李 歡, 魏雅麗, 閆幫國(guó), 孫 毅, 和潤(rùn)蓮, 李義林, 方海東

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源學(xué)院, 成都 611130; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所, 云南 元謀 651300)

氮(N)、磷(P)作為主要養(yǎng)分元素，對(duì)維持地球生物化學(xué)循環(huán)，保證生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)有重要作用，同時(shí)N，P也是自然陸地生態(tài)系統(tǒng)中的主要限制性元素[1-2]。然而由于化石燃料燃燒所產(chǎn)生的N沉降[3-4]，導(dǎo)致土壤中的N含量顯著提高，改變了土壤中原有的養(yǎng)分限制模式，主要觀點(diǎn)認(rèn)為它緩解了原有的N限制，轉(zhuǎn)變成P限制，另一些觀點(diǎn)認(rèn)為土壤養(yǎng)分限制模式轉(zhuǎn)變?yōu)镹，P共同限制[5-6]。土壤酶直接參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中C，N，P的循環(huán)，如參與土壤碳轉(zhuǎn)化的β-D-葡糖苷酶(BG)，參與土壤氮轉(zhuǎn)化的β-1,4-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NAG)和脲酶(URE)，以及參與土壤磷轉(zhuǎn)化的磷酸酶(AP)等[7]。這些酶對(duì)環(huán)境因子敏感，可作為評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量和養(yǎng)分供應(yīng)能力的重要指標(biāo)[8-9]。

土壤酶本身作為一種蛋白質(zhì)，其合成過(guò)程對(duì)氮的需求較大[10]，因此氮的豐缺對(duì)土壤酶活性也具有重要的調(diào)控作用。勒佳佳等[11]對(duì)天山高寒草原土壤酶活性研究發(fā)現(xiàn)氮添加顯著增加BG和β-1,4木糖苷酶活性，而李歡等[12]發(fā)現(xiàn)干熱河谷土壤BG，NAG，URE和AP酶活性與土壤C有關(guān)。樊博等[13]研究干熱河谷土壤酶活性對(duì)碳氮添加的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，碳氮交互作用顯著影響了干熱河谷土壤的AP，BG和亮氨酸胺肽酶活性。曾泉鑫等[14]研究氮添加對(duì)毛竹林土壤微生物碳磷限制時(shí)發(fā)現(xiàn)，氮添加顯著降低了NAG活性和N∶P酶活性比，提高了AP酶活性和C∶N酶活性比，加劇了微生物C，P限制。Marklein等[15]研究發(fā)現(xiàn)氮添加能夠提高磷酸酶活性，從促進(jìn)磷循環(huán)速率。當(dāng)養(yǎng)分限制發(fā)生變化時(shí)(如，從N限制到P限制)，微生物可能會(huì)調(diào)整相關(guān)酶的生產(chǎn)(如增加磷酸酶的活性)，以平衡營(yíng)養(yǎng)需求(微生物需求)和供應(yīng)(周?chē)h(huán)境)之間的營(yíng)養(yǎng)平衡[16-17]。

植物同樣受到氮磷養(yǎng)分的限制[1-2]，但是不同的土壤中植物受到氮磷限制的程度不同。事實(shí)上，植物因不同土壤而異，分別會(huì)受到氮限制、磷限制或者氮磷共限制[18]。土地利用對(duì)不同土壤上植物生長(zhǎng)限制養(yǎng)分的影響還缺乏充分研究。植物與土壤酶活性對(duì)養(yǎng)分添加是否具有相同的響應(yīng)特征還存在很大的不確定性。

元謀干熱河谷是西南橫斷山區(qū)中的生態(tài)脆弱區(qū)，通過(guò)土壤養(yǎng)分管理促進(jìn)植被恢復(fù)，對(duì)改善該區(qū)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。本研究通過(guò)在不同土地利用類(lèi)型土壤中設(shè)置不同的養(yǎng)分添加處理，以車(chē)軸草(TrifoliumrepensL.)作為模式植物，比較分析不同土地利用類(lèi)型植物生長(zhǎng)狀況和酶的活性對(duì)氮磷添加的響應(yīng)，探討不同土地利用類(lèi)型下植物生長(zhǎng)的限制養(yǎng)分和養(yǎng)分對(duì)土壤酶活性的調(diào)控作用，并揭示植物生長(zhǎng)與土壤酶活性在養(yǎng)分處理下的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

