓，保持原生質(zhì)體形態(tài)正常），加0.5%的酵母粉和0.1%的VB1。栽培培養(yǎng)基：木屑70%、玉米芯13%、麥麩10%、腐殖土5%、石膏粉2%，pH 6.0～6.5，含水量60%～65%。上述各類(lèi)培養(yǎng)基配制后，置高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121℃～126℃、0.11 MPa～0.14 MPa條件下，液體基質(zhì)滅菌30 min，固體基質(zhì)滅菌50 min，冷卻至室溫備用。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 原生質(zhì)體制備

1）菌絲體培養(yǎng)收集

將灰樹(shù)花試管種（母種）用普通培養(yǎng)基進(jìn)行玻璃紙瓊脂平板透析培養(yǎng)，待菌落直徑達(dá)到2.5 cm～3.0 cm時(shí)，用接種環(huán)將菌落邊緣菌絲接入盛有20 mL液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，輕輕擺動(dòng)接種環(huán)，使菌絲分散在液體培養(yǎng)基中，25℃靜置，黑暗培養(yǎng)2.5 d～3.5 d，單層無(wú)菌濾紙過(guò)濾，0.55 mol·L-1KCl等滲液洗滌 2次～3次，3 000 r·min-1離心10 min，去上清，無(wú)菌濾紙吸走多余水分，收集灰樹(shù)花菌絲體，4℃～8℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2） 原生質(zhì)體分離

根據(jù)陸歡等[13]的方法加以改進(jìn)。稱(chēng)取纖維素酶1 g、溶壁酶 1.5 g、蝸牛酶 1 g，用 0.55 mol·L-1KCl等滲液溶解，后加入等滲液定容至100 mL配成復(fù)合酶液，細(xì)菌過(guò)濾器（4孔，0.45 μm）過(guò)濾后，4℃低溫保存?zhèn)溆茫蝗? g菌絲體置50 mL三角燒瓶中，加無(wú)菌復(fù)合酶液10 mL，置于28℃的恒溫?fù)u床中酶解，每隔30分鐘啟動(dòng)搖床1次，50 r·min-1持續(xù)1 min。酶解4.5 h后，用約0.5 cm厚的無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，過(guò)濾液4 000 r·min-1離心15 min，沉淀物用0.55 mol·L-1KCl等滲液溶解，重復(fù)離心1次，再將沉淀用等滲液溶解得到原生質(zhì)體懸浮液。

3） 純度與濃度檢測(cè)

用熒光增白劑檢查是否完全去壁，判斷原生質(zhì)體純度；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體濃度。測(cè)定純度與濃度后快速加甘油超低溫保存。

1.5.2 原生質(zhì)體高溫脅迫和再生

1）原生質(zhì)體高溫脅迫

以脅迫溫度和脅迫時(shí)間為脅迫參數(shù)，按脅迫溫度分成5組，每組設(shè)5個(gè)脅迫時(shí)間、1個(gè)對(duì)照（CK）。操作方法為：在30個(gè)100 mL三角燒瓶?jī)?nèi)分別注入25 mL再生培養(yǎng)基，高壓滅菌后冷卻至室溫，按無(wú)菌操作方法，將分離的灰樹(shù)花2#原生質(zhì)體用0.55 mol·L-1KCl稀釋到 2×104個(gè)/mL，在盛有再生培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)分別加入0.1 mL原生質(zhì)體懸液，分別置42℃、45℃、48℃、51℃、54℃恒溫水浴鍋中，分別處理0（CK）、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min。在確定最適脅迫溫度后，根據(jù)原生質(zhì)體致死情況，對(duì)0～3 min和7 min～10 min的脅迫時(shí)段細(xì)分為 0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min和 7.5 min、8.0 min、8.5 min、9.0 min、9.5 min，優(yōu)化脅迫條件，以獲得最適脅迫溫度下對(duì)原生質(zhì)體致死產(chǎn)生響應(yīng)的最短脅迫時(shí)間（剛引起致死）和原生質(zhì)體能忍受的最長(zhǎng)脅迫時(shí)間（剛?cè)恐滤溃?/p>

