葉子怡， 范曉靜， 卓 濤， 鄒華松， 戶 勛

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 福建福州 350002)

柑橘潰瘍病是嚴(yán)重的常發(fā)柑橘病害，主要危害葉、枝、果實(shí)，不僅會(huì)使柑橘樹(shù)落果，還會(huì)導(dǎo)致柑橘樹(shù)枯死(Bruningset al， 2010)。 目前，大多數(shù)種植區(qū)都是以化學(xué)防治為主，但是該防治方式使柑橘的食用安全風(fēng)險(xiǎn)增大，病原菌的抗藥性增強(qiáng)。 因此，使用植物內(nèi)生菌、殼聚糖等進(jìn)行生物防治成為了近幾年的研究熱點(diǎn)(張勇祥， 2022)。

傳統(tǒng)的松針保鮮法證明松針能有效控制柑橘果實(shí)的腐爛，尤其對(duì)柑橘青、綠霉病的防治效果顯著(楊書(shū)珍等，2016)。 松針精油的主要成分β-蒎烯，對(duì)意大利青霉、白色念珠菌、大腸桿菌等表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌活性(張美紅等，2018)。

本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中發(fā)現(xiàn)，β-蒎烯作為柑橘自身就能產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)柑橘潰瘍病菌 (Xanthomonas citrisubsp.citri，Xcc) 的hrpG啟動(dòng)子有誘導(dǎo)作用。hrp基因(hypersensitive and pathogenicity)是Xcc編碼蛋白以組成Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)為害柑橘的關(guān)鍵致病基因。 在為害植物的過(guò)程中，Xcc 的Ⅲ型分泌系統(tǒng)所形成的針狀結(jié)構(gòu)將效應(yīng)因子分泌到寄主細(xì)胞內(nèi)(孫思等， 2017)，導(dǎo)致病害發(fā)生。 β-蒎烯既可抑制Xcc 的生長(zhǎng)繁殖，又能誘導(dǎo)Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)。 這是否是細(xì)菌在與植物互相對(duì)抗過(guò)程中的一個(gè)進(jìn)化表現(xiàn)，本試驗(yàn)將進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用菌株為柑橘黃單胞菌柑橘亞種Xcc 29-1，菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

NB 培養(yǎng)基:5 g·L-1多聚蛋白胨、10 g·L-1蔗糖、2 g·L-1酵母提取物、3 g·L-1NaCl、6 g·L-1牛肉浸膏，去離子水配制，調(diào)pH 至7.0～7.2，另加瓊脂粉15 g·L-1為固體培養(yǎng)基。 121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 后于室溫儲(chǔ)存。

M63 培 養(yǎng) 基:100 mmol·L-1KH2PO4、 75 mmol·L-1KOH、 15 mmol·L-1(NH4)2SO4、1 mmol·L-1MgSO4、3.9 μmol·L-1FeSO4、22 mmol·L-1葡萄糖。 用 10 mol·L-1NaOH 調(diào)節(jié) pH 至7.0，加去離子水定容到1 L，分裝后121 ℃滅菌20 min。 加瓊脂粉15 g·L-1為固體培養(yǎng)基。

本試驗(yàn)所用壯觀霉素(spectinomycin，Spe)終濃度為 20 μg·mL-1。質(zhì)粒:pRG960，Sper抗性，本實(shí)驗(yàn)室保存。

接種試驗(yàn)所用植物為感病葡萄柚品種Duncan。

其他試劑:β-蒎烯(6，6-二甲基-2-亞甲基-二環(huán)[3.1.1]-庚烷)母液用乙醇配制成濃度為0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 μg·mL-1的 溶 液， 低 溫 避 光 保 存。 β-葡 萄 糖 苷 酸 酶(β-glucuronidase，GUS)的底物 5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷(X-gluc)使用濃度為 20 mg·mL-1。

1.2 不同濃度β-蒎烯對(duì)Xcc 29-1 體外生長(zhǎng)的影響

制作 OD600＝0.03 的 Xcc 29-1 野生型菌懸液，分別加入最終濃度為 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.0 μg·mL-1的 β-蒎烯，于 28 ℃搖床孵育，每 6 h 測(cè)一次 OD600值。 所有試驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)平行，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 不同濃度β-蒎烯對(duì)Xcc 29-1 體內(nèi)生長(zhǎng)和柑橘潰瘍病癥狀形成的影響

制作 OD600＝0.3 的 Xcc 29-1 野生型菌懸液，分別加入最終濃度為 0.0、0.1、0.2 μg·mL-1的β-蒎烯，混勻后，接種于葡萄柚葉片上。 取其中接種2、4 和6 d 的葉片，梯度稀釋組織混合液，涂抹平板，培養(yǎng)，計(jì)算單菌落數(shù)量。 同時(shí)，5 d 后觀察余下的葡萄柚葉片，查看潰瘍癥狀形成的快慢和嚴(yán)重程度。