元謀縣干熱河谷區(qū)內(nèi)(101°35′—102°06′E，25°23′—26°06′N(xiāo))水熱矛盾突出，海拔差異大，氣候呈垂直氣候帶狀分布，年均降水量約680 mm，年均蒸發(fā)量約3 215 mm，干燥度(蒸發(fā)量/降水量)達(dá)4.5以上。隨海拔升高，植被群落類(lèi)型由稀樹(shù)草原向灌木林和常綠闊葉林過(guò)渡。本研究在野外采集元謀縣6種典型土地利用類(lèi)型土壤，即灌木林地、草地、有林地、旱地、水澆地和侵蝕裸地，其土壤類(lèi)型均為燥紅土。每種利用類(lèi)型有5個(gè)重復(fù)采樣點(diǎn)，其中每個(gè)采樣點(diǎn)再選取10個(gè)點(diǎn)采集混合樣，運(yùn)到云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行土壤性質(zhì)分析，部分土壤置于溫室大棚內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選擇車(chē)軸草(TrifoliumrepensL.)作為測(cè)試植物。車(chē)軸草是一種常見(jiàn)的多年生豆科草本植物，是土壤功能恢復(fù)中常用的修復(fù)植物之一[19-20]。車(chē)軸草在元謀當(dāng)?shù)匾巴鉀](méi)有分布，在當(dāng)?shù)赝寥乐袥](méi)有特異病原體，因此不會(huì)干擾養(yǎng)分對(duì)植物生長(zhǎng)的作用。試驗(yàn)因子設(shè)計(jì)包括6種土地利用類(lèi)型，5種養(yǎng)分處理，每個(gè)處理重復(fù)5次(6種土地利用類(lèi)型×5個(gè)處理×5種重復(fù)=150盆)。除去粗糙根和石頭，土壤樣品自然風(fēng)干過(guò)2 mm篩并充分混合后，取一部分土樣測(cè)定土壤養(yǎng)分性質(zhì)(表1)，另一部分鮮土等量裝入花盆中(上直徑10 cm×下直徑7 cm×高度13 cm)約1 kg。將花盆分成5份，做5個(gè)處理，分別為：(1) 對(duì)照。不添加氮磷(CK)；(2) 添加氮(N)(硝酸銨，0.078 5 g N/盆，相當(dāng)于每1 hm2加100 kg N )；(3) 添加磷(P)(磷酸二氫鉀，0.039 2 g P/盆，相當(dāng)于每1 hm2添加50 kg P的標(biāo)準(zhǔn))；(4) 添加氮磷(NP)(硝酸銨+磷酸二氫鉀，0.078 5 g N/盆+0.039 2 g P/盆)；(5) 添加有機(jī)質(zhì)(OM)(幾丁質(zhì)+植酸鉀，0.078 5 g N/盆+0.039 2 g P/盆)。每盆放15～20粒車(chē)軸草種子，萌發(fā)后，每盆只留10株植物苗，盆栽試驗(yàn)期間，每天澆水2次(約12.4 mm)。4個(gè)月后收獲植物并采集土壤，土壤鮮土混勻并過(guò)2 mm篩放置在4℃冰箱中保存，測(cè)定土壤酶活性。

表1 土壤養(yǎng)分及其化學(xué)計(jì)量學(xué)特征

1.3 測(cè)試項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤性質(zhì)測(cè)定 pH值采用酸度計(jì)測(cè)定(土∶水=1 g∶2.5 ml)；總氮(TN)、總碳(TC)采用元素分析儀測(cè)定；全磷(TP)采用鉬銻抗比色法；鈣(Ca)、鉀(K)、硼(B)、鎂(Mg)、錳(Mn)等全量元素采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP)測(cè)定；銨態(tài)氮、硝態(tài)氮采用2 mol/LKCL溶液提取，分別采用水楊酸法[21]和采用氯化釩法[22]；有效磷(Olsen-P)采用孔雀石綠測(cè)定法。

1.3.2 土壤酶活性測(cè)定 土壤酶活性測(cè)定采用熒光底物試驗(yàn)方法[23]，其中測(cè)定β-D-葡糖苷酶(BG)、酸性磷酸酶(AP)、β-1、4-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NAG)采用pH值為5.0的50 mmol/L醋酸緩沖液[24]。在微孔板中加入50 μl 4-甲基傘形酮(MUB)為標(biāo)準(zhǔn)物，另一部分孔中加入50 μl底物，分別為4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷(BG)，4-甲基傘形酮酰磷酸酯(AP)，4-甲基香豆素-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(NAG)。在標(biāo)準(zhǔn)物和底物基礎(chǔ)上加入150 μl土壤懸液，并在標(biāo)準(zhǔn)物和底物孔中設(shè)置無(wú)土壤的對(duì)照[25]。所有酶測(cè)定時(shí)均放在恒溫?fù)u床在120 r/min下培養(yǎng)3 h，溫度為25℃。然后放入Spark 20 M全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀測(cè)定，測(cè)定時(shí)由儀器加樣器加入10 μl mol/L NaOH到微孔板中。激發(fā)光設(shè)置為365 nm，發(fā)射光為450 nm。脲酶(URE)測(cè)定時(shí)，加入pH值為5.0的醋酸緩沖液，并加入尿素底物，至25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，加入60 μl水楊酸溶液和60 μl次氯酸鈉溶液，反應(yīng)50 min后，用650 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光率，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用銨態(tài)氮溶液測(cè)定[26]。

