孫 秋，王文姌，張洪財(cái)，周 鵬

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)a.附屬第一醫(yī)院；b.中醫(yī)藥研究院；c.繼續(xù)教育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

柴胡（Bupleuri Radix）是中醫(yī)常用的藥物。其味苦涼、性微寒，最早出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有解表和里、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣之功效，用于治療肝郁氣滯、子宮脫垂、月經(jīng)不調(diào)、胸脅脹痛。2020 版《中國(guó)藥典》傘形科植物柴胡Bulpeurum chinese DC.和狹葉柴胡Bulpeurum scorzoneri folium Willd.的干燥根。按照性狀，分別稱為“北柴胡”和“南柴胡”[1]。柴胡的應(yīng)用已有2000 多年的歷史，是治療少陽(yáng)證的首選要藥。

化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，柴胡中主要含有揮發(fā)油、黃酮、有機(jī)酸、皂苷及甾醇類[2-5]。藥理學(xué)研究證明，柴胡具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗炎抗菌、增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗腫瘤等作用[6-9]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、藥物及儀器

色譜級(jí)甲酸（批號(hào)：202012 北京DIKMA 公司）；乙腈（批號(hào)：20201108 北京DIKMA 公司）；蒸餾水（批號(hào)：20210510H 廣州屈臣氏食品有限公司）；柴胡皂苷A（批號(hào)：DST200509-006 成都德思特生物技術(shù)有限公司）；柴胡皂苷D（批號(hào)：DST201015-011 成都德思特生物技術(shù)有限公司）。

柴胡購(gòu)于北京同仁堂哈爾濱分公司（批號(hào)：181204），經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定為正品北柴胡。

ACQUITYTM 超高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司）；AB SCIEX-5600 型質(zhì)譜儀（美國(guó)AB 公司）；ME204T 型分析天平（梅特勒-托利多精密儀器有限公司）；FDU1200 型冷凍干燥機(jī)（東京理化器械株式會(huì)社）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜、質(zhì)譜條件

色譜條件 流動(dòng)相1%甲酸水（A）-乙腈（B）洗脫程序見表1；體積流量0.3mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL。

表1 色譜梯度洗脫條件Tab.1 Chromatographic gradient elution conditions

質(zhì)譜條件 采用電噴霧式離子源，采用全掃描質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜正負(fù)離子分別經(jīng)行全掃描，掃描范圍是100～2000m/z；干燥氣體積流量8L·min-1，干燥氣溫度450℃，霧化氣體：N2。碰撞氣體：He。霧氣化壓70kPa。毛細(xì)管電壓：正離子模式4kV、負(fù)離子模式2kV，碎裂電壓200V。

1.2.2 供試品溶液的制備

柴胡溶液制備 稱取柴胡飲片10g，粉碎后用水煎煮3 次，每次1h，濃縮凍干，將凍干粉末2g 用乙醇溶解，離心5000r·min-1，得到柴胡供試品，并用0.45μm 微孔濾膜濾過，即得濾液，待測(cè)。

對(duì)照品溶液的制備 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯對(duì)照品各2.00mg，將各個(gè)樣品置于10mL 的容量瓶?jī)?nèi)加入一定量的乙醇超聲，溶解后加入乙醇定容到刻度線。進(jìn)樣前取對(duì)照品溶液用乙醇稀釋至10 倍，并用0.45μm 微孔濾膜濾過，得濾液，待測(cè)。

1.2.3 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立 借助CNKI 等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)的柴胡的文獻(xiàn)，全面搜集中藥柴胡所含的化合物的分子式、分子量、相關(guān)化學(xué)名稱等相關(guān)信息，建立信息數(shù)據(jù)庫(kù)。借助Chemspider 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，計(jì)算負(fù)離子模式如[M-H]-，以及正離子模式如[M+NH4]+、[M+H]+等多種離子形態(tài)下的質(zhì)荷比數(shù)值。1.2.4 分析的軟件應(yīng)用 將柴胡原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView2.2 軟件中，將總離子流圖提取出一級(jí)質(zhì)量數(shù)與其mol 文件所對(duì)應(yīng)的信息進(jìn)行的匹配，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品的碎片信息進(jìn)行了對(duì)比。質(zhì)量數(shù)誤差5ppm以內(nèi)、結(jié)構(gòu)匹配度達(dá)到80%以上，對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物鑒定[10-15]

利用UPLC-Q-TOF-MS 方法，采集正離子和負(fù)離子模式下的柴胡水煎液總離子流圖，見圖1。

圖1 柴胡水煎液離子流圖Fig.1 Ion flow diagram of Bupleurum decoction

通過對(duì)每個(gè)離子流峰分析，得出其質(zhì)譜裂解規(guī)律，參考相關(guān)文獻(xiàn)，以及數(shù)據(jù)庫(kù)，共鑒定出15 個(gè)化合物，結(jié)果見表2。

表2 化合物鑒定結(jié)果Tab.2 Compound identification results

圖2 柴胡皂苷a 離子流圖Fig.2 Saikosaponin a ion chromatogram

圖3 柴胡皂苷d 離子流圖Fig.3 Saikosaponin d ion chromatogram

2.2 裂解分析

柴胡皂苷a 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z 779，碎片離子m/z 617 脫去個(gè)六碳糖，m/z 473，脫去五碳糖。與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比后出峰時(shí)間相同。柴胡皂苷d 與柴胡皂苷a 相同，可鑒別出來[10]。柴胡皂苷a 見圖4～6。柴胡皂苷d 見圖7～9。

圖4 柴胡皂苷a 裂解過程Fig.4 Saikosaponin a cracking process

圖5 水煎液柴胡皂苷a 二級(jí)質(zhì)譜信息Fig.5 Decoction Saikosaponin a MS information

圖6 柴胡皂苷a 二級(jí)質(zhì)譜信息Fig.6 Saikosaponin a MS information

圖7 柴胡皂苷d 裂解過程Fig.7 Saikosaponin d lysis process

圖8 水煎液柴胡皂苷d 二級(jí)質(zhì)譜信息Fig.8 Decoction Saikosaponin d MS information

圖9 柴胡皂苷d 二級(jí)質(zhì)譜信息Fig.9 Saikosaponin d MS information

3 結(jié)論

應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)，能夠準(zhǔn)確快速的進(jìn)行分析，具有高靈敏度、高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，可以解決中藥化學(xué)成分多樣性與復(fù)雜性對(duì)研究帶來的困難，可以使中藥化學(xué)成分的分析周期縮短，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

柴胡中化學(xué)成分復(fù)雜，為得到分離度更好的色譜峰，對(duì)分析條件進(jìn)行優(yōu)化?？疾炝思状?0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水兩種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，乙腈-水的洗脫效果更優(yōu)，故流動(dòng)相采用乙腈和0.1%甲酸水。本研究利用UPLC-Q/ TOF-MS 技術(shù)分析了柴胡藥材的水煎液中的化學(xué)成分，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰的保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)碎片等信息，并結(jié)合裂解規(guī)律，與對(duì)照品在相同質(zhì)譜條件下進(jìn)行比對(duì)，從柴胡提取物中共鑒定出15 種化合物。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)柴胡的化學(xué)成分分析，為柴胡質(zhì)量控制研究提供了理論基礎(chǔ)。