王雪梅 張俊蝶 李卓芹 馬明慧 汪慧云 姜秀娟

嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院（浙江嘉興 314001）

眾所周知，一氧化碳（CO）是一種有毒氣體。但研究表明，CO與NO類似，是生物體內(nèi)一種重要的氣體信使分子，能夠在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，如抗菌、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、舒張血管等[1-2]。但是，CO由于固有的毒性，過量使用會(huì)導(dǎo)致生物體中毒甚至死亡。因此，如何安全有效地使用這種生物分子就成為科學(xué)家們探索的重要課題。一氧化碳釋放分子（CORMs）是一種CO供體[3-5]，其攜帶的CO基團(tuán)在一定條件下可以解離并以CO的形式釋放出來，能夠發(fā)揮和內(nèi)源性CO相同的作用。

過渡金屬羰基化合物是目前研究最廣泛的CORMs[6-9]，其中的羰基基團(tuán)在一定條件下會(huì)解離，如在光照、酶誘導(dǎo)或取代作用下以CO的形式釋放出來。在這些誘導(dǎo)方式中，光誘導(dǎo)一氧化碳釋放分子（photoCORMs）的研究引起了科學(xué)家們的廣泛興趣[7,10-11]。光誘導(dǎo)時(shí)，只需要選擇合適的光源即可方便地調(diào)控CO釋放速率，而且不會(huì)引入其他物質(zhì)。但是，目前文獻(xiàn)報(bào)道的photoCORMs所采用的光源多為波長(zhǎng)較短、能量較高的紫外光或可見光[7,12-13]。這些波長(zhǎng)的光對(duì)皮膚的穿透力很弱，需要開發(fā)對(duì)皮膚穿透能力強(qiáng)的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的可見光或近紅外光誘導(dǎo)的photoCORMs。

錳在自然界中分布非常廣泛，而且是一種維持生物體基本功能的微量元素[14-15]，因此基于錳的CORMs在生物兼容性方面優(yōu)于其他金屬元素。此外，羰基錳化合物一般在光照作用下容易分解，可以作為光誘導(dǎo)的一氧化碳釋放分子。為了解決photo-CORMs所采用光源能量較高、波長(zhǎng)較短的問題，本研究希望增強(qiáng)錳羰基化合物的共軛性來改善其光化學(xué)性能。此外，為了更好地實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)對(duì)CORMs釋放CO的監(jiān)測(cè)，引入熒光配體來提高其發(fā)光性能。因此，利用5-氨基熒光素、2-氨基吡啶和五羰基溴化錳反應(yīng)合成了相應(yīng)的含希夫堿配體的錳羰基化合物。該化合物在黑暗中具有很好的穩(wěn)定性，但是對(duì)光非常敏感，因此進(jìn)一步研究了其在不同LED可見光（藍(lán)光、綠光或紅光）作用下的分解情況。結(jié)果表明，該化合物在上述可見光作用下能夠分解釋放CO，可以作為光誘導(dǎo)的CORMs，該CO釋放過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。該化合物分解釋放CO的速率可以通過選取不同光源來調(diào)節(jié)，具有很好的可控性，是一種具有很好應(yīng)用前景的photoCORMs。另外，該化合物在500～700 nm波段可以發(fā)射較強(qiáng)熒光，預(yù)期可以作為熒光標(biāo)記的CORMs，為研究細(xì)胞及生物體內(nèi)CORMs的分布及CO釋放提供可能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

五羰基溴化錳、5-氨基熒光素、2-吡啶甲醛、甲醇、二甲基亞砜（DMSO），分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

RCT基本型磁力加熱攪拌儀，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；400 MR核磁共振儀、Cary 640傅里葉變換紅外光譜儀、Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)，安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 錳羰基化合物[Mn(CO)3(L)Br]（1）的合成

