劉 波，向 建，向胤豪，周紅艷，黃文勝，胡 盛

(湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000)

4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶是多種激酶抑制劑，如組蛋白去乙?；?HDAC)、絲裂原活化蛋白激酶作用激酶(MNK)[1]、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)[2]等。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶同時(shí)抑制HDAC和MNK，可以增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性，為腫瘤治療提供了新途徑[3]；作為磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑[4-5]，對(duì)大鼠NPR-A的半數(shù)有效濃度EC50值達(dá)到10 nmol級(jí)，是一種新型強(qiáng)效NPR-A激動(dòng)劑[6]。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶的前藥和對(duì)映異構(gòu)體亦具有很好的藥學(xué)特性，具有較高的免疫抑制活性。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶具有離子通道(如鈣激活鉀通道SK3)抑制特性，可制成藥物制劑[4,7-10]，用于預(yù)防或治療與衰老或壓力相關(guān)的疾病、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病、凝血障礙、移植排斥反應(yīng)、某些炎性疾病、神經(jīng)退行性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)TNF-α相關(guān)疾病、病毒性疾病(包括丙型肝炎)、勃起功能障礙、以過(guò)度或異常細(xì)胞增殖為特征的疾病(癌癥)[5]、潮紅、由線粒體活性增強(qiáng)引起的疾病或障礙等[11]。

4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)是4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶類藥物的重要中間體，是MNK和莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合位點(diǎn)激酶(PIM)的雙重抑制劑[12]，其細(xì)胞活性IC50值達(dá)到了個(gè)位數(shù)，具有重要的藥物研究?jī)r(jià)值。目前，4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶的合成路線(圖1)僅有一條：以2,6-二氯吡啶(Ⅰ)為起始原料，經(jīng)硝化得到3-硝基-2,6-二氯吡啶(Ⅱ)，再經(jīng)氰化亞銅親核取代得到中間體2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶(Ⅲ)，經(jīng)氰基水解、硝基還原得到3-氨基-6-氯吡啶甲酰胺(Ⅳ)，再經(jīng)原甲酸三乙酯環(huán)合得到6-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮(Ⅴ)，最后經(jīng)三氯氧磷氯代得到目標(biāo)化合物4,6-二氯吡啶[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)。但該合成路線存在路線長(zhǎng)、產(chǎn)率低、成本高等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用，為此，作者對(duì)該合成路線進(jìn)行改進(jìn)，并通過(guò)1HNMR、ESI-HRMS對(duì)中間體和目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以獲得高產(chǎn)率質(zhì)量穩(wěn)定的4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶。

圖1 4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶的合成路線Fig.1 Synthetic route of 4,6-dichloropyrido[3,2-d]pyrimidine

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇、乙腈，色譜級(jí)，美國(guó)J.T.Baker公司；異丙醇、四氫呋喃(THF)、N,N-二甲基苯胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、芐基三乙基氯化銨(TEBA)、氰化亞銅、濃硫酸、發(fā)煙硝酸、硝酸鉀，市售；所用試劑均未經(jīng)純化直接使用。

SGW X-4型數(shù)字顯微熔點(diǎn)儀(溫度未經(jīng)校正)，上海精密儀器有限公司；Agilent LC Core System高效液相色譜儀，色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；Bruker AVANCE Ⅲ(600 MHz)型核磁共振波譜儀，TMS為內(nèi)標(biāo)；Quattro micro API型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(1100 Series LC/MSD Trap)，ESI離子源(噴霧電壓3.5 kV)，美國(guó)Agilent公司；ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.2 合成方法

1.2.1 3-硝基-2,6-二氯吡啶(Ⅱ)的合成

0 ℃攪拌下，將96%發(fā)煙硝酸(50 mL)滴加入裝有98%濃硫酸(100 mL)的250 mL茄型瓶中，滴加完后保溫?cái)嚢?0 min；將2,6-二氯吡啶(Ⅰ,15.0 g,102.0 mmol)分批加入到茄型瓶中，升溫至95 ℃，于95～97 ℃保溫反應(yīng)6 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開(kāi)劑石油醚-乙酸乙酯(10∶1，體積比，下同)，Rf=0.41；冷卻至室溫，倒入500 mL冰水中，冰浴下用30%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性，析出大量淡黃色固體；抽濾，濾餅水洗(50 mL×3)，烘干，得17.0 g淡黃色固體化合物Ⅱ，不經(jīng)純化，直接投入下一步。

