劉鵬冀，王文強，2，苑彩霞，2*

（1. 延安大學生命科學院；2. 陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安 716000）

隨著分子生物學研究的不斷發(fā)展，越來越多的昆蟲分類研究者將分子生物技術(shù)應(yīng)用于昆蟲多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、近緣種識別、基因遺傳、進化關(guān)系等領(lǐng)域［1-2］。研究昆蟲DNA 信息的基礎(chǔ)便是昆蟲DNA的提?。?］。常規(guī)的DNA 提取方法一般使用新鮮的昆蟲樣品作為材料，但研究所需要的昆蟲樣本大多來自于野外采集，采集到的標本在攜帶和運輸?shù)倪^程中長時間放置易變質(zhì)，DNA 易降解。因此進行分子研究的昆蟲標本在野外多采用無水乙醇進行保存，這種保存方法經(jīng)濟、簡便且無毒，能在一定程度上減緩DNA 的降解速度，但是長時間的酒精浸泡也會引起細胞中的蛋白質(zhì)與DNA 間產(chǎn)生嚴重的交聯(lián)，導(dǎo)致提取到的DNA 質(zhì)量變差，難以擴增目標序列，不能達到預(yù)期的實驗?zāi)繕?，有時可通過增加樣品數(shù)量或進行多次DNA 提取來選出合格的DNA 樣品［4］。而對于數(shù)量較少的珍貴酒精浸制標本則無法用增加樣品數(shù)量的方法來提高DNA 產(chǎn)量，從而影響整體實驗的效果和進度。通過預(yù)處理來提高DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量就成了酒精浸制昆蟲標本的關(guān)鍵步驟。

高質(zhì)量的DNA 對于解決物種或基因之間的關(guān)系、物種的起源和傳播等生物學問題至關(guān)重要，若是通過預(yù)處理方式提高長期保存的酒精浸制標本DNA 提取的濃度和質(zhì)量，則能夠大大提高可用于分子研究的標本范圍，這有助于進行更加準確的系統(tǒng)發(fā)育判斷，同時也有助于進行更加廣泛的分子問題研究。近年來，一些研究者在干制昆蟲標本DNA 提取前進行預(yù)處理以達到提高DNA 質(zhì)量和產(chǎn)量的目的［5-11］。目前干制昆蟲標本最常用的樣品預(yù)處理物質(zhì)有0.9%NaCl溶液、Tris-EDTA 鹽水緩沖液（STE）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）和無菌水，0.9%NaCl 溶液、STE 鹽水緩沖液、PBS 磷酸緩沖鹽溶液對干制昆蟲標本的基因組DNA 的得率均有一定程度的提高，無菌水處理則會降低DNA的得率［1，4，12］。HUANG等［2］通過對瓢蟲干制標本預(yù)處理的研究發(fā)現(xiàn)0.9%NaCl溶液和STE 緩沖液的預(yù)處理效果優(yōu)于PBS 緩沖液。對于昆蟲酒精浸制標本而言，目前尚不清楚這4 種預(yù)處理方式是否具有同樣的提升效果。

朽木甲亞科Alleculinae 昆蟲隸屬鞘翅目Coleoptera，擬步甲科Tenebrionidae，是重要的傳粉昆蟲，但也侵害植物，屬于進出口竹材的檢疫對象［13］。本研究以酒精浸泡的朽木甲標本作為研究對象，使用0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液和無菌水4 種物質(zhì)分別對其進行預(yù)處理，借鑒其他學者［3，14-23］對昆蟲標本DNA 提取的研究經(jīng)驗，提取其DNA 并對線粒體COI 基因片段及28S-D2 核基因片段進行PCR 擴增，并對4 種預(yù)處理方式提取的DNA 濃度及凝膠電泳條帶質(zhì)量進行比較分析，篩選出對朽木甲酒精浸制標本DNA 提取優(yōu)化效果最佳的處理方式。

1 材料與方法

1.1 實驗標本

試驗所用昆蟲標本為阿爾泰櫛甲指名亞種Cteniopinus（s. str.）altaicus altaicus（Gebler，1829）酒精浸制標本采集于陜西省子午嶺國家級自然保護區(qū)，均用75%乙醇保存，帶回實驗室后用無水乙醇-20 ℃保存，標本信息見表1。

表1 標本信息

1.2 研究方法

1.2.1 預(yù)處理方式

將昆蟲標本去掉鞘翅和腹部，用無菌水反復(fù)沖洗掉昆蟲體表酒精，放在烘箱中50 ℃烘10 min，以去除標本體內(nèi)的酒精，隨后將標本放入離心管，每管內(nèi)放1個標本。將蟲體分為5組，每組進行3次重復(fù)，分別進行以下處理：①滅菌0.9%NaCl 溶液浸泡24 h；②滅菌STE 緩沖液浸泡24 h；③滅菌PBS 溶液浸泡24 h；④無菌水浸泡24 h；⑤CK 對照處理，繼續(xù)用無水乙醇浸泡，浸泡處理期間室溫保持在20 ℃，每個樣本加1 mL浸泡液。