將5-氨基熒光素（104 mg，0.3 mmol）置于50 mL圓底燒瓶中并加入5 mL甲醇溶解，在攪拌下加入2-吡啶甲醛（28μL，0.3 mmol）和五羰基溴化錳（74 mg，0.3 mmol），保持回流2 h后有大量紅色沉淀生成。

1.2.2 目標(biāo)化合物的表征

反應(yīng)液冷卻后抽濾得到紅色固體。目標(biāo)化合物產(chǎn)率為80%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%。

1.3 CO釋放的監(jiān)測(cè)

取化合物1（6.5 mg，0.01 mmol），加入2.0 mL DMSO溶解，配制成溶液；將不同光源（LED藍(lán)、綠和紅光，藍(lán)光波長(zhǎng)為470～475 nm、綠光波長(zhǎng)為492～577 nm、紅光波長(zhǎng)為622～770 nm）置于溶液上方13 cm處進(jìn)行照射，并從溶液中不定時(shí)取樣測(cè)試其紅外光譜變化情況。

1.4 熒光性能測(cè)試

配制化合物1的DMSO貯存溶液（0.01 mol/L），將其稀釋至3×10-5mol/L后進(jìn)行熒光光譜性能測(cè)試（激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm，狹縫寬度為10 nm）。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物1的合成

化合物1通過五羰基溴化錳、5-氨基熒光素和2-吡啶甲醛在甲醇中回流反應(yīng)2 h得到（見圖1）。該化合物在極性較大的有機(jī)溶劑（如二甲亞砜）中有很好的溶解性，在其他溶劑中較難溶解。此外，該化合物在黑暗中很穩(wěn)定，但是對(duì)光非常敏感，經(jīng)光照后即可分解。

圖1 化合物1的合成路線

2.2 化合物1在光誘導(dǎo)作用下分解釋放CO研究

由于化合物1對(duì)光不穩(wěn)定，預(yù)期可以作為光誘導(dǎo)的一氧化碳釋放劑。錳羰基化合物含有羰基基團(tuán)，因此可以通過液體紅外光譜觀察其羰基峰的變化來監(jiān)測(cè)化合物的分解?；衔?在2 026，1 936和1 916 cm-1處分別呈現(xiàn)3個(gè)典型的紅外羰基特征峰，在避光條件下，該特征峰基本不會(huì)發(fā)生變化；但是光照時(shí)，這些紅外峰會(huì)發(fā)生顯著變化。如圖2（a）所示，化合物1的紅外特征峰在LED藍(lán)光照射下會(huì)迅速減弱，并逐漸在1 873 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)新的紅外峰，而且在1 936和1 916 cm-1處雙峰的形狀也發(fā)生了變化，說明在藍(lán)光作用下化合物1會(huì)很快分解，并生成新的反應(yīng)中間體。此外，分別研究了該化合物在綠光和紅光作用下的分解情況，結(jié)果見圖2（b）和圖2（c）。類似的，化合物1的3個(gè)羰基特征峰在綠光和紅光照射下逐漸減弱，只是減弱速率較藍(lán)光小很多，紅光作用下降低最慢。與藍(lán)光下紅外光譜變化不同的是，綠光和紅光作用下僅僅是化合物1羰基特征峰的減弱，并沒有產(chǎn)生新的紅外峰，說明在這兩種光作用下化合物1發(fā)生分解，但僅是化合物的簡(jiǎn)單分解，并沒有產(chǎn)生新的中間體。上述結(jié)果表明藍(lán)光促進(jìn)化合物1分解的作用最顯著，綠光次之，而紅光的分解效果最弱。