1.2.2 2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶(Ⅲ)的合成

室溫(25℃)下，依次將NMP(150 mL)、TEBA(1.2 g,5.18 mmol)、化合物Ⅱ(10.0 g,52.0 mmol)加入到250 mL茄形瓶中，升溫至190 ℃緩慢(5 min)加入氰化亞銅(13.9 g,0.156 mol)，保溫反應(yīng)70 min,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開(kāi)劑石油醚-乙酸乙酯(5∶1)，Rf=0.25；趁熱倒入乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液中，攪拌15 min，析出黃棕色固體；靜置5 min待其分層，分離得乙酸乙酯層；水及固體層繼續(xù)加入乙酸乙酯(250 mL×2)攪拌15 min，分離得乙酸乙酯層；合并乙酸乙酯層，依次用水、飽和氯化鈉溶液各洗滌1遍，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得紅棕色固體；用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重結(jié)晶，得6.0 g淡黃色固體化合物Ⅲ。

1.2.3 3-氨基-6-氯吡啶甲酰胺(Ⅳ)的合成

室溫下，將無(wú)水乙醇(120 mL)、氯化亞錫(49.3 g,218.6 mmol)依次加入到250 mL茄形瓶中，攪拌溶解后緩慢(1 g·min-1)加入化合物Ⅲ(10.0 g,64.64 mmol)，室溫反應(yīng)30 min，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開(kāi)劑石油醚-乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.33；蒸干溶劑使成糊狀，用乙酸乙酯(1 000 mL)溶解，加入飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)，隨后用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7～8，析出大量白色固體；抽濾，將濾液分層，有機(jī)層依次用飽和碳酸氫鈉溶液(800 mL)、水各洗滌1遍，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得8.7 g黃色固體化合物Ⅳ，不經(jīng)純化，直接投入下一步。

1.2.4 6-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮(Ⅴ)的合成

室溫下，將化合物Ⅳ(9.3 g,54.4 mmol)、冰乙酸(163 mg,2.72 mmol,0.16 mL)、原甲酸三乙酯(161.2 g,1.09 mol,167 mL)加入250 mL茄形瓶中，140 ℃反應(yīng)4.5 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開(kāi)劑二氯甲烷-甲醇(20∶1)，Rf=0.30；冷卻至室溫，析出大量固體；抽濾，將濾餅烘干，得9.2 g黃色固體化合物Ⅴ，不經(jīng)純化，直接投入下一步。

1.2.5 4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)的合成

室溫下，將化合物Ⅴ(5.0 g,27.47 mmol)、N,N-二甲基苯胺(5.0 g,41.21 mmol,5.2 mL)、乙腈(150 mL)、三氯氧磷(16.9 g,109.9 mmol,10.2 mL)依次加入250 mL茄形瓶中，82 ℃回流攪拌反應(yīng)3.0 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開(kāi)劑石油醚-乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.45；蒸干溶劑后用二氯甲烷(200 mL)溶解，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH值至中性，靜置分層，分離得有機(jī)層，水層用二氯甲烷(100 mL×2)萃取；合并有機(jī)層，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水、飽和氯化鈉溶液(200 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，蒸干溶劑得黑棕色固體；用300目硅膠作固定相，石油醚-乙酸乙酯(20∶1)作流動(dòng)相，柱層析得4.5 g白色固體化合物Ⅵ。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的表征

化合物Ⅱ：產(chǎn)率85.3%。

化合物Ⅲ：產(chǎn)率63.4%，純度99.59%，熔點(diǎn)106～108 ℃。1HNMR(600 MHz,DMSO-d6),δ:8.82(d,J=8.8 Hz,1H),8.18(d,J=8.8 Hz,1H)，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。

化合物Ⅳ：產(chǎn)率93.7%，純度96.21%。ESI-HRMS，m/z：172.025 8 [M+H]+。

化合物Ⅴ：產(chǎn)率93.4%，純度98.96%。ESI-HRMS，m/z：182.011 3 [M+H]+。

化合物Ⅵ：產(chǎn)率82.7%，純度96.90%。1HNMR(600 MHz,DMSO-d6),δ:8.23(s,1H),8.15(d,J=8.6 Hz,1H),7.89(d,J=8.6 Hz,1H)。

2.2 合成工藝的改進(jìn)

2.2.1 化合物Ⅲ合成工藝的改進(jìn)

采用原合成工藝，化合物Ⅲ的產(chǎn)率僅25.7%[14]，后處理時(shí)使用了大量的甲苯(對(duì)皮膚、黏膜有刺激性，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用，且在體內(nèi)不易代謝失活)，純化時(shí)使用柱層析，使得反應(yīng)不易放大、效率低，導(dǎo)致4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶價(jià)格昂貴。因此，有必要對(duì)反應(yīng)溶劑、催化劑、投料比(氰化亞銅與化合物Ⅱ的用量比，以當(dāng)量計(jì))、反應(yīng)溫度、后處理方式等進(jìn)行改進(jìn)，以提高化合物Ⅲ的產(chǎn)率。