2） 脅迫原生質(zhì)體再生

將高溫脅迫后的原生質(zhì)體置于生化培養(yǎng)箱黑暗靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26℃～28℃。顯微觀察原生質(zhì)體再生過(guò)程，待培養(yǎng)基中出現(xiàn)可見(jiàn)微小再生菌落，用無(wú)菌接種針及時(shí)挑出再生菌落，放PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到原生質(zhì)體再生菌株。統(tǒng)計(jì)不同脅迫量下的再生菌落數(shù)量，并按脅迫條件將再生菌株編號(hào)為T(mén)tMm-1、TtMm-2、TtMm-3……TtMm-N；各編號(hào)中t為脅迫溫度、m為脅迫時(shí)間、TM為脅迫條件、N為本脅迫條件下的再生菌株編號(hào)。

1.5.3 原生質(zhì)體高溫脅迫條件篩選

用原生質(zhì)體致死率衡量高溫脅迫對(duì)原生質(zhì)體活性的影響。通過(guò)不同溫度、不同時(shí)間的脅迫參數(shù)試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)不同脅迫條件下原生質(zhì)體的致死率，分析在設(shè)置的脅迫時(shí)間內(nèi)不同脅迫溫度對(duì)原生質(zhì)體的脅迫程度與致死幅度，確定原生質(zhì)體的最適脅迫溫度以及該溫度下對(duì)原生質(zhì)體致死產(chǎn)生響應(yīng)的最短脅迫時(shí)間、最長(zhǎng)脅迫時(shí)間。原生質(zhì)體致死率（P，%） 依據(jù)不同高溫脅迫量條件下原生質(zhì)體再生菌落的數(shù)量計(jì)算，計(jì)算公式為：

式中：N1為未經(jīng)處理（CK）的原生質(zhì)體再生菌落數(shù)（個(gè)）；N2為高溫脅迫處理后原生質(zhì)體再生菌落數(shù)（個(gè)）。

1.5.4 再生菌株的胞外酶酶活力分析

從菌絲濃密、整齊、長(zhǎng)速較快且處于最適脅迫溫度下的再生菌株中隨機(jī)挑選3個(gè)不同高溫脅迫條件的再生菌株，以出發(fā)菌株灰樹(shù)花2#為對(duì)照（CK），進(jìn)行纖維素氧化酶類(lèi)及木質(zhì)素氧化酶類(lèi)分析。纖維素氧化酶類(lèi)用羧甲基纖維素酶（CMCase） 為衡量指標(biāo)，木質(zhì)素氧化酶類(lèi)用漆酶（Laccase）為衡量指標(biāo)。每次試驗(yàn)5個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計(jì)分析采用MATLAB R2019b和Microsoft Excel。因各試驗(yàn)組之間總體方差不相同，為提高魯棒性并減少第一型錯(cuò)誤，用Welch’s t-test分析組間差異性。

1） 液體培養(yǎng)菌絲體粗酶液的提取

在250 mL三角燒瓶?jī)?nèi)分別注入50 mL液體培養(yǎng)基，在121℃、0.11 MPa條件下滅菌30 min。冷卻至室溫后，按無(wú)菌操作接入直徑10 mm的菌絲塊2個(gè)～3個(gè)，搖床避光培養(yǎng)，150 r·min-1，溫度28℃。7 d后置離心管，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液于4℃冰箱低溫保存，作待測(cè)酶液備用。

2） 固體培養(yǎng)菌絲體粗酶液的提取

按栽培培養(yǎng)基配方配料、裝瓶、滅菌。冷卻至室溫后，按無(wú)菌操作接入直徑1 cm、長(zhǎng)度2 cm的斜面試管菌種1塊，25℃培養(yǎng)25 d～30 d，即為原種。待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底后，從中部取帶菌絲的培養(yǎng)基2份，每份30 g。1份用4倍無(wú)菌蒸餾水浸泡，超聲波搗碎，20℃浸提8 h，3層紗布過(guò)濾，3 000 r·min-1離心10 min，上清液為粗酶液，4℃保存?zhèn)溆?。?份用恒溫干燥箱在60℃～65℃條件下烘干，稱(chēng)重。

3） 胞外酶酶活力測(cè)定方法

漆酶活力測(cè)定采用ABTS法[14]。酶活力單位定義為：1 g干培養(yǎng)物（或1 mL菌絲發(fā)酵液）中每分鐘使OD600值改變0.01的酶量為一個(gè)酶活力單位。

