張光輝，王曉馳，楊笑愷

(陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 西安 712046)

番瀉葉為豆科山扁豆屬植物狹葉番瀉或尖葉番瀉的小葉，又稱旃那葉、瀉葉、泡竹葉，原產(chǎn)于干熱地帶，在我國臺灣、廣西、云南均有引種栽培。番瀉葉味甘苦，具有瀉熱行滯、利水通便、止血、肌肉松弛與解痙等功效[1-2]。黃酮類化合物是番瀉葉的活性成分之一，具有促進血液循環(huán)、降低膽固醇、改善心腦血管疾病、治療腎病、降低血糖、抗疲勞、抗抑郁、抗骨質(zhì)疏松、抗胃潰瘍、預防癌癥、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用[3-9]。此外，黃酮類化合物還具有抗氧化活性，可以有效清除體內(nèi)的氧自由基，如花青素可以抑制油脂性過氧化物的全階段溢出，這種抗氧化作用可以阻止細胞退化、衰老[10-11]。番瀉葉中黃酮類化合物含量可觀，但國內(nèi)外對番瀉葉總黃酮的提取和抗氧化活性研究鮮有報道。鑒于此，作者在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化番瀉葉總黃酮的提取工藝，通過測定其對DPPH自由基的清除率來評價其體外抗氧化活性，并對抗氧化實驗進行方法學考察，擬為番瀉葉總黃酮的開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

番瀉葉，市售，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室王紀濤高級實驗師鑒定為豆科山扁豆屬植物番瀉葉。

蘆丁標準品，北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基(2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基，純度>98%)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，分析純。

DFY-500型搖擺式高速萬能粉碎機，溫嶺林大機械有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲波儀器有限公司；TP-A200型電子天平，華志電子科技有限公司；UV-1780型紫外可見分光光度計，島津儀器有限公司；HH-2A型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 蘆丁標準曲線的繪制

準確稱取蘆丁標準品10.0 mg，加入乙醇溶解并定容至50 mL，得0.20 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。移取蘆丁標準溶液1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL、4.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入0.30 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min；然后加入0.30 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min；最后加入4.00 mL 1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液，用乙醇定容到刻度，搖勻，靜置15 min，顯色；以乙醇為參比，測定510 nm處吸光度。以蘆丁標準溶液濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程：A=10.802c+0.0113(R2=0.9995)。表明蘆丁濃度在20～80 μg·L-1范圍內(nèi)與吸光度線性關系良好。

1.3 番瀉葉總黃酮提取率的測定

將番瀉葉置于80 ℃烘箱中干燥6 h，粉碎，過80目篩，裝入塑封袋，保存。稱取5.00 g番瀉葉粉末置于燒杯中，按一定料液比加入乙醇，在一定溫度下超聲提取一定時間，提取液過濾，洗滌，濾液用乙醇定容至100 mL容量瓶中。移取2.50 mL提取液稀釋液加入到50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度；再移取4.00 mL稀釋液加入到10 mL容量瓶中，按1. 2方法顯色，以空白為參比，測定510 nm處吸光度(A)。按式(1)計算番瀉葉總黃酮提取率(%)：

(1)

1.4 番瀉葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

采用單因素實驗分別考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL，下同)、超聲溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超聲時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)對番瀉葉總黃酮提取率的影響。在單因素實驗的基礎上，以超聲時間、超聲溫度、料液比為考察因素，設計3因素3水平響應面實驗，優(yōu)化番瀉葉總黃酮提取工藝。

1.5 番瀉葉總黃酮體外抗氧化活性評價

精密稱取DPPH自由基 0.010 0 g，加入乙醇超聲溶解并定容至50 mL，得濃度為0.20 mg·mL-1的DPPH自由基溶液。在最佳條件下提取番瀉葉總黃酮，提取液過濾，洗滌，濾液用95%乙醇定容至100 mL；再移取2.50 mL提取液稀釋液，用95%乙醇定容至50 mL。移取4.00 mL上述樣品溶液，加入1.50 mL 0.20 mg·mL-1DPPH自由基溶液，用95%乙醇定容至10 mL，靜置一定時間后測定517 nm處[9-11]吸光度。按式(2)計算DPPH自由基清除率(%)：

(2)

式中：A1為4.00 mL樣品溶液+1.50 mL DPPH自由基溶液+95%乙醇的吸光度；A2為4.00 mL樣品溶液+95%乙醇的吸光度；A0為95%乙醇+1.50 mL DPPH自由基溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對番瀉葉總黃酮提取率的影響(圖1)

圖1 料液比對番瀉葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由圖1可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑乙醇用量的增加，番瀉葉總黃酮提取率先逐漸升高后緩慢下降，當料液比為1∶25時，總黃酮提取率最高。因此，選擇1∶25作為響應面實驗料液比的中心點。

2.1.2 超聲溫度對番瀉葉總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 超聲溫度對番瀉葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由圖2可知，隨著超聲溫度的升高，番瀉葉總黃酮提取率先逐漸升高后緩慢下降，當超聲溫度為70 ℃時，總黃酮提取率最高。因此，選擇70 ℃作為響應面實驗超聲溫度的中心點。