2.2.1.1 反應(yīng)溶劑對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響

在化合物Ⅱ用量為2 g、投料比為2.0∶1的條件下，考察二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、NMP、THF等4種反應(yīng)溶劑對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 反應(yīng)溶劑對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響Tab.1 Effect of reaction solvent on yield of compound Ⅲ

由表1可知，以DMSO、THF為反應(yīng)溶劑時(shí)，未能獲得化合物Ⅲ；以DMF為反應(yīng)溶劑時(shí)，化合物Ⅲ產(chǎn)率較低；以NMP為反應(yīng)溶劑時(shí)，化合物Ⅲ產(chǎn)率升至25.7%。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入0.05 eq.TEBA相轉(zhuǎn)移催化劑提高氰化亞銅在NMP中溶解度時(shí)，化合物Ⅲ產(chǎn)率由25.7%升至36.25%。

2.2.1.2 投料比對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響

以NMP為反應(yīng)溶劑，加入0.05 eq.TEBA相轉(zhuǎn)移催化劑，在化合物Ⅱ用量為2 g、反應(yīng)溫度為180 ℃的條件下，考察投料比對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 投料比對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響Tab.2 Effect of molar ratio of materials on yield of compound Ⅲ

由表2可知，固定化合物Ⅱ用量，逐漸增加氰化亞銅用量，當(dāng)投料比由1.5∶1增至4.0∶1時(shí)，化合物Ⅲ產(chǎn)率先升高后降低，在投料比為3.0∶1時(shí)產(chǎn)率達(dá)到最高，為47.3%。因此，將氰化亞銅用量由1.5 eq.調(diào)整為3.0 eq.。

2.2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響

以NMP為反應(yīng)溶劑，加入0.05 eq.TEBA相轉(zhuǎn)移催化劑，在化合物Ⅱ用量為2 g、投料比為3.0∶1的條件下，考察反應(yīng)溫度對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 反應(yīng)溫度對(duì)化合物Ⅲ產(chǎn)率的影響Tab.3 Effect of reaction temperature on yield of compound Ⅲ

由表3可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為190 ℃時(shí)，化合物Ⅲ產(chǎn)率最高，達(dá)到63.4%。因此，將反應(yīng)溫度由原工藝的180 ℃提高到190 ℃。并且，在后處理中用乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液代替有毒的甲苯，用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重結(jié)晶代替柱層析進(jìn)行純化，使得后處理過(guò)程更簡(jiǎn)單方便，安全有效，便于工藝放大。

綜上，確定化合物Ⅲ的合成工藝為：以NMP為反應(yīng)溶劑、以0.05 eq.TEBA為相轉(zhuǎn)移催化劑、氰化亞銅用量為3.0 eq.、反應(yīng)溫度為190 ℃、用乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液代替有毒的甲苯、用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重結(jié)晶代替柱層析進(jìn)行純化，化合物Ⅲ產(chǎn)率可提高到63.4%。

2.2.2 化合物Ⅵ合成工藝的改進(jìn)

采用原合成工藝，化合物Ⅵ的產(chǎn)率僅42.3%，并且以毒害作用較大的三氯氧磷作反應(yīng)溶劑，回流反應(yīng)溫度較高，反應(yīng)劇烈不易控制。因此，有必要對(duì)氯代試劑、堿試劑及其用量、反應(yīng)溶劑、回流反應(yīng)溫度等進(jìn)行改進(jìn)，以提高化合物Ⅵ的產(chǎn)率。

2.2.2.1 氯代試劑對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響

在0.5 eq.N,N-二甲基苯胺為堿試劑、化合物Ⅴ用量為1 g的條件下，分別以三氯氧磷、二氯亞砜為氯代試劑(用量3.0 eq.)合成化合物Ⅵ，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 氯代試劑對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響 Tab.4 Effect of chlorinated reagent on yield of compound Ⅵ

由表4可知，以二氯亞砜為氯代試劑時(shí)，不發(fā)生反應(yīng)；以三氯氧磷為氯代試劑時(shí)，化合物Ⅵ產(chǎn)率達(dá)到42.3%。因此，選擇三氯氧磷為氯代試劑。