羧甲基纖維素酶測(cè)定采用DNS法[15]。酶活力單位定義為：1 g干培養(yǎng)物（或1 mL菌絲發(fā)酵液） 每10分鐘催化底物生成1 mg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體高溫脅迫條件

不同高溫脅迫條件對(duì)灰樹(shù)花原生質(zhì)體致死的影響見(jiàn)表1～表7。

表1 42℃不同時(shí)間下原生質(zhì)體致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 Lethality rate of protoplasts under different time with 42℃

表2 45℃不同時(shí)間下原生質(zhì)體致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 Lethality rate of protoplasts under different time with 45℃

表3 48℃不同時(shí)間下原生質(zhì)體致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.3 Lethality rate of protoplasts under different time with 48℃

表4 51℃不同時(shí)間下原生質(zhì)體致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.4 Lethality rate of protoplasts under different time with 51℃

表5 54℃不同時(shí)間下原生質(zhì)體致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.5 Lethality rate of protoplasts under different time with 54℃

表6 48℃下0.5 min～2.5 min時(shí)間內(nèi)原生質(zhì)體致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.6 Lethality rate of 0.5 min-2.5 minprotoplasts under different time with 48℃

表7 48℃下7.5 min～9.5 min時(shí)間內(nèi)原生質(zhì)體致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.7 Lethality rate of protoplasts under 7.5 min-9.5 min conditions with 48℃

由表1及表2可知，分別在42℃、45℃，3 min～7 min脅迫條件下，原生質(zhì)體致死率為1.47%～63.04%，在設(shè)置時(shí)間內(nèi)未能使原生質(zhì)體全部脅迫致死，可見(jiàn)該脅迫溫度過(guò)低。由表4及表5參數(shù)可知，在51℃、54℃，3 min～7 min脅迫條件下，原生質(zhì)體致死率為71.01%～100%，脅迫致死時(shí)間為3 min～4 min，致死率幅度大，脅迫時(shí)間短、脅迫速度快，可見(jiàn)，該脅迫溫度過(guò)高。由表3可知，在48℃，3 min～7 min脅迫條件下，原生質(zhì)體致死率為40.88%～99.27%，致死幅度與脅迫速度均勻，在設(shè)置時(shí)間內(nèi)原生質(zhì)體接近全部脅迫致死，可見(jiàn)該脅迫溫度（48℃） 為灰樹(shù)花2#原生質(zhì)體高溫脅迫的最適脅迫溫度，該脅迫溫度下原生質(zhì)體可忍受的最大脅迫量為48℃、7min。由表6可知，在48℃、0.5min～2.5min脅迫條件下，原生質(zhì)體致死率為0.73%～31.39%，當(dāng)脅迫時(shí)間為0.5 min時(shí)，致死率為0.73%，接近對(duì)照?？梢?jiàn)，該脅迫溫度下可使原生質(zhì)體致死發(fā)生響應(yīng)的最短脅迫時(shí)間為0.5 min。由表7表明，在48℃，7.5 min～9.5 min脅迫條件下，原生質(zhì)體致死率為100%，7.5 min時(shí)原生質(zhì)體已全部致死。綜合上述結(jié)果可得：灰樹(shù)花2#原生質(zhì)體高溫脅迫致死的脅迫條件為48℃、0.5 min～7.5 min。