1.2.2 DNA提取

參照昆蟲DNA 提取試劑盒（Omega Bio-tek，USA）提取并進行以下優(yōu)化：

1）預(yù)處理的標本從浸泡液中取出后用無菌水沖洗掉表面浸泡液，烘干體表浸泡液后放入1.5 mL無酶離心管中，避免殘留預(yù)處理液對提取步驟產(chǎn)生影響；

2）直接在1.5 mL 微量無酶離心管中加入液氮，使用一次性微管杵粉碎樣品至粉末狀，減少在研缽中研磨再倒入離心管中造成的樣品損失，從而降低操作誤差對實驗結(jié)果的影響；

3）延長空柱子離心時間至10 min，避免乙醇殘留對下游實驗的影響；

4）洗脫前將Elution Buffer 預(yù)熱至60 ℃，再加入柱子中，并在孵育5 min 后進行2 次洗脫，避免部分樣品產(chǎn)物濃度偏低。

使用微量紫外分光光度計測定每個樣品DNA濃度及OD 值，用來體現(xiàn)DNA 質(zhì)量。將提取后DNA保存于-20 ℃冰箱中用于PCR擴增。

1.2.3 PCR擴增

采用AG 2×Pro Master Mix（湖南艾科瑞生物工程有限公司）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，無菌水7.4 μL。PCR 反應(yīng)溫度體系：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性30 s；48 ℃退火30 s，循環(huán)35 次；70 ℃延伸50 s；72 ℃最終延伸50 s。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物序列見表2。

表2 引物序列信息[24-25]

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件正態(tài)性和方差齊性檢驗，采用平均值±標準差（Mean SD）表示，進行單因素方差分析，P<0.05 與P<0.01 分別表示差異顯著與極顯著。采用GraphPad Prism 8繪制DNA 濃度和凝膠電泳灰度值圖。采用Image J 對凝膠電泳條帶灰度值進行測量。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同預(yù)處理DNA濃度及純度分析

為了研究不同預(yù)處理方式對DNA 提取質(zhì)量的影響，通過微量紫外分光光度計對不同預(yù)處理組DNA提取樣本的OD值和DNA濃度進行檢測（圖1）。不同預(yù)處理方式的OD260/280值在1.729~1.849 之間，純度均在合理范圍內(nèi)，且沒有顯著差異。從圖1 中可以看出，不同預(yù)處理方式對DNA 濃度所造成的影響差異較大，4 種預(yù)處理方式中除了無菌水，0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液其他3 種預(yù)處理方式均對DNA 濃度有顯著提升（P<0.05），其中PBS預(yù)處理的DNA 提取濃度最高，相較于對照組和無菌水處理提高極顯著（P<0.01）。

2.2 基因片段的PCR擴增

提取到足夠濃度的DNA 后，還需要基因片段足夠完整以保證PCR 擴增能夠順利進行，因此進一步分別對線粒體COI 基因片段和核基因28S-D2 基因片段的PCR 擴增結(jié)果進行凝膠電泳拍照和灰度值的分析（圖2和圖3）。

圖1 不同預(yù)處理方式DNA濃度顯著性分析圖

由圖2 可知，相較于無菌水處理，經(jīng)過其他3 種預(yù)處理方式的凝膠電泳條帶更加清晰明亮，其中N2和P3 這2 個條帶最為明亮。對照組條帶清晰，但是不如0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液預(yù)處理組明亮，說明0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液和PBS緩沖液這3 種預(yù)處理方式有助于保護DNA 鏈的完整性，有利于PCR 的擴增，而無菌水處理則不利于PCR 擴增。由圖3 可見，對于線粒體COI 基因片段，預(yù)處理方式對于凝膠電泳條帶灰度值沒有顯著的提升（P>0.05）。

圖2 2種引物PCR凝膠電泳圖

由圖3 可以得出，對于核基因28S-D2 基因片段，0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液這3 種預(yù)處理的灰度值相較于無菌水處理均提升極顯著（P<0.01），相較于對照組提升顯著（P<0.05）。圖2中PBS 緩沖液和0.9%NaCl 溶液預(yù)處理條帶更加明亮，P3 條帶最為明亮，說明PBS 預(yù)處理對核基因PCR 擴增優(yōu)化效果更好。H3 幾乎沒有擴增出條帶，其他無菌水的條帶亮度也很微弱，說明無菌水對核基因PCR 擴增的負面影響更大，相較于對照組更易使DNA 片段斷裂。