1.4 篩選hrpG 啟動(dòng)子與GUS 報(bào)告基因融合表達(dá)的菌株

為了測(cè)試β-蒎烯對(duì)Xcc 29-1 致病基因hrpG的啟動(dòng)子表達(dá)的影響，本試驗(yàn)制作了hrpG啟動(dòng)子與GUS 報(bào)告基因融合表達(dá)的菌株。 以Xcc 29-1 菌株的基因組DNA 為模板，用引物擴(kuò)增hrpG基因啟動(dòng)子序列。 正反向引物序列為:5′-TCCTGCAGGATCATGCCGGTCTCTCT-3′和5′-TTCCCGGGTTAGGCGGCCTTCGCGTGT-3′。

PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PstⅠ-XmaⅠ雙酶切后回收的產(chǎn)物連接到pRG960 載體上，構(gòu)建的hrpG啟動(dòng)子-GUS 融合載體pRG960:PhrpG電轉(zhuǎn)進(jìn)入Xcc 29-1，在NB＋Spe 平板上篩選獲得菌株Xcc 29-1/pRG960:PhrpG。

1.5 hrpG 啟動(dòng)子活性檢測(cè)

為了測(cè)試報(bào)告系統(tǒng)，將Xcc 29-1/pRG960:PhrpG分別接種于已涂抹X-gluc 的NB 和M63固體培養(yǎng)基上，用Xcc 29-1 和Xcc 29-1/pRG960 做對(duì)照。

1.6 不同濃度β-蒎烯對(duì)hrpG 啟動(dòng)子的體外誘導(dǎo)

在 OD600＝0.3 的 Xcc 29-1/pRG960:PhrpG菌懸液中，分別加入最終濃度為 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 μg·mL-1的 β-蒎烯，于 28 ℃搖床孵育，6 h 后加入 20 μg·mL-1X-gluc，觀察顯色結(jié)果。

1.7 不同濃度β-蒎烯對(duì)hrp 基因的體外和體內(nèi)誘導(dǎo)

OD600＝0.3 的 Xcc 29-1 野生型菌懸液，分別加入最終濃度為 0.0、0.1、0.2 μg·mL-1的 β-蒎烯，于28 ℃搖床孵育，3 d 后收集菌液，提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄，熒光定量 PCR 檢測(cè)hrpG、hrpX、hrcV、hrpD6 基因的表達(dá)。

OD600＝0.3 的 Xcc 29-1 野生型菌懸液，分別加入最終濃度為 0.0、0.1、0.2 μg·mL-1的 β-蒎烯，混勻后，接種于葡萄柚葉片上，3 d 后收集葉片，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR 檢測(cè)hrpG、hrpX、hrcV和hrpD6 基因的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度β-蒎烯對(duì)Xcc 29-1 體外生長(zhǎng)的影響

如圖 1(a)所示，β-蒎烯濃度為 0.0 μg·mL-1時(shí)，Xcc 29-1 在 48 h 的 OD 值達(dá)到 3.0。 隨著β-蒎烯濃度的提高，當(dāng) β-蒎烯濃度為 0.2 μg·mL-1時(shí)，Xcc 29-1 的生長(zhǎng)速度明顯受到抑制。β-蒎烯最終濃度為 1.0 μg·mL-1時(shí)，Xcc 29-1 甚至不生長(zhǎng)。 48 h 后的 Xcc 29-1 的生長(zhǎng)情況如圖1(b)所示，從左往右，β-蒎烯濃度逐漸提高，試管內(nèi)培養(yǎng)基的渾濁程度逐漸下降。 β-蒎烯最終濃度為1.0 μg·mL-1的試管中培養(yǎng)基澄清，菌物幾乎不生長(zhǎng)。

圖1 液體培養(yǎng)基中不同濃度β-蒎烯對(duì)Xcc 29-1 生長(zhǎng)的影響Figure 1 Effect of different concentrations of β-pinene on the growth of Xcc 29-1 in NB liquid medium

2.2 不同濃度β-蒎烯對(duì)Xcc 29-1 體內(nèi)生長(zhǎng)和柑橘潰瘍病癥狀形成的影響

圖2(a)為平板計(jì)數(shù)單菌落結(jié)果，加入β-蒎烯后，單位面積含有的細(xì)菌數(shù)量減少。 圖2(b)為接種5 d 后的葡萄柚葉片，加入β-蒎烯的接種區(qū)域潰瘍癥狀較輕。 0.2 μg·mL-1β-蒎烯的接種部位，能觀察到部分壞死，這說(shuō)明，0.2 ug·mL-1的β-蒎烯能快速誘導(dǎo)植物的抗病反應(yīng)。 潰瘍表型與Xcc 29-1 在葡萄柚葉片組織中的復(fù)制一致。

圖2 植物體內(nèi)不同濃度β-蒎烯對(duì)Xcc 29-1 生長(zhǎng)的影響和潰瘍癥狀形成情況Figure 2 Effect of different concentrations of β-pinene on the growth of Xcc 29-1 and formation of canker symptom in leaves