圖2 化合物1在LED藍(lán)光（a）、綠光（b）和紅光（c）照射下的紅外光譜

2.3 化合物1光誘導(dǎo)分解動(dòng)力學(xué)研究

通過分析上述反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)一步研究了化合物1的分解速率與光源之間的關(guān)系，結(jié)果見圖3。如圖3所示，對(duì)不同可見光作用下化合物1的濃度自然對(duì)數(shù)（ln c）和時(shí)間（t）作圖可得直線，說明化合物1在上述可見光作用下的分解，即CO釋放過程，符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。因此，根據(jù)一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)可以計(jì)算出化合物1分解釋放CO的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（其中kobs為反應(yīng)速率常數(shù)，t1/2為反應(yīng)半衰期）。表1為光誘導(dǎo)化合物1分解的動(dòng)力學(xué)結(jié)果。從表1可以看出，在不同的光源下，化合物1的分解速率不同。藍(lán)光作用下，化合物1的分解最快，半衰期僅為2.9 min；綠光下分解較慢，其半衰期是藍(lán)光下的65倍；而紅光下分解最慢，其半衰期是藍(lán)光下的82倍。因此，化合物1光誘導(dǎo)分解釋放CO的速率取決于所用光源，其原因在于不同光源的波長(zhǎng)不同，能量差別也非常大。在上述3種光源中，紅光的波長(zhǎng)最長(zhǎng)，所提供的能量最小，其斷裂金屬與羰基間化學(xué)鍵的能力最弱；而藍(lán)光波長(zhǎng)最短，能量也最高，使金屬與羰基間化學(xué)鍵斷裂的能力最強(qiáng)；綠光波長(zhǎng)和能量均介于紅光與藍(lán)光之間，斷裂金屬羰基化學(xué)鍵的能力也居中。因此，本研究可以方便地通過選取不同光源來調(diào)控化合物1分解釋放CO的速率，該化合物可以作為具有應(yīng)用前景的photoCORMs。眾所周知，光動(dòng)力學(xué)治療具有創(chuàng)傷小、毒性低、選擇性和適用性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，臨床上光動(dòng)力學(xué)治療普通或惡性腫瘤一般采用630 nm的激光進(jìn)行體外或通過內(nèi)窺鏡進(jìn)行體內(nèi)照射，可以達(dá)到很好的治療效果。本研究中，化合物1在波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅光（622～770 nm）作用下可以較慢地分解釋放CO，預(yù)期可以作為具有很好應(yīng)用前景的光動(dòng)力學(xué)治療的photoCORMs藥物。

圖3 化合物1在不同LED光照作用下ln c隨時(shí)間的變化

表1 化合物1在不同LED光照下反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)結(jié)果

圖3 化合物1在DMSO中的熒光光譜（λex=460 nm）

2.4 化合物1的熒光光譜研究

作為一種藥物分子，CORMs在體內(nèi)的分布及其CO釋放對(duì)于充分理解并有效利用CO的生理和病理功能具有十分重要的意義。進(jìn)一步研究了化合物1的熒光發(fā)射光譜情況，結(jié)果見圖4。在460 nm波長(zhǎng)光激發(fā)下，化合物1在500～700 nm區(qū)域可以發(fā)射較強(qiáng)熒光，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm。因此，化合物1可以作為一種潛在的CORMs熒光標(biāo)記物，為研究CORMs在細(xì)胞及體內(nèi)的分布變遷及控制CO釋放提供可能。

3 結(jié)論

合成了基于熒光素衍生物配體的錳羰基化合物，該化合物在LED藍(lán)光、綠光或紅光照射下可分解并釋放CO，可作為光誘導(dǎo)的一氧化碳釋放分子。此外，該CO釋放過程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，即化合物的分解半衰期僅取決于其反應(yīng)速率常數(shù)，與其初始濃度無關(guān)?；衔?分解釋放CO的速率可以調(diào)控，只需選擇不同光源即可實(shí)現(xiàn)，具有方便易控的優(yōu)點(diǎn)。此外，該化合物還可以發(fā)射較強(qiáng)熒光，為實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)成像以及進(jìn)一步研究CORMs在體內(nèi)的分布及釋放提供可能，預(yù)期在醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。