2.2.2.2 堿試劑及其用量對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響

以三氯氧磷為氯代試劑，在化合物Ⅴ用量為1 g、反應(yīng)溫度為106 ℃的條件下，分別以N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、N,N-二甲基苯胺、DMF、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、三乙醇胺(TEA)、無(wú)機(jī)堿K2CO3作為堿試劑，使之與化合物Ⅴ的物質(zhì)的量比為1∶0.5合成化合物Ⅵ，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 堿試劑對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響Tab.5 Effect of base reagent on yield of compound Ⅵ

由表5可知，以N,N-二甲基苯胺為堿試劑時(shí)，化合物Ⅵ產(chǎn)率最高。因此，選擇堿試劑為N,N-二甲基苯胺。

在三氯氧磷為氯代試劑、化合物Ⅴ用量為1.0 eq.(1 g)、反應(yīng)溫度為106 ℃的條件下，逐漸增加堿試劑N,N-二甲基苯胺用量，考察堿試劑N,N-二甲基苯胺用量對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 堿試劑N,N-二甲基苯胺用量對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響Tab.6 Effect of N,N-dimethylaniline dosage on yield of compound Ⅵ

由表6可知，隨著堿試劑N,N-二甲基苯胺用量的增加，化合物Ⅵ產(chǎn)率逐漸升高。綜合考慮，選擇N,N-二甲基苯胺用量為1.5 eq.，此時(shí)化合物Ⅵ產(chǎn)率提高到83.6%。

2.2.2.3 反應(yīng)溶劑對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響

為了避免三氯氧磷作為溶劑，在3.0 eq.三氯氧磷為氯代試劑、1.5 eq.N,N-二甲基苯胺為堿試劑、化合物Ⅴ用量為1 g的條件下，分別以1,4-二氧六環(huán)、DMF、乙腈、二氯甲烷、THF、甲苯、乙酸乙酯作為反應(yīng)溶劑合成化合物Ⅵ，考察反應(yīng)溶劑對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 反應(yīng)溶劑對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響Tab.7 Effect of reaction solvent on yield of compound Ⅵ

由表7可知，以乙腈為反應(yīng)溶劑時(shí)，化合物Ⅵ產(chǎn)率最高，達(dá)到72.7%。

2.2.2.4 三氯氧磷用量對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響

以乙腈為反應(yīng)溶劑，在三氯氧磷為氯代試劑、1.5 eq.N,N-二甲基苯胺為堿試劑、化合物Ⅴ用量為1 g、回流反應(yīng)溫度下合成化合物Ⅵ，考察三氯氧磷用量對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 三氯氧磷用量對(duì)化合物Ⅵ產(chǎn)率的影響Tab.8 Effect of phosphorus oxychloride dosage on yield of compound Ⅵ

由表8可知，當(dāng)三氯氧磷用量為4.0 eq.時(shí)，化合物Ⅵ產(chǎn)率達(dá)到82.7%。

將回流反應(yīng)溫度由108 ℃降為82 ℃，反應(yīng)條件更溫和，操作更安全。

綜上，確定化合物Ⅵ的合成工藝為：以1.5 eq.N,N-二甲基苯胺作為堿試劑、以乙腈作為反應(yīng)溶劑、回流反應(yīng)溫度為82 ℃，化合物Ⅵ產(chǎn)率可提高到82.7%。

3 結(jié)論

以2,6-二氯吡啶為起始原料，經(jīng)硝化、親核取代、氰基水解、硝基還原、環(huán)合、氯代得到化合物4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶。在中間體2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶的合成過(guò)程中，將反應(yīng)溫度由180 ℃提高到190 ℃，氰化亞銅用量由1.5 eq.調(diào)整為3.0 eq.，同時(shí)加入芐基三乙基氯化銨作為相轉(zhuǎn)移催化劑改善氰化亞銅的溶解性，后處理以乙酸乙酯-冰水混合溶液代替甲苯，并且用重結(jié)晶法代替柱層析法進(jìn)行純化，2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶的產(chǎn)率由25.7%提高到63.4%。在最后一步氯代過(guò)程中，以1.5 eq.N,N-二甲基苯胺作為堿試劑、用乙腈代替三氯氧磷作反應(yīng)溶劑、回流反應(yīng)溫度為82 ℃，避免了三氯氧磷的毒性危險(xiǎn)，使得反應(yīng)更溫和穩(wěn)定，產(chǎn)率由42.3%提高到82.7%。通過(guò)對(duì)上面兩步反應(yīng)條件的改進(jìn)，4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶總產(chǎn)率從8.1%提高到39.1%，該結(jié)果對(duì)4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶類化合物的合成工藝研究具有重要價(jià)值。