陳 茜，岳 華，湯 承

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

犢牛腹瀉是由病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原微生物感染或管理不當(dāng)?shù)榷喾N因素造成的［1-2］，其中病毒感染是引起犢牛腹瀉的主要原因，牛A群輪狀病毒（BRVA）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）和牛冠狀病毒（BCoV）是引起犢牛腹瀉的常見病原［3-4］，牛諾如病毒（BNoV）、牛凸隆病毒（BToV）和牛紐布病毒（BNeV）等新發(fā)病原近年來也在我國陸續(xù)檢出。細(xì)菌感染是導(dǎo)致犢牛腹瀉的另一個(gè)常見因素，其中沙門氏菌（Salmonella）和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）是導(dǎo)致犢牛腹瀉的重要病原菌［5］。安氏隱孢子蟲（C.andersoni）作為牛場中常見的寄生蟲，可單獨(dú)感染致病，也可與細(xì)菌、病毒混合感染導(dǎo)致犢牛腹瀉［6］。

1 材料與方法

1.1 腹瀉樣本來源 2020年12月云南某奶牛場送檢了16份30日齡犢牛腹瀉糞便樣本，患畜臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁、水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水等。

1.2 主要試劑及儀器 TrizolTMReagent、Prime ScriptTM、2×Taq PCR Master Mix 等購于TaKaRa公司；DNA Marker II 購于寶生物工程（大連）股份有限公司；普通PCR 儀、核酸蛋白電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)VersaDov2000購自Bio-Rad公司。

1.3 陽性核酸 9 種病原（BRVA、BCoV、BVDV、BNeV、BNoV、BToV、Salmonella、ETEC、C.andersoni）的陽性核酸均由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 引物來源 參照文獻(xiàn)［9-17］中的檢測(cè)方法，對(duì)BRVA、BCoV、BVDV、BNeV、BNoV、BToV、Salmonella、ETEC、C.andersoni分別進(jìn)行檢測(cè)。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 RT-PCR引物信息

1.5 樣本處理及核酸提取 將16份犢牛腹瀉樣本用磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7.4）處理后，分別進(jìn)行DNA 和RNA 的提取。DNA 的提取采用酚-氯仿法。RNA 的提取步驟按照Trizol 試劑盒（RNAiso Plus）說明書進(jìn)行，并使用Prime ScriptTMRT 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃冰箱待用。

1.6 PCR 檢測(cè) 用BRVA、BCoV、BVDV、BNeV、BNoV、BToV、ETEC、Salmonella、C.andersoni的引物對(duì)16 份犢牛腹瀉糞便樣本的cDNA 及DNA 模板進(jìn)行PCR 檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，將陽性PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。將BRVA 陽性樣本用VP4 蛋白、VP7 蛋白的分型引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，以確定BRVA 的P 基因型和G基因型。

2 結(jié)果

2.1 病原檢測(cè)結(jié)果 在16 份犢牛腹瀉樣本中，BNeV、BRVA、BToV 和BNoV 的檢出率分別為62.5%、37.5%、18.75%和6.25%，其余病原均未檢出。其中BRVA與BNeV的混合感染率為31.25%，BToV 與BNeV 的混合感染率為6.25%，BRVA、BNeV、BNoV 的混合感染率為6.25%。PCR 檢測(cè)電泳圖見圖1。

2.2 BRVA分型檢測(cè)結(jié)果 6份BRVA陽性樣本中，有2 個(gè)樣本分別擴(kuò)增出了VP7 基因目的條帶（885 bp）與VP4 基因目的條帶（1 094 bp），經(jīng)RotaC 分型軟件分析，結(jié)果顯示為G8P［1］型BRVA。

圖1 A為BNeV電泳檢測(cè)結(jié)果；B為BRVA電泳檢測(cè)結(jié)果；C為BToV電泳檢測(cè)結(jié)果；D為BNoV電泳檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與分析

圖2 A和B分別為VP4和VP7分型電泳檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)對(duì)該腹瀉牛場的糞便樣本進(jìn)行了9種常見病原檢測(cè)，結(jié)果表明BRVA、BNoV、BNeV 和BToV 這四種病原的混合感染是該場犢牛發(fā)生腹瀉的重要原因，其中以BNeV和BRVA為主。

本研究對(duì)BNeV 的檢出率為62.5%，表明BNeV是導(dǎo)致該地區(qū)犢牛腹瀉的主要病原。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證明BNeV 在我國四川省、河南省、遼寧省、山東省和陜西省均有檢出，有可能是導(dǎo)致以上地區(qū)犢牛腹瀉的重要原因。目前尚無BNeV 的分離培養(yǎng)體系及有效疫苗預(yù)防，故應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際，健全飼養(yǎng)管理和消毒制度，對(duì)感染犢牛隔離后對(duì)癥治療。

本研究對(duì)BRVA 的檢出率為37.5%，表明BRVA仍是導(dǎo)致犢牛腹瀉的重要病原。疫苗接種是目前國外防控BRVA 最有效的措施，國內(nèi)還沒有商品化的BRVA 疫苗。需要注意的是，不同基因型BRVA 毒株的交叉保護(hù)力低，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)不同地區(qū)BRVA 的分子流行病學(xué)調(diào)查。本試驗(yàn)對(duì)該場陽性樣本的分型結(jié)果顯示為G8P［1］型BRVA。