劉美紅，賀環(huán)宇，李艷霞，董 暢

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116001)

奴卡菌是一種革蘭染色陽性、弱抗酸染色陽性的絲狀細菌，廣泛存在于土壤中，目前，已發(fā)現(xiàn)100多個亞種，其中50多個亞種可對人類致病，以星形奴卡菌最為多見。在免疫缺陷人群及慢性氣道病患者中易發(fā)生機會性感染[1]，可累及肺部、皮膚、關(guān)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多個器官系統(tǒng)，以肺部感染最為多見，常引起致死性病變，病死率極高。日本學(xué)者進行的一項研究觀察了30例肺奴卡菌病患者的臨床結(jié)局，結(jié)果顯示，病死率達56.7%[2]。因此，快速、準確的病原學(xué)診斷和合理的抗生素方案對肺奴卡菌病患者的治療至關(guān)重要。然而，奴卡菌生長速度緩慢，傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)耗時較長，且常出現(xiàn)假陰性，給臨床診治帶來很大困難。近年來，宏基因組二代測序技術(shù)(mNGS)在感染性疾病診斷中的臨床應(yīng)用價值已得到公認，本院收治快速進展肺奴卡菌病患者1例，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

患者，男，63歲，農(nóng)民。以間斷發(fā)熱、大量膿痰半年，加重伴呼吸困難1周于2019年9月4日收入院?；颊呷朐呵敖肽攴磸?fù)發(fā)熱，以低熱為主，咳嗽，咳大量膿痰，最多可達200～300 mL/d，期間間斷應(yīng)用抗生素(具體不詳)及地塞米松治療，上述癥狀可緩解。1周前患者體溫突然升至38 ℃，并出現(xiàn)嚴重呼吸窘迫，床上活動、翻身等難以耐受，故來本院就診。近半年患者體重下降約10 kg，既往左肺下葉支氣管擴張病史30余年。入院查體：體溫37.3 ℃，脈搏130次/分，呼吸頻率34次/分，血壓90/55 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，血氧飽和度85%(未吸氧)。呼吸急促，口唇發(fā)紺，雙肺可聞及濕啰音。5 L/min吸氧時動脈血氣分析提示呼吸衰竭(pH 7.445，動脈血氧分壓79 mm Hg，動脈血二氧化碳分壓34.4 mm Hg)。外周血白細胞增多(白細胞35.3×109L-1，中性粒細胞95.7%，不成熟粒細胞2%)。C反應(yīng)蛋白381 mg/L，降鈣素原7.05 ng/mL，炎癥標志物檢測均明顯升高。生化檢測：清蛋白26.2 g/L，提示低蛋白血癥。淋巴細胞亞群檢測：CD4+淋巴細胞絕對計數(shù)161 μL-1，CD8+淋巴細胞絕對計數(shù)38 μL-1，提示患者免疫功能低下。入院時胸部CT檢查顯示雙肺散在結(jié)節(jié)、浸潤影，伴左下葉支氣管擴張。見圖1A～C。