2.2 再生菌株的胞外酶活性分析

不同高溫脅迫條件下再生菌株的羧甲基纖維素酶活性和漆酶活性見(jiàn)表8和表9。

由表8和表9可知，固體培養(yǎng)的再生菌株T48M3-36、T48M5-19和T48M7-1，以及出發(fā)菌株灰樹(shù)花2#的羧甲基纖維素酶活性分別為（17.38±1.60） U·g-1、（17.50±1.35）U·g-1、（20.41±2.16）U·g-1、（14.71±1.36） U·g-1，漆酶活性分別為 （69.78±2.54） U·g-1、（69.95 ± 2.71）U·g-1、（73.82±3.10） U·g-1、（64.55 ±2.18） U·g-1；液體培養(yǎng)的羧甲基纖維素酶活性分別為 （27.44±1.826）U·mL-1、（22.70±1.53）U·mL-1、（26.63±2.63）U·mL-1、（19.40±2.25）U·mL-1，漆酶活性分別為 （49.90±2.45）U·mL-1、（49.62±2.62）U·mL-1、（52.67 ± 3.22） U·mL-1、（44.64 ± 1.90）U·mL-1。3個(gè)再生菌株的羧甲基纖維素酶活性和漆酶活性均極顯著高于出發(fā)菌株灰樹(shù)花2#（P＜0.01）。T48M7-1菌株的固體培養(yǎng)基羧甲基纖維素酶活性、液體培養(yǎng)基羧甲基纖維素酶活性和固體培養(yǎng)基漆酶活性高于T48M5-19菌株和T48M3-36菌株，且差異顯著（P＜0.05）。再生菌株酶活高于出發(fā)菌株以及再生菌株之間酶活存在差異的原因，可能是高溫脅迫使遺傳因子差、酶活性低、生命力弱的原生質(zhì)體失活，使遺傳因子優(yōu)、酶活性高、生命力強(qiáng)的原生質(zhì)體得以再生，也包括正向突變和重組在內(nèi)的變異，起到了提純復(fù)壯或優(yōu)化改良作用。試驗(yàn)結(jié)果與王謙等[16]從紅桃側(cè)耳（Pleurotus djamor）原生質(zhì)體再生菌株中篩選出優(yōu)良菌株以及張運(yùn)峰等[17]發(fā)現(xiàn)平菇（Pleurotus ostreatus） 原生質(zhì)體再生菌株間的遺傳多樣性存在顯著差異的研究結(jié)論相一致。

表8 不同再生菌株的羧甲基纖維素酶活力比較Tab.8 Comparison of CMCase activity in different regeneration strains

表9 不同再生菌株的漆酶活力比較Tab.9 Comparison of laccase activity in different regeneration strains

3 討論與小結(jié)

相同條件下制備的原生質(zhì)體其再生活性存在個(gè)體差異，耐熱性好的耐受時(shí)間長(zhǎng)，耐熱性差的耐受時(shí)間短。其原因可能是在原生質(zhì)體形成過(guò)程中，菌絲內(nèi)的細(xì)胞核及細(xì)胞器發(fā)生隨機(jī)分配，產(chǎn)生無(wú)核、單核、雙核及多核原生質(zhì)體，細(xì)胞核及細(xì)胞器數(shù)量的變化，也包括突變和重組在內(nèi)的變異，使分離后的原生質(zhì)體在基因組成上產(chǎn)生個(gè)體差異，進(jìn)而引起原生質(zhì)體在再生活力上的個(gè)體差異。分離后的原生質(zhì)體在基因組成上的個(gè)體差異也為其再生菌株在生物學(xué)特性上的變異提供了生物學(xué)依據(jù)。與單核原生質(zhì)體、同核原生質(zhì)體及巨大原生質(zhì)體的研究?jī)r(jià)值一樣[18-19]，開(kāi)展原生質(zhì)體的個(gè)性研究，探索原生質(zhì)體在基因組成、酶系酶活、代謝功能及活力抗性等方面的個(gè)體差異，揭示不同原生質(zhì)體的個(gè)體特點(diǎn)、特性和生命規(guī)律。可為原生質(zhì)體在品種復(fù)壯、選育及改良上的應(yīng)用提供更豐富和更精細(xì)的研究材料；提高原生質(zhì)體育種技術(shù)的特異性、精準(zhǔn)性及高效性。促進(jìn)原生質(zhì)體育種技術(shù)的不斷深入，具有極大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。

試驗(yàn)中探究了灰樹(shù)花原生質(zhì)體高溫脅迫條件及其再生菌株的胞外酶活性。試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析表明，灰樹(shù)花2#原生質(zhì)體高溫致死脅迫的條件為：最適脅迫致死溫度為48℃，該溫度下使原生質(zhì)體致死的最短脅迫時(shí)間為0.5 min，使原生質(zhì)體全部致死的最長(zhǎng)脅迫時(shí)間為7.5 min，脅迫條件為48℃、0.5 min～7.5 min。高溫脅迫下的原生質(zhì)體再生菌株的胞外酶活性存在個(gè)體差異，不同高溫脅迫量下的3個(gè)再生菌株的羧甲基纖維素酶活性和漆酶活性均高于出發(fā)菌株，且差異極顯著（P＜0.01），不同高溫脅迫量下的再生菌株之間的羧甲基纖維素酶活性和漆酶活性也存在顯著差異（P＜0.05）。