2.3 hrpG 啟動(dòng)子與GUS 的融合基因在Xcc 29-1 中的表達(dá)

圖3 (a)為PCR 擴(kuò)增的hrpG啟動(dòng)子片段的凝膠電泳結(jié)果，圖3(b)為融合GUS 報(bào)告基因的菌株Xcc 29-1/pRG960:PhrpG在NA 和M63 固體培養(yǎng)基上的平板顯色結(jié)果，培養(yǎng)基中加入了 20 μg·mL-1X-gluc。 對(duì)照組的 Xcc 29-1 和 Xcc 29-1/pRG960 均無(wú)顯色表現(xiàn)，Xcc 29-1/pRG960:PhrpG在NA 和M63 固體培養(yǎng)基上均能顯色，M63 更深，表明啟動(dòng)子在貧瘠培養(yǎng)基上更活躍。

圖3 hrpG 啟動(dòng)子報(bào)道檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)建Figure 3 The construction of the hrpG promoter GUS fusion system

2.4 不同濃度β-蒎烯對(duì)hrpG 啟動(dòng)子的體外誘導(dǎo)

如圖4，Xcc 29-1 加入不同濃度β-蒎烯6 h 后，隨著濃度的提高，GUS 顯色情況越明顯，說(shuō)明高濃度的β-蒎烯能高水平誘導(dǎo)hrpG啟動(dòng)子表達(dá)。 0.1 和0.2 μg·mL-1濃度也可以誘導(dǎo)，但水平較低。

圖4 培養(yǎng)基中不同濃度β-蒎烯對(duì)hrpG 啟動(dòng)子的誘導(dǎo)Figure 4 The expression of the hrpG promoter in different concentrations of β-pinene in NB liquid medium

2.5 不同濃度β-蒎烯對(duì)hrp 基因的體外和體內(nèi)誘導(dǎo)

圖5(a)為體外試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照空白組，0.1 μg·mL-1β-蒎烯能誘導(dǎo)4 個(gè)代表性hrp基因的表達(dá)，其中hrcV的表達(dá)增強(qiáng)了 25 倍。 0.2 μg·mL-1β-蒎烯誘導(dǎo) 4 個(gè)hrp基因表達(dá)的增強(qiáng)都超過(guò)了4 倍。 圖5(b)為體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)混合β-蒎烯接種后，hrp基因的表達(dá)都呈增強(qiáng)趨勢(shì)。

圖5 不同濃度β-蒎烯對(duì)hrp 基因的誘導(dǎo)Figure 5 The hrp genes expression in different concentrations of β-pinene

3 結(jié)論與討論

β-蒎烯作為柑橘的次級(jí)代謝化合物，其合成調(diào)控機(jī)制尚不清楚，但是在柑橘不同品種的精油成分中占有相當(dāng)大的比例，對(duì)微生物具有直接的抑菌活性，推測(cè)可以抵御外來(lái)病原物的侵染(Tsaiet al，2017；Adokohet al，2019)。

植物合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)其與病原菌的互作有重要作用，其中包含相當(dāng)一部分的植保素物質(zhì)，對(duì)病原菌有直接的抑制效果，還有一部分次級(jí)代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)寄主植物自身的抗病信號(hào)通路，增強(qiáng)對(duì)病原物侵染的抗性(胡洪濤等，2004)。 次級(jí)代謝物抑制病原菌生長(zhǎng)的主要原因有:對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生性種子植物等具有直接的殺滅效果，成為這些病原生物的拮抗物質(zhì)；協(xié)助金屬離子運(yùn)輸；刺激菌物孢子的產(chǎn)生，影響胞子萌發(fā)，在逆境中使芽孢暫時(shí)休眠，暫緩生長(zhǎng)，并保護(hù)休眠中的孢子；維護(hù)生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境(Demainet al，2000；廖圣良等，2016；尚春雨，2017)。

柑橘潰瘍癥狀的形成需要 Xcc 中hrp基因的表達(dá)(Guoet al，2011；Songet al，2015)，而且這種表達(dá)需要寄主植物的誘導(dǎo)，即與柑橘植物互作后，hrp基因才能被高水平誘導(dǎo)表達(dá)，這與其它植物病原黃單胞菌的hrp基因表達(dá)一致(Alfanoet al，1997；楊軍等，2005)。

在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)β-蒎烯作為次級(jí)代謝產(chǎn)物是柑橘抑制Xcc、阻止病害發(fā)生的一個(gè)化合物，同時(shí)又可以被病原物Xcc 所利用，作為植物來(lái)源的一個(gè)信號(hào)分子，誘導(dǎo)hrp基因的表達(dá)。 這為更全面認(rèn)識(shí)β-蒎烯在柑橘與Xcc 互作中功能提供了很好的數(shù)據(jù)支撐。 同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)β-蒎烯對(duì)Xcc 的生長(zhǎng)的抑制需要達(dá)到一定的濃度閾值。 因此，可以推測(cè)，β-蒎烯合成的差異可能也是品種抗性水平變化的一個(gè)因素。