留取血、痰標本培養(yǎng)后初始治療給予美洛西林鈉舒巴坦鈉、莫西沙星聯(lián)合伏立康唑經(jīng)驗性抗感染。然而觀察72 h后，患者病情未見明顯改善，體溫升至38.8 ℃，仍有大量膿痰，呼吸困難進一步加重，血氧飽和度降至77%。痰培養(yǎng)結(jié)果為白色念珠菌，考慮為口腔污染菌，多次進行血培養(yǎng)、痰結(jié)核菌、聚合酶鏈反應(yīng)檢查均為陰性。入院第5天復(fù)查胸部CT顯示雙肺病灶迅速滲出和實變，較前明顯進展。見圖1D～F。故升級抗生素方案為美羅培南、利奈唑胺聯(lián)合伏立康唑抗感染治療。同時，為進一步查找病原體完善纖維支氣管鏡檢查，鏡下見大量膿性痰液，保護性毛刷刷取痰液進行培養(yǎng)，留取支氣管肺泡灌洗液行mNGS檢測。收集5 mL肺泡灌洗液至無菌離心管中，并放置-20 ℃冰箱保存。干冰快遞至深圳華大基因科技有限公司進行宏基因組檢測。主要過程包括核苷酸提取、文庫構(gòu)建、測序和生物信息學(xué)分析[3]。取600 μL肺泡灌洗液加入玻璃珠和酶混合震蕩后按TIANamp Micro DNA Kit (DP316)試劑盒步驟提取DNA。提取后的DNA超聲破碎成小片段。使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫插入片段的大小為200～300 bp，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit質(zhì)控DNA文庫濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫通過滾環(huán)復(fù)制生成DNB納米球。將制備好的DNB納米球加載到測序芯片，通過BGISEQ-50測序儀進行測序[4]。測序數(shù)據(jù)下機后去除低質(zhì)量序列(長度小于35 bp)以獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)。通過BWA比對將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組(hg19)序列的數(shù)據(jù)去除[5]。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度序列后與華大病原體宏基因組數(shù)據(jù)庫(包括6 350種細菌、1 064種真菌、4 945種病毒、234種寄生蟲)進行比對。最后從完整的微生物列表中刪除可疑的背景微生物，再根據(jù)LANGELIER等[6]研究確定病原學(xué)診斷標準計算微生物相對豐度并依次排序。4 d后mNGS結(jié)果回報，測序下機數(shù)據(jù)一共得到25 849 540條序列，在去除人源序列之后獲得575 370條(2.23%)微生物序列，比對到細菌的序列數(shù)最多(28 969條)，細菌中比對到奴卡氏菌屬的序列比例(屬水平上奴卡氏菌的相對豐度)最高[66.03%(19 129/28 969)]。嚴格比對到膿腫奴卡氏菌屬的序列為7 284條，其基因組覆蓋率為8.75%。見圖2。未檢測到其他細菌、病毒、真菌和寄生蟲。故診斷為肺奴卡菌病，立即調(diào)整治療方案為復(fù)方新諾明、亞胺培南聯(lián)合利奈唑胺。同時，提醒實驗室延長培養(yǎng)時間，13 d后痰培養(yǎng)奴卡菌陽性，證實了mNGS檢測的結(jié)果。見圖3。然而，針對性調(diào)整抗生素方案后患者臨床癥狀并未出現(xiàn)明顯緩解，第22天復(fù)查胸部CT顯示左上葉結(jié)節(jié)進展為厚壁空洞，直徑約為23 mm，與之前的胸部CT比較，雙肺多發(fā)實變影沒有明顯吸收。見圖1G～I。在查閱了膿腫奴卡菌抗生素耐藥性的相關(guān)文獻后[7-8]，決定加用阿米卡星以覆蓋亞胺培南耐藥菌種。治療3周后患者好轉(zhuǎn)，出院繼續(xù)口服復(fù)方新諾明。出院2個月后復(fù)查胸部CT顯示空洞病灶已閉合，雙肺野浸潤影明顯吸收。見圖4。