圖3 2種引物PCR凝膠電泳灰度值顯著性分析圖

3 討論

通過DNA 提取濃度和凝膠電泳結(jié)果表明：0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液和PBS 緩沖液3 種預(yù)處理方式能夠有效提高提取的DNA 濃度，并有助于基因片段的擴增，其中使用PBS 緩沖液進行預(yù)處理對于酒精浸制朽木甲標本DNA 的綜合提取優(yōu)化效果最好。HUANG 等［2］在瓢蟲干制標本的預(yù)處理對比中發(fā)現(xiàn)0.9% NaCl 溶液、STE 緩沖液的預(yù)處理效果優(yōu)于PBS 緩沖液。標本的預(yù)處理需要緩沖液調(diào)節(jié)滲透壓和pH 值，通過緩慢地滲透作用使細胞在盡可能不被破壞的情況下恢復(fù)到正常的生理環(huán)境，這有利于提高后續(xù)DNA 提取的質(zhì)量。PBS 緩沖液和STE 緩沖液均能起到這樣的作用，根據(jù)之前有關(guān)DNA 提取的研究和本實驗的結(jié)果推測：對于昆蟲來說，在干制標本中使用STE 緩沖液進行預(yù)處理有助于脫水的肌肉組織緩慢的恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)，從而優(yōu)化DNA提取的效果［1-2，4，6，14］。在酒精浸制標本中使用PBS 緩沖液進行預(yù)處理有助于解決長時間的酒精浸泡引起細胞中的蛋白質(zhì)與DNA 間產(chǎn)生嚴重交聯(lián)的問題，從而優(yōu)化DNA 提取效果。這樣在對不同保存方式的昆蟲DNA 進行提取預(yù)處理時可以選擇更加合適的試劑，有助于對昆蟲基因的進一步研究。

本研究得到不同預(yù)處理方式對昆蟲樣品提取到的DNA的OD260/280值差距不大，結(jié)合李枷霖等［1］對干制昆蟲標本的預(yù)處理方式研究結(jié)果，推測其原因可能是：1）DNA 的OD260/280值的大小主要與樣本的種類有關(guān)，不同的處理方式對其影響較??；2）本實驗所采用的昆蟲標本保存條件穩(wěn)定，保存時間不是很長，DNA 的質(zhì)量相對較高，從OD 值看不出不同預(yù)處理方式造成的差異。

從圖3 可以看出0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液3 種預(yù)處理方式對于核基因的擴增提升效果極顯著。而對于線粒體基因條帶的擴增提升效果并不顯著。由此推測0.9% NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液這3 種預(yù)處理方式對于昆蟲酒精浸制標本核基因DNA 片段的擴增優(yōu)化效果更佳，其中經(jīng)過PBS預(yù)處理擴增出的條帶更加明亮。

張德華等［4］認為使用無菌水進行預(yù)處理在換水過程中會使部分細胞內(nèi)DNA 丟失，因此為避免細胞DNA 流失，實驗在用無菌水預(yù)處理的過程中并未進行換水操作。但是相較于對照組在樣品DNA 的濃度及凝膠電泳的圖像上并沒有看出對于樣品DNA提取的優(yōu)化效果。從圖2 可以看出，用無菌水進行預(yù)處理后對核基因片段的擴增效果甚至不如對照組，起到了負面的效果，因此無菌水在預(yù)處理的過程中不但易使細胞吸水破裂降低提取到的DNA 濃度，還會使DNA 片段斷裂，影響基因PCR 的擴增效果。在昆蟲DNA 提取的過程中應(yīng)盡量減少昆蟲樣本與無菌水的接觸。

0.9%NaCl溶液、STE緩沖液、PBS緩沖液和無菌水4 種預(yù)處理方式對朽木甲酒精浸制標本DNA 質(zhì)量濃度及凝膠電泳圖像的結(jié)果表明，使用無菌水不會提高DNA 提取的產(chǎn)量，且會降低PCR 擴增的效果，對DNA 的提取效果起到負面的作用；使用0.9%NaCl溶液、STE緩沖液、PBS緩沖液對朽木甲酒精浸制標本進行預(yù)處理可以提高DNA 提取濃度，對DNA 基因片段擴增效果也有提升，特別是在核基因片段中優(yōu)化效果更好。綜合來看使用PBS 緩沖液對朽木甲酒精浸制標本進行預(yù)處理對DNA 的提取效果最佳，這有助于優(yōu)化昆蟲DNA 提取的方法和思路。為在提取昆蟲DNA 的過程中，面對不同保存方式、不同基因片段進行預(yù)處理提供了更多的參考，減少了在DNA 提取過程中標本數(shù)量的消耗，一定程度上擴展了可研究標本的范圍，為后續(xù)的分子研究工作奠定基礎(chǔ)。