1.3.3 植物生物量測(cè)定 植物生物量通過(guò)70℃連續(xù)烘干植物樣品至恒重稱(chēng)重得出。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0對(duì)土地利用類(lèi)型和養(yǎng)分添加進(jìn)行多因素方差分析法(ANOVA)分析；對(duì)植物生物量和土壤酶活性的影響采用LSD多重比較方法；對(duì)土壤酶活性與植物生物量的相關(guān)性采用回歸分析法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生物量對(duì)氮磷添加的響應(yīng)特征分析

植物生物量對(duì)P添加具有顯著響應(yīng)，灌叢、草地、森林和裸地這4種土地利用類(lèi)型的P或N+P添加處理的植物生物量顯著大于CK和N添加處理(圖1)。且灌叢、草地、森林土壤NP添加處理下的植物生物量顯著高于單施P肥處理。結(jié)果顯示灌叢、草地、森林、新農(nóng)和裸地的+P處理生物量比CK分別增加了724.14%，782.93%，1 022.50%，37.38%，505.17%，而常農(nóng)+P處理生物量比CK減少了25.73%。

注：CK表示對(duì)照；N表示N添加；P表示P添加；NP表示N，P同時(shí)添加；OM表示有機(jī)態(tài)氮磷添加。圖中不同字母表示相同土地利用類(lèi)型下養(yǎng)分處理的差異顯著(p<0.05)，下圖同。

然而，新農(nóng)和常農(nóng)的植物生物量在N，P添加處理下差異不顯著，新農(nóng)在P添加處理下植物生物量最大，比CK處理增加了37.38%；常農(nóng)在NP添加處理下植物生物量最大，比CK處理增加了33.86%，在P添加處理下植物生物量最小，比CK處理降低了25.73%。由表2可知，植物生物量受到土地利用類(lèi)型和養(yǎng)分添加處理顯著影響，其中養(yǎng)分添加處理是最重要因素。

表2 土地類(lèi)型與養(yǎng)分添加處理間的雙因素方差分析(F值)

2.2 土壤酶活性對(duì)氮磷添加的響應(yīng)特征分析

土地利用類(lèi)型顯著影響土壤酶活性，而養(yǎng)分添加處理對(duì)各土壤酶活性均無(wú)顯著影響(表2)。灌叢土壤AP，BG酶活性中最高，顯著大于其他類(lèi)型的土壤，NAG活性在灌叢和草地土壤中最高，顯著大于其他類(lèi)型，而URE酶活性在常年耕作農(nóng)田中最高，這4種土壤酶活性均在裸地土壤中最低。不同土地利用類(lèi)型下，AP，BG，NAG這3種土壤酶活性大致呈灌叢>草地>森林>新農(nóng)>常農(nóng)>裸地變化趨勢(shì)，灌叢的AP，BG，NAG比分別是裸地的9，26，16倍；URE土壤酶活性大致呈常農(nóng)>新農(nóng)>草地>森林>灌叢>裸地，常農(nóng)的URE是裸地的7倍(圖2)。