2 討 論

奴卡菌在1888年首先由Edmund Nocad在被感染牛的肉芽腫病變中發(fā)現(xiàn)，1891年Epinger發(fā)現(xiàn)了首例人類奴卡菌病，累及肺、腦而致死[9]。肺奴卡菌病是一種罕見的肺部感染性疾病，好發(fā)于免疫缺陷宿主和慢性氣道病患者，發(fā)病率為0.39/10萬～0.55/10萬[10]；但隨著近年來器官移植技術(shù)的發(fā)展和免疫抑制劑應(yīng)用的增加，發(fā)病率呈上升趨勢，從1997-1998年的0.33/10萬增至2007-2008年的0.87/10萬[11]。肺奴卡菌病起病隱匿，呈慢性病程，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，最初常表現(xiàn)為發(fā)熱、咳大量膿痰；咳嗽、胸痛和厭食也經(jīng)常出現(xiàn)，有些患者甚至沒有癥狀，僅在胸部X線檢查時發(fā)現(xiàn)異常陰影，從而確診[2]。實驗室檢查常發(fā)現(xiàn)低蛋白血癥。影像學(xué)檢查常表現(xiàn)為孤立、散在的結(jié)節(jié)或腫塊，主要在胸膜下或肺門附近[12]。病原學(xué)診斷是確診肺奴卡菌病的“金標準”，但由于奴卡菌生長速度緩慢，傳統(tǒng)的病原學(xué)培養(yǎng)耗時較長，從診斷取樣開始到最終確診需3～35 d，中位13.6 d[13]，所以，經(jīng)常會延遲診治，甚至出現(xiàn)漏診?；谏鲜鲈?，肺奴卡菌病患者預(yù)后極差，約30%的患者需進入重癥監(jiān)護病房治療，1年病死率為31%[14]。還有研究將器官移植后奴卡菌感染與非奴卡菌感染患者的1年后病死率進行比較分析，奴卡菌感染的器官移植患者1年后病死率較未感染者高10倍[15]。因此，早期快速診斷對肺奴卡菌病患者至關(guān)重要。在肺奴卡菌病的治療方面，中國指南推薦首選復(fù)方新諾明[16]；但近年來磺胺類藥物的耐藥率有增加趨勢，單獨使用復(fù)方新諾明療效欠佳，可聯(lián)用利奈唑胺、阿米卡星等同樣高敏感性藥物[17]，療程一般為4～5個月。

mNGS是一種新興的分子生物學(xué)技術(shù)，采用非靶向測序方法直接從患者臨床樣本中檢測所有潛在病原體，在不明原因感染和免疫功能低下合并感染患者中的臨床應(yīng)用價值已得到證實[18-20]。與傳統(tǒng)的檢測方法比較，mNGS具有很大的優(yōu)勢，特別是在檢測罕見、生長緩慢或不易培養(yǎng)的病原體方面。有研究表明，mNGS有助于重癥肺炎的診斷，并可能降低重癥監(jiān)護病房患者的病死率[21]。本例患者mNGS檢測結(jié)果在4 d內(nèi)回報，而痰液培養(yǎng)分離出奴卡菌耗時13 d。對早期抗感染治療失敗、進展迅速的肺奴卡菌病重癥患者來說，在mNGS的幫助下進行快速、準確的病原學(xué)診斷，從而轉(zhuǎn)向靶向抗生素治療是挽救生命的關(guān)鍵。此外，mNGS對致病微生物的精準分類為評估抗生素耐藥性提供了重要信息。然而，mNGS的臨床應(yīng)用并非沒有挑戰(zhàn)，除高人源序列干擾導(dǎo)致靈敏度不足外，在mNGS檢測結(jié)果的判讀方面，如區(qū)分病原體定植和污染也存在爭議，目前為止還沒有統(tǒng)一權(quán)威的判讀標準。在實驗室檢測方面，多個參數(shù)需要考慮，如比對序列數(shù)、相對豐度、基因組覆蓋率、測序深度等。在臨床實踐中，臨床醫(yī)師需根據(jù)某些微生物的致病性、患者臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特點確定mNGS檢測到的微生物的意義。因此，mNGS提供的可操作信息復(fù)雜，限制了其臨床應(yīng)用。但mNGS在疑難雜癥、危重癥、免疫缺陷等特殊人群中仍具有成為病原體診斷準一線檢測手段的潛力，是一種非常有效的廣譜病原體篩查方法[22]。

總之，本院收治的1例快速進展肺奴卡菌病患者應(yīng)用mNGS在早期得到快速診斷，最終治愈出院。與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法比較，mNGS在發(fā)現(xiàn)罕見病原體、縮短診斷時間、改進抗生素方案和改善患者預(yù)后等方面均展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。