2.1.3 超聲時間對番瀉葉總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 超聲時間對番瀉葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，番瀉葉總黃酮提取率先逐漸升高后緩慢下降，當超聲時間為50 min時，總黃酮提取率最高。因此，選擇50 min作為響應面實驗超聲時間的中心點。

2.2 響應面實驗結(jié)果

2.2.1 響應面實驗設計與結(jié)果(表1)

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對表1數(shù)據(jù)進行擬合，得到二次多項式回歸模型方程:Y=3.96-0.035A+8.955×10-3B+0.11C-0.10AB+0.092AC-0.19BC-0.35A2-0.22B2-0.15C2。

表1 響應面實驗設計與結(jié)果Tab.1 Design and results of response surface methodologies

回歸模型的方差分析見表2。

表2 方差分析Tab.2 Variance analysis

由表2可知，回歸模型高度顯著(P<0.001)，失擬項不顯著，殘差及純誤差的數(shù)值極小，說明回歸模型的擬合度非常高，誤差較小，未知因素的影響很小，該模型具有合理性。一次項A、C對番瀉葉總黃酮提取率的影響高度顯著，B的影響顯著；交互項AB、AC、BC以及二次項A2、B2、C2對番瀉葉總黃酮提取率的影響高度顯著。各因素對番瀉葉總黃酮提取率影響的大小順序為：超聲時間(A)>料液比(C)>超聲溫度(B)。

2.2.2 響應面分析

各因素交互作用對番瀉葉總黃酮提取率影響的響應面圖及等高線圖如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對番瀉葉總黃酮提取率影響的響應面圖及等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot for effect of interaction between various factors on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

響應面3D曲面越陡峭，則該因素對番瀉葉總黃酮提取率的影響越大。由圖4可知，超聲時間對番瀉葉總黃酮提取率的影響最大，其次是料液比，超聲溫度的影響最小；兩因素交互作用均對總黃酮提取率的影響很大。對最佳工藝擬合方程求解，得到最佳提取工藝為：超聲時間50.50 min、超聲溫度67.92 ℃、料液比1∶27.6，在此條件下，番瀉葉總黃酮提取率的理論值為3.99%。

2.3 最佳工藝的驗證

根據(jù)實際操作性，將最佳提取工藝調(diào)整為：超聲時間50 min、超聲溫度68 ℃、料液比1∶28。準確稱量番瀉葉粉末5.00 g，在最佳提取條件下進行3次驗證實驗，得到番瀉葉總黃酮平均提取率為3.94%，RSD值為0.54%，與理論值相差0.05%。說明響應面法優(yōu)化得到的番瀉葉總黃酮提取工藝準確可靠。

2.4 體外抗氧化活性評價

2.4.1 反應時間的確定

按1.5方法測定樣品溶液與DPPH自由基溶液反應不同時間的吸光度，結(jié)果如圖5所示。

圖5 吸光度隨反應時間的變化曲線Fig.5 Change curve of absorbance with reaction time

由圖5可知，隨著反應時間的延長，吸光度逐漸減小，當反應時間超過40 min后，吸光度趨于穩(wěn)定，說明反應基本完全。因此，確定最佳反應時間為40 min。

2.4.2 對DPPH自由基的清除率

按1.5方法測定4.00 mL濃度為0.039 mg·mL-1樣品溶液對DPPH自由基的清除率為60.5%，RSD值為0.26%(n=3)。說明番瀉葉總黃酮提取液對DPPH自由基的清除能力較強。

2.4.3 樣品溶液濃度對DPPH自由基清除率的影響(圖6)

圖6 樣品溶液濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of sample solution concentration on scavenging rate of DPPH free radicals

由圖6可知，樣品溶液濃度越大，對DPPH自由基的清除率越高。

2.4.4 方法學考察

精密度：取4.00 mL濃度為0.039 mg·mL-1樣品溶液，加入1.50 mL DPPH自由基溶液，按1.5方法連續(xù)測定5次吸光度，分別為0.461 7、0.461 6、0.461 6、0.461 7、0.461 7，RSD值為0.01%。表明儀器精密度較好，誤差較小。

穩(wěn)定性：取同一份樣品溶液，顯色后，每間隔2 min測定一次吸光度，共測定5次，測得吸光度分別為0.461 7、0.461 1、0.460 7、0.460 2、0.459 8，RSD值為0.16%。表明樣品溶液在顯色反應后有較高的穩(wěn)定性。

重復性：取5份4.00 mL濃度為0.039 mg·mL-1樣品溶液，分別加入1.50 mL DPPH自由基溶液，按1.5方法測得吸光度分別為0.461 7、0.463 4、0.460 4、0.461 1、0.462 4，RSD值為0.25%。表明該方法重復性良好。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化得到番瀉葉總黃酮的最佳提取工藝為：超聲時間50 min、超聲溫度68 ℃、料液比1∶28(g∶mL)，在此條件下，番瀉葉總黃酮提取率為3.94%，RSD值為0.54%(n=3)，與理論值相差0.05%；番瀉葉總黃酮具有較強的抗氧化活性，當番瀉葉總黃酮濃度為0.039 mg·mL-1時，其對DPPH自由基的清除率為60.5%。