圖2 不同土地利用類(lèi)型和養(yǎng)分處理下的土壤酶活性

2.3 植物生物量、土壤酶活性與養(yǎng)分的相關(guān)性分析

結(jié)合植物生物量、土壤酶活性和土壤養(yǎng)分背景值相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)發(fā)現(xiàn)，植物生物量?jī)H與土壤有效養(yǎng)分(銨態(tài)氮、有效磷)相關(guān)，與土壤酶活性、全量養(yǎng)分和硝態(tài)氮不相關(guān)；除URE酶外，其余土壤酶均與土壤TC，TN含量顯著相關(guān)，且相互間呈顯著相關(guān)關(guān)系；URE酶僅與有效養(yǎng)分(銨態(tài)氮、有效磷)相關(guān)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)植物生物量對(duì)P添加響應(yīng)強(qiáng)烈，且在P和NP養(yǎng)分添加條件下灌叢、草地、森林和裸地的植物生物量顯著高于CK和N養(yǎng)分添加處理，整體上看NP同時(shí)添加的植物生物量顯著高于單施P肥處理。這可能是因?yàn)镹，P同時(shí)添加，可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，刺激植物生長(zhǎng)，促進(jìn)P的吸收，這與盧廣超[27]、范愛(ài)連[28]、Bucci[29]等研究一致。且通過(guò)雙因素方差分析(表2)和相關(guān)性分析(表3)發(fā)現(xiàn)，植物生物僅與有效養(yǎng)分(硝態(tài)氮、有效磷)相關(guān)，由此可見(jiàn)氮磷含量是影響植物生物量變化最關(guān)鍵因素。進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)可能為序列限制(首先受到P限制，當(dāng)P限制緩解后開(kāi)始出現(xiàn)N限制，造成N，P共同添加效果大于單獨(dú)的P添加)。研究區(qū)干熱河谷屬于熱帶亞熱帶區(qū)域，前人研究發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的P限制出現(xiàn)在具有高度風(fēng)化土壤的熱帶和溫帶森林中[30-31]，與本研究結(jié)果一致。因此，P限制是影響干熱河谷地區(qū)植被生長(zhǎng)的主要因素之一。P添加能夠緩解P限制產(chǎn)生的影響，但會(huì)將植物生長(zhǎng)所受的限制進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镹限制或N，P共同限制，這與鄭斯元[32]的研究一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)侵蝕裸地添加有機(jī)質(zhì)的植物生物量最高，說(shuō)明有機(jī)質(zhì)可有效促進(jìn)裸地的植物生長(zhǎng)，這可能與裸地土壤中有機(jī)質(zhì)嚴(yán)重缺乏有關(guān)。值得注意的是，本研究中采用一種豆科植物作為研究對(duì)象，其養(yǎng)分限制模式可能與非豆科植物不同。但是本研究中發(fā)現(xiàn)除了極少個(gè)例外，車(chē)軸草根系并未形成根瘤，可能與土壤中缺少對(duì)應(yīng)的根瘤菌有關(guān)，因此，可以排除固氮對(duì)車(chē)軸草N，P限制的影響。

表3 植物生物量、土壤酶活性與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性

本研究中土壤酶活性受土地利用類(lèi)型的顯著影響(圖2)，但各養(yǎng)分處理間差異不顯著。土壤酶參與土壤的各種生化反應(yīng)，其活性體現(xiàn)了反應(yīng)的強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化情況[33]。土壤中的各種物質(zhì)轉(zhuǎn)化主要由磷酸酶、脲酶、水解酶等參與的酶促反應(yīng)產(chǎn)生，可以有效反映土壤C，N，P養(yǎng)分之間的變化特征。基于資源配置理論，在添加N，P處理下，微生物生長(zhǎng)和酶合成過(guò)程中的限制養(yǎng)分得以緩解，從而促進(jìn)土壤酶活性增加[34]。然而這里并未發(fā)現(xiàn)氮磷對(duì)土壤酶活性的促進(jìn)作用，表明其他因素可能限制了土壤酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)BG，NAG和AP活性與土壤背景C含量之間具有高度相關(guān)性，說(shuō)明C含量可能是限制酶活性變化的重要影響因子。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)土壤酶活性與植物生物量不存在明顯相關(guān)關(guān)系(表3)。尤為明顯的是，裸地土壤中添加P，N+P和OM時(shí)植物生物量顯著提高(圖1)，但土壤酶活性仍處于較低水平，與CK無(wú)顯著差異(圖2)，這可能與土壤酶活性和植物生長(zhǎng)的調(diào)控養(yǎng)分不一致有關(guān)。

4 結(jié) 論

元謀干熱河谷土壤類(lèi)型和氮磷養(yǎng)分都會(huì)對(duì)植物生物量產(chǎn)生影響，土壤氮磷養(yǎng)分是最關(guān)鍵因素。灌叢、草地、森林和裸地的植物生長(zhǎng)受P限制，而農(nóng)田土壤(新農(nóng)和常農(nóng))的養(yǎng)分限制不明顯。同時(shí)添加N，P比單施P肥對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更明顯。而土壤酶活性變化與土地利用類(lèi)型相關(guān)，灌叢草地的BG，NAG和AP活性較高，而農(nóng)田的URE活性較高。土壤酶活性與土壤C含量緊密相關(guān)，不受氮磷添加的影響，與植物生長(zhǎng)之間沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)特征。土壤酶活性不能作為指示土壤支撐植物生長(zhǎng)的指標